Способ выделения лейцинаминопептидазы из aSpeRGILLUS oRYZae Советский патент 1982 года по МПК C12N9/48 

(.5) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕЙЦИНАМИНОПЕПТИДАЗЫ ИЗ ASPERGILLUS ORYZAE Изобретение относится к способам получения фермента лейцинаминопепти-; даэы (К.Л.З.. 11.1.), применяемой а молекулярной биологии для исследования аминокислотной последовательности в белковых молекулах, для получения аминокислот и в Гюдицине. Известны способы получения лейцин аминопептизадм из животного и растительного , например, из почки . свиньи 11 и из семян гороха . 2 . Однако эти способы основаны на ис пользовании дефицитного или пищевого сырья и не имеют промышленного значе ния. Гишболее близким по технической сущности является способ получения лейцинаминопептидазы с noMortbio микро организмов, в частности из плесневого гриба ЛврегпП иг. огуга1 3 Способ заключается в том, что неочищенный Лерментный раствор предвар тельно очи1чают групповой обработкой мберлитом, фракционируют сульфатом аммония, осаждают риванолом.Полученный осадок двухкратно экстрагируют 0,5 Н ацетатным бу()ером с рИ 5,0. В охла хденном экстракте осаждают белки, добавляя охлжеденный ацетон до б7%ной концентрации. Осадок растворяют в воде. Посяеду«ную ионообменную хроматогравмю на ДЭАЭ-целлюлозе проводят при линейном гриденте 0-0, М NaCt в 0,01 М йосфатном буфере с рН 7,0. После концентрирования на ультрафильтре лейцинаминопептидазную Фракцию наносят на колонку с сефадексом fi-100 и повторно гельфильтруют на колонке с сефадексом Г.-200 в 0,1 М ацетатном буфере с рМ 6,5. Потом проводят хроматографию на диэтиламиноэтил-сефадексе А-50 с фосфатным буфером (рН 7,0) при линейном градиенте 0-0, И NaC. Очистку завершают повторной гельфильтрацией на сефадексе 0-200 в М ацетатном буЛере с рИ 6,5. Полученный препарат замораживают до . 0(Ячая активность лейцинаминопепти дазы (в экстракте - 2090 ед., в полученном препарате - 262 ед.) - 13%. Удельная активность лейцинаминопептидазы в экстракте - 0,181 ед./мг белка, в полученном препарате ,5 ед,/мг белка (субстрат трипептид Лей-Гли-Гли). Вычисленная степень очистки - 25. Наряду с обеспечением высокой удельной активности известный способ имеет недостатки - сравнительно низкий выход по общей активности, вызван ,ный длительным и многоступенчатым Ьроцессом выделения, в котором возниК кают потери, и недостаточно высокую степень очистки. Цель изобретения - noiwujeHHe выхода и степени очистки, упрощение процесса выделения. Поставленная цель достигается способом получения лейцинаминопептидаэы из Asperglllus oryzae,включающим экст ракцию фермента буфером, осаждение его органиче,ским растворителем с последующей хроматографией на диэтиламиноэтилцелльолозе с элюцией буфером, содержащим Had, причем в качестве органического растворителя при осажде нии используют этанол при концентрации С)0-б7, хроматографию на ДЭЛЗ-цел люлозе проводят дважды, при этом сорб цию фермента проводят в статических условиях при объемном соотношении йер мент:сорбент ,5), элюцию фермента осуществляют в динамических условиях ступенчатым градиентом NaCI от 0,2 до 0,5 М в буфере, а между хро матографическими стадиями ферментсодержащий раствор подвергают термообработке при 60-62 С в течение 1012 мин. Обычно используют 0,005 М веро-. иальный бусЬер с рН 7,9-8,0. Этим достигается повышение качества сорбции фермента на ионообменной целлюлозе, которую осуществляют смешиванием ферментного раствора с сорбентом в статических условиях. Проведением десорбции Фермента а динамических условиях при ступенчатом градиенте достигается четкость разделения белков. Отличия в условиях сорбции и десорбции сокращают время прове дения стадий ионообменной хроматографии и рехроматограАии, Увеличение 97 7 степени очистки на этих стадиях пот зволяет отказаться от гель(ильтрации на сефадексе и упростить процесс. Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Амилоризин П 10 X экстрагируют 3 ч 0,005 М верональным буфером с рН §i1 при комнатной температуре. Центрифугируют 25-35 мин при 5500-6000 об/ /мин. Центрифугат охлаждают и добавляют охлажденный до этиловый спирт до конечной концентрации 60-6. Через 20 мин -осадок отделяют центрифугиров.анием, которое осуществляют 20-.i; мин при 5500-бПОО об/мин и , и растворяют в двойном объеме 0,005 М веронального буфера с рН 7,9 8,1. Нерастворенный осадок отделяют центрифугированием при тех же условиях. Полученный центрифугат смешивают с уравновешенной буфером ДЭЛЭ-целлюлоаой в объемных соотношениях 1(1|3-1, и заполняют колонку. НеЬорбированные белки и лейцинаминопептидазнонеактивные белки отмывают 0,2 М раствором NaCI в 0,005 М веррнальном буфере с рН 7,98,1, Активную фракцию десорбируют 0,5 М раствором NaCI в том же буфере, диализируют и нагревают до 60-62 С, выдерживают при этой температуре 10-12 мин, быстро охлаждают до O-t С, смешивают с уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлозой в объемных соотношениях 1:(1,) и заполняют в колонку. Отмывание колонки и десорбцию фермента проводят как и первую хроматографию. Полученный препарат концентрируют с сухим сефадексом R-75. Выход по активности - 25% (активность в экстракте - 8,68 ед., в полученном препарате - 2,17 ед.). Степень очистки - 38 (удельная активность экстракта - 0,00815, полученного препарата - 0,31 ед/мг белка по субстрату Лей-И-нитроанилид). Пример 1.50г амилоризина П 10 X экстрагируют в 250 мл 0,005 М веронапьном буфере с рН 7.,1 в течение 3 ч при комнатной температуре. Центрифугируют мин при 5ii56,0 тыс.об/мин. Экстракт (215 мл) охлаждают до и добавляют 502 мл 96%-ного этилового спирта, охлажденного до , до конечной концентрации б77.| Через 20 мин осадок отделяют центрм фугированием при 5,5-6,0 тыс.об/мин при(-2) -i.)°C и растворяют в 100 мл 0,ПП5 М веронального буфера с рН 7,9 8,1. Нерастворимый осадок отделяют центрифугированием при тех же условиях. Полученные 135 мл центриЛугата сме шивают а течение часа с 175 мл уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлозой (в объемных соотношениях 1:1,3) и заполняот в хроматографическую колонку. Несорбированные и балластные белки отмывают двумя литрами 0,2 М раствора НаС1 в 0,005 И верональном буфере с рИ 7,9-8,1. Активную фракцию десорбируют, пропуская через колонку 1 л 0,5 М раствора NaCI в том же буфере. Первые 20 мл элюата выбрасывают (не имеют лейцинаминопептидазной активности), следующие 320 мл, содержащие максимально активный фермент, собирают и диализируют против 5 л 0,0005 М веронального буфера с рН 7.9 8,1 в течение ч. Во время диализа буферныйраствор меняют k раза Лиализированный раствор нагревают до 60-62 С и выдерживают при этой тем пературе in мин, потом быстро охлаждают до . Инактивированные протеиназы отделяют с помощью рехроматографин на ионообменной целлюлозе. Диализированный ферментный раствор смешивают в тф чение часа с уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлюлозой в объемных соотношениях 1:1,3 и заполняют в хроматографическую колонку. Несорбированые белки отмывают rtoyfw литрами 0,2 М раствора NaCI в 0,П05 М верональном буфере с рН 7,9-8,1. Активную фракцию десорбируют одним литром 0,5 М раство ра №С1 в том же буфере. Первые 20 мл элюата выбрасывают (не имеют лейцинаминопептидазной активности), следующие 320 мл, содержаи(ие максимально активный фермент, собирают и диализируют против 5 я 0,0005 М веронапьн го буфера с рН 7,9-8,1 в течение 2| ч. |Во время диализа буферный раствор меняют k раза. с целью концентрирования в 350 мл диализированного ферментного раствора помеи(ают целлофановый мешочек с (О г сухого сефадекса G-75. Через 2 ч к 5 fvi концентрированного ферментного раствора прибавляют 2,36 г сухого суль(Ьата аммония (до 39 от 0,7 насыщения) и 0,0012 хлористого магния. Общий выход по активности полученного препарата - 25% (активность экстракта - 8,84 ед., полученного препарата -.2,21 ед.). Степень очистки 32 (удельная активность экстракта 0,0079, полученного препарата 0,25 ед./мг белка по субстрату Лей-w -нитроанилид). Пример 2. 50 г амилоризина п 10 X экстрагируют в 250 мл 0,005 М верональном буфере с рН ,1 а течение 3 ч при комнатной температуре, Центрифугируют, осаждают белки спиртом, центрифугируют, растворяют осадок и вновь центри ;угируют, как в примере 1. Полученные 130 мл центриЛугата смешивают в течение часа с 195 мл уравновешенной буфером ДЭАЭ-целлплозой ( в объемных соотношениях 1:1,5) и заполнямт хроматографическую колонку. Heсорбированные и балластные белки отмывапт двумя литрами 0,2 М раствора МаС1 в 0,005 М верональном буфере с рН 7i9-8,1. Активную ферментную фракцию десорбиругУг, пропуская через колонку 1 л 0,( Н раствора NaCl в том же буфере. Первые 30 мл элюата выбрасывают (не имеют лейцинаминопептидазной активности , следую1чие мл. содержа1(ие максимально активный фермент, собирают. Диализ и тепловую обра(отку проводят аналогично первому примеру. При рехроматографии диализированный (рментный раствор смешивают в течение часа с уравновешенной буфером ДЗАЭ-целлюлозой ( в объемных соотно- шениях 1:1,5) и заполняют хроматографическую колонку. Несорбированные и балластные белки отмывают двумя литрами 0,2 М раствора НаС1 в 0,005 М верональном буфере с рН 7,9-8,1. Активную фракцию десорбируют одним литром О, М раствором NaCI в том же буфере. Первые 30 лл элюата выбрасывают (не имеют лейцинаминопептидазной активности), следующие 330 мл, содержащие максимально активный фермент, собирают. Диализ и концентрирование конечного продукта проводят аналогично первому примеру. Общий выход по активности полученного продукта - 25 (активность экстракта - 8,91 ед., полученного препарата - 2,23 ед.). Степень очистки - 3 (удельная активность экстракта 0,0093, полученного препарата 0,30 ед./мг белка по субстрату Лей-М-нитроанилид). Пример 3. Экстракцию и осаждение белков этанолом проводят аналогично первому примеру. При ионообменной хроматографии 130 мл ферментного раствора смешивают в течение часа с 18П мл уравновешенной 6y(tiepoM ДЭАЭцеллплозой (в объемных соотношениях i 1:1,t) и заполняют хромато графи ческую колонку. Несорбированные и балластные белки отмывают двумя литрами 0,3 М раствора NaCI в 0,005 М аеро нальном буфере с рН 7.9-8,. Ферментную фракцию двсорОируют, пропуская через колонку 1 л 0,f И раствора NaCI в том же буфере. Первые 30 мп элюата выбрасывают (не имеют лей(4инаминопептидазной активности), следующие 