Способ выделения -аспарагиназы Советский патент 1977 года по МПК C12D13/10 C07G7/02 

ной формы, а выход от исходной биома-ссы превышает 50%. Предлагаемый способ состоит в следующем. Биомассу микроорганизма обрабатывают изопропиловым спиртом в соотношении от 1 :4 до 1:8, растворитель отделяют, например, центрифугированием, фермент извлекают водой. Ввиду присутствия в растворителе изопропилового спирта значительная часть белков и других примесей остается в осадке. Для дальиейшей очистки экстракт подкисляют уксусной кислотой до рН 4,5-5,0, инкубируют при 50°С, добавив для стабилизации аспарагиновую кислоту в концентрации -0,005- 0,015 моль/л, и, отделив неактивный осадок, например, центрифугированием, концентрируют раствор в вакууме, после чего осаждают активную фракцию 1-2 объемами изопропилового спирта. Изопропиловый спирт, отделяемый носле обработки биомассы и из маточника после осаждения фермента, может быть регенерирован ректификацией и повторно использован в производстве. Пример. 15,6 кг бактериальной массы, полученной сепарированием культуральной жидкости Escherichia соИ на сепараторе с влажностью -85%, содерл ащей 810 ME аспарагиназы в 1 г сухого вещества (всего 1,8710 ME при удельной активности 1,2 МЕ/мг белка), загрузили в аппарат с мешалкой и при 10°С обработали 90 л изопропилового спирта. После отделения растворителя на суперцентрифуге получили 7,1 кг биомассы, содержащей 28,3% сухого вещества, 52,7% изопропилового спирта и 250 МЕ/г биомассы. Выход 95,0% от содержа.ния фермента в биомассе. Спиртовую биомассу, содержащую 28,3% сухого вещества, загрузили в аппарат с мешалкой и обработали 40 л дистиллированной воды при комнатной температуре. Жидкость отделили от осадка на шестикамерном сепараторе. Получили 39,7 л водно-спиртового экстракта, содержащего 40 ME фермента в мл. Удельная активность 7,0 МЕ/мг белка. Выход 85,0% от содержания фермента в биомассе. Экстракт загрузили в аппарат с мешалкой, добавили 52,8 г аспарагиновой кислоты, подкислили раствор 2 М раствором .уксусной кислоты до рН 4,7, нагрели до 50°С, вьщержали при этой температуре в течение 30 мин, охладили жидкость до 7°С и выдержали в течение 30 мин. Осадок отделили от жидкости с помощью суперцентрифуги, и довели рН раствора до 5,5-5,0 1 М раствором СаОН. Получили 38,8 л раствора, содержащего 37 МЕ/мл, удельная активность 23 МЕ/мг белка. Выход 76,5% от содержания фермента в биомассе. Ферментный раствор упарили на циркуляционной вакуум-выпартой установке цри остаточном давлении 25-30 мм рт. ст. и температуре в парах 25-30°С до 11,9 л. Концентрат загрузили в аппарат с мешалкой, добавили при 20°С 17,7 л изопропилового спирта, выпавший осадок отделили от жидкости на трубчатой суперцентрифуге и растворшш в 500 мл дистиллированной воды. Получили раствор аспарагиназы, содержащий 2300 МЕ/мл с удельной активностью ПО МЕ/мг белка. Выход 61,5% от содержания фермента в исходной биомассе. Формула изобретения Способ выделения L-аспарагиназы из биомассы микрооргаиизма, например Escherichia соИ, предусматривающий обработку биомассы органическим растворителем, экстракцию образующегося осадка водой, нодкисление экстракта, например уксусной кислотой, добавление к нему стабилизатора L-аспарагиназы, нагревание полученного раствора, удаление выпавшего осадка балластных белков и осаждение из раствора L-аспарагиназы, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты и выхода фермента, в качестве органического растворителя используют изопропиловый спирт и обработку биомассы ведут при соотношении компонентов от I : 4 до 1:8 при О-20°С, в качестве стабилизатора используют аспарагиновую кислоту в концентрации 0,005-0,015 моль/л, а после удаления осадка балластных белков раствор концентрируют в вакууме при 20-25°С и осаждение Lаспарагиназы осуществляют из концентрированного раствора добавлением безводного изопропилового спирта в количестве 1,0-2,0 объема на количество раствора.