Способ выделения ферментного препарата глутаминазы-аспара-гиназы Советский патент 1982 года по МПК A61K38/50 C12N9/82 

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ГЛУТАМИНАЗЫ-АСПАРАГИНАЗЫ

I . - .1

Изобретение относится к микробиологическим способам получения ферментов, в частности к способу выделения ферментного препарата глутаминазы-аспаратиназы (КФ 3.5.1.38), и может найти применение в медицине.

Перед медицинской наукой и современной онкологией поставлеай задача поиска новых лечебных препаратов, обладающих избирательной и высокой противоопухолевой активностью.

Известно, что фермент глутаминаза-аспарагиназа подавляет рост опухолей, устойчивь1х к действию .L-аспарагиназ.

Известен способ выделения ферментного препарата глутаминазы-аспаратиназы из биомассы Pseudomonas aurantiaca ИБФМ В-14 1. Он предусматривает отделение биомассы от культуральной жидкости и разрушение ее ультразвуком, экстракцию фермента буферным раствором с рН 7,8, удаление нуклеиновых кислот введением в реакционную смесь хлористого марганца. После того, как удалены нуклеиновые кислоты, удаляют балластные белки нагреванием смеси при 55-60° С в течение 5 мин.

Дальнейшая обработка полученного препарата заключается в известных приемах. Осадок балластных белков отделяют, а полученный супернатант концентрируют

и используют для дальнейшей очистки известными методами.

Недостатками известного способа являются: невысокий выход препарата (после 5 стадии отделения балластных белков - 64-75%), а также относительная сложность его воспроизведения, связанная с проведением нагревания в течение очень ограниченного времени, что затрудняет

to промышленную реализацию данного способа.

Кроме того, недостатком способа является продолжительность операции удаления нуклеиновых кислот при введении МпСЬ

15 (более 40 ч).

Целью изобретения является упрощение способа выделения, ускорение процесса и повышение выхода целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, мто

20 в известном способе выделения ферментното препарата глутаминазы-аспарагиназы в качестве продуцента используют штамм Pseudomonas aurantiaca ВКМ-548, отделенную от культуральной жидкости биомассу

25 перед, экстракцией обрабатывают ацетоном, . экстракцию проводят буферным раствором при рН 6,9-7,0, для удаления нуклеиновых кислот используют протаминсульфат, а для удаления балластных белков нагре30 вание проводят при 50-54° С в течение

15-30 мин в присутствии стабилизатора - 0,03-0,04 М L-глутамата натрия.

Согласно изобретению, оийсывается способ выделения ферментного препарата глутаминазы-аспарагиназы из биомассы Pseudomonas aurantiaca ВКМ-548, включающий отделение биомассы от культуральной жидкости, обработку биомассы ацетоном, экстракцию фермента буферным раствором при рН 6,9-7,0, удаление нуклеиновыхкислот с помощью прЬтаминсульфата и удаление балластных белков нагреванием реакционной смеси при 50- 54° С в течение 15-30 мин в присутствии стабилизатора - 0,03-0,04 М L глyтaмaта натрия.

Описываемый способ обеспечивает значительное повышение выхода по сравнению с известным способом (94% - на стадии отделения балластных белков).

Замена хлористого марганца протаминсульфатом для удаления нуклеиновых кислот позволяет значительно ускорить процесс за счет сокращения стадии удаления нуклеиновых кислот с 40 до 1 ч.

Кроме того, описьшаемый способ дает возможность, несколько увеличив время нагревания раствора, упростить промь1шленную реализацию процесса выделения.

Способ выделения ферментного препарата глутаминазы-аспарагиназы заключается в следующем.