330 мл элюата, содержащие максимально активный фермент, собир«чют. Диализ и термоинактиаацию балластных белков проводят аналогично первому примеру. При рехроматограОии диализированный ферментный раствор смешивают в течение часа с уравновешенной буфером ДЭЛЭ-целлюлозой (в объемных соотношениях 1:1,), заполняют колонку, от мывают 0,3 М раствором НаС1 в 0,005 верональном буфере с рН 7, и де сорбируют О, М раствором НаС1 в том же буфере. Собирают 330 мл (с 31-го по мп) элюата, содержащих мак симально активный (Ьермент. Конечный продукт получают после диализа и кон центрирования . Общий выход по активности конечного - 2S% (активность экст ракта - 8,77 ед., полученного препарата - 2,79 ед.). Степень очистки 38 (удельная активность экстракта 0,00815, полученного препарата 0,31 ед./мг белка по субстрату Лейrh-нитроанилид). Определение активности фермента. За единицу активности лейцина лино пептидазы принимают такое количество фермента, которое гидролизует 1,0 мкмоль лейцин-И-нитроанилида в минуту при и рИ 8,5с Удельную активность лейцинаминопептидазц, вычисляют по формуле ,5 ед./мг белка. 3,9t-0,1. X где 3«5 реакционной смеси в кювете, см коэффициент экстинкции . , 1 мкмоль И-нитроанилина в условиях опыта; время инкубации Фермента с субстратом; объем раствора препарата, взятый на анализ, концентрация белка в исходной растворе, мг/см (определяется по Лоури. Активность лейцинаминопептидазы определена на субстрате Лей-И-нитроанилид отечественного производства. Технико-экономический эффект изобретения заключается в обеспечении производства фермента лейцинаминопептидазы, используемого в молекулярной биологии и медицине из дешевого кмкробиального сырья; повышение общего вихода по активности, который по известному способу составляет 13, а по предлагаетму - 25t. Кроме того, степень очистки увеличивается с 25 (по известному способу).до ЗВ (по предлагаемому). В процессе выделения исключаются также стадии гельфильтрации на сефадексе G-tOO и сейадексе 0-200. Формула изобретения 1.Способ выдел1ения лейцинаминопептидазы из AspernHlus oryzae путем экстракции фермента буфером, осах дения его органическим растворителем с последующей хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе с элюцией бyфepo f, содержащим NaCI, отличающийс л тем, что, с целью повышения выхода, по активности и степени очистки фермента, а также упрощения процесса, в качестве органического растворителя при осаждении используют этанол при концентрации 60-б7, хроматографию на диэтиламиноэтилцеллюлозе проводят дважды, причем сорбцию фермента проводят в статических условиях при объемном соотношении фермент : сорбент 1:С1,3-1.5)J элюцию фермента осуществляют в динамических условиях ступенчатым градиентом (1аС1 от 0,2 до 0,5 М в буфере, а между хроматографическмми стадиями ферментсодержащий раствор подвергают термообработке при 60-б2с в течение 1012 мин. 2.Способ поп.1,отличаю|Щ и и с я тем, что используют |0,005 М верональный буфер с pfl Т.,

Источники информации,2. F.Ueman Т,(. Arx nopept1dase of

принятые во внимание при экспертизе pea. niochon. J., 197i, Vol. 1tl,

1. Spacknan П.И., Snith E.L., 3. Hakadnl Т., Hasuno S,, Iguchf Ч. Prown D.U. Leuclne anfnopeptldase IV. j Purification of leuctne anonopepttdeOsolatlon and properties of the engy- se II frori Asp, oryzoe. Atyr. Blol. jme from swine RMnftv. J. Rlol. Chen., Chen, ,1973, Vol. 37, Mr, ii, p. 76719$5, voK 212, Nr. 1, p. 255.; 77.

Nr. 1, p. 113-1t8,