Способ выделения -аспарагиназы Советский патент 1977 года по МПК C12D13/10 

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ L-АСПАРАГИНАЗЫ

щий L-аспарагиназу, обрабатьшают при рН 5,0-5,2 полиэтиленгликолем для последовательного осаждения балластных белков и фермента. Последующая О1шстка L-аспарагиназы состоит в перекристаллизации фер 1ента из буферного раствора при рН 5,0-6,0 в присутствии этанола, и затем при рН 5,0-5,5 в присутсгеии полиэтиленгликоля.

Предлагаемый способ позволяет получить препарат L-аспарагинэзы с удельной активностью 180-220 МЕ/мг белка при выходе 45-50%.

Пример 1. Клеточную биомассу с общим содержанием фермента7,0 млн. ME, полученную в результате культивирования микроорганизма Е. Со И,штамм Н-42, в ферментере емкостью 1500л, отделяют сепарированием, обрабатьтают двумя объемами ацетона в течение 30 мин при 0-2° С в аппарате, обеспечивающем интенсивное перемегливание суспензии. После отделения ацетона биомассу гомогенизируют в воде, взятой в двукратном количестве по отношению к весу биомассы. Экстракцию фермента ведут при интенсивном перемешивавши в течение 1 час, температуре 30° С и рН 6,8-7,0, поддерживаемом 1н.уксусной кислотой. Затем суспензию, охлажденную до 4-6°С (при этой температуре ведут все последуюшде операции), обрабатьшают воднь м раствором полимерного анионита, например поли-4-винил-N-бензилтриметиламмонийхлорида, и бесклеточный экстракт отделяют фильтрованием. Получают 5,2 млн. МБ ферментативной активности. К экстракту постепенно при яеремешивании добавляют ацетон в количестве 0,8 объема по отношению к обрабатываемом}- раствору и выпавший осадок отделяют сепарированием. Осадок, содержащий 4,7 млн. МБ L-аспарагиназы с удельной активностью 40 МЕ/мг белка, растворяют в 0,02 М ацетатном буфере, раствор осветляют и при рН 5,0 добавляют товарный раствор по.гшэтиленгликоля с мол. в. 1500 до 6%-ной концентрации его в растворе, удаляют вьшавшие балластные белки и концентрацию полиэтилснгликоля в растворе доводят до 9%. При этом вьшадает в осадок фракция, содержащая 85% L-аспарагиназной активности обрабатываемого раствора. Удельная активность возрастает до 165 МЕ/мг белка. Наблюдается кристаллизация фермента в форме мелких игольчатых кристаллов. Полученный осадок растворяют в аммонийно-ацетатном буфере (рН 5,0) и фермент осаждают, добавляя 30% (об/об) этанола. Кристаллический осадок содержит 80% общей ферментативной актавности. Последующую кристаллизацию проводят из того же буфера в присутствии 6% полиэтиленгликоля. Осадок растворяют в летучем буфере и лиофильно высушивают. Получают около

15 г препарата с удельной активностью 200 МЕ/мг белка.

П р и м е р 2. Биомассу E.Col i, штамм 980, обработанную ацетоном, подвергают водной экстракции, поддерживая рН7,0-7,2 в течение 1-1,5 час. После обработки суспензии полимерным анионитом В А-2 получают бесклеточный экстракт с удельной активностью 6,9 МЕ/мг белка и суммарным содержаьшем L-аспарагиназы 1,8 млн. ME. Раствор фермента далее обрабатывают равным объемом ацетона и отделяют выпавший осадок, который представляет собой сырец L-аспарагиназы с удельной активностью 30 МЕ/мг белка. Выход на данной стадии составляет 1,5 млн. ME L-аспарагиназной активности. Далее очистку ведут по примеру 1.

П р и м е р 3. Осадок фермента, полученный в результате фракционирования по примеру 1, растворяют в аммонийно-ацетатном буфере (рН 5,9), осветляют и фермент осаждают равным объемом этанола. После 2,5 час размешивания в осадок переходит 80% ферментативной активности. В этих условиях осаждения происходит более эффективное отделение пигментов, сопутствующих ферменту на предьщущих стадиях. Далее фермент переосаждают полиэтиленгликолем и доводят до лиофильно высушенного препарата по примеру 1. Формула изобретения

1.Способ выделения L-аспарагиназы, предусматривающий отделение биомассы от культуральной жидкости, обработку ацетоном для разрушения клеточной оболочки, экстракцию фермента из биомассы, осаждение фермента ацетоном, растворение полученного осадка, осаждение балластных белков из раствора полиэтиленгликолем, осаждение фермента из очищенного раствора полиэтиленгликолем, отличающий ся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода целевого продукта, осаждение фермента ацетоном осушествляют при соотношении ацетон: экстракт, равном 0,8-1,0:1,0 при рН 5,0-7,5, а осажде ше фермента из очищенного раствора полиэтиленгликолем осуществляют при рН 5,0-5,5, после чего фермент очищают переосаждением этанолом и полиэтиленгликолем.

2.Способ ПОП.1, отличающийся тем, что пересаждение фермента этанолом и полиэтиленгликолем осуществляют соответственно при рН 5,0-6,0 и рН 5,0-5,5.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент Великобритании № 1212136, класс СЗНЗ, 1970 (прототип).