Биомассу, полученную в результате культивирования микроорганизма Pseudomonas aurantiaca ВКМ-548 на среде, содержащей глутамат и .минеральные соли, при 30 С обрабатывают ацетоном. ФерйёнгЭкспариругот из ацетонового порошка микробной массы 0,05 М калийфосфатным буфером рН 6,9-7,0 и для удаления нуклеиновых кислот в суспензию вводят Протаминсульфат. Смесь выдерживают в течение 1ч и выпавший осадок удаляют, например, центрифугированием или фильтрованием. К супернатанту, представляющему собой раствор глутамнназы-аспарагйназы с примесями, добавляют глутамат Na и нагревают раствор в течение мин при температуре 50-54° С. Выпавший осадок денатурированных балластных, белков удаляют центрифугированием. Супернатант концентрируют. Полученный целевой продукт используют для дальнейшей о чистки. . Пример 1. Культуру Pseudonionas aurantiaca ВКМ-548 выращивают в ферменере емкостью 100 л на среде с 0,5% глуамата Na с добавлением солей в течение 18-20 ч с аэрацией и перемешиванием при Н 7,2-7,4 и температуре 29± 1° С. Биомасу оВДёл яют сепарированием, обрабатыват аТи;егЬНом в течени е 5 мин при 0-4° С аппарате, обеспечивающем HHTeHCHBHioe ерёмёщивание суспензии, фильтруют и выушивают. Получ;ают 50 г сухого ацетоноогб порошка, содержаш,его глутаминазуаспарагиназу. Ацетоновый порошок суспендируют в 800 мл 0,05 М калийфосфатного буфера рН 7,0 и перемешивают в течение 2 ч при 0-4° С. К полученному экстракту добавляют 1,5 Ф протаминсульфата, растворенного в 100 нл того же буфера. После перемешивания в течение 1 ч образовавшийся осадок удаляют центрифугированием. Супернатант (650 мл) 3airpy10 жают в колбу с мешалкой, добавляют 4,4 г 1,-;глутамата натрия, нагревают до ,50° С, выдерживают при этой температуре в течение 15 мин, охлаждают до 4° С и выдерживают в течение 30 мин. Выпавший осадок отделяют центрифугированием и отбрасывают. Супернатант (600 мл) концентрируют ультрафильтрацией до 50 мл. Выход фёрйеНтного препарата глутаминазы-аспаратиназы 94% от содержания фермента в

0 экстракте.

Пример 2. Биомассу и ацетоновый порощок получают вышеуказанным способом. Фермент экстрагируют из ацетонового порощка биомассы 0,05 М калийфосфатным

5 буфером рН 6,9 в течение 2 ч при О-4° С. К полученному экстракту добавляют при перемешивании 1,5 г протаминсульфата. После перемешивания в течение 1 ч суспензию центрифугируют и осадок удаляют.

0 К 650 мл супернатанта добавляют 3,3 г 1,-,глутамата Na и нагревают раствор до 54° С, выдерживают его при этой температуре в течение 30 мин. Суспензию охлаждают до 4° С, выдё рживают в течение

30 мин и центрифугируют. Супернатант (590 мл) концентрируют ультрафильтрацией до 50 мл. Выход ферментного препарата глутаминазы-аспарагиназы 93% от содержания фермента в экстракте.

0 Активность фермента определяют по количеству аммиака, освобождающегося при ферментативном гндролизе L-глутамина или L-аспарагина и определяемого методом прямой несслеризации. За единицу

ферментативной активности глутаминазыйспарагиназы принимают такое количество фермента, которое гидролизует 1 мк/ моль субстрата за I мин при 37° С. Концентрацию белка в растворе измеряют по

0 методу Лоури.

В табл. I приведены полученные результаты, характеризующие влияние рН - экстрагирующего буфера на .глутаминаз нуго активность клеточных экстрактов.

- Т а б л и ц а 1

Способ выделенияглутаминазы-аспарагиназы. Стадия экстракции.

Способ выделения глутаминазы-аспарагиназы. Стадия удаления нуклеиновых кислот.

Таблица 2

Способ выделения глутаминазы-аспарагиназы.

Таблица 3 Стадия нагревания.