Способ иммобилизации ферментов Советский патент 1977 года по МПК A61K38/43 

Изобретение относится к способу получения иммобилизованных ферментов, которые находят широкое применение в тонком органическом синтезе, медицине, пищевой проьлышленности. Известны способы иммобилизации фермен тов на носителях, заключающиеся в механическом включении ферментов в полимерные гели { Известен также способ ковалентного связывания фермента с предварительной актива-; цкей носителя посредством обработки последнего цкангалогенидами в шелочной среде .2. Однако этот способ применим только для активации носителей полисахаридной природы,- а используемые дл активации соединения 5ШЛЯЮТСЯ отравляющими веществами. Недостаток известных способов - химичес кая инертность многих полимерных материалов, препятствующая связыванию, а также быстрое Бымьшание фермента в том случае, когда он находится в геле и химически с ни не связан, По предлагаемому способу фермент предварительно ацилируют хлорангидридом ненасыщенной кислоты. Процесс иммобилизации проводят путем активации фермента ацилированием хлорапгидридом ненасыщенной кислоты и последующей совместной полимеризации ацилнрованного фермента с ненасьпденным полимеризуюшимся мономером или с ненасьпденным полимеризуюшимся мономером и сщиваюшим агентом. Стадию аиклирования проводят при рН 6,0-9,0, предпочтительно 7,0-8,0, при температуре обычно О-40 и при мольном соотношении фермент/хлорангидрид ненасыщенной кислоты I.IO-IOOO. Реакцию сополимеризации ацилированного фермента с ненасыщенными мономерами проводят при О-бОХ под действием инициаторов радикального типа. В качестве хлоракгидрида ненасьцден:ной кислоты используют хлорангидриды акриловой, метакриловой и других мононенасышенных кислот, в качестве мономера применяют акряламид, метакриламид, N -винил- пирролкдон и т.п., в качестве сшивающего агента N, -метиленбнсакраламнд, диэфиры акриловой и N-ieTaKptOTOBpH кислот с двухатомными спиртами, а в качестве нницяато ров полимеризаяаи - рибофяавин, перекись бензоила и др, П р и м е р 1. Аяияирование трипсина проводят при 0 путем добавления к раствору 50 мг трипсина в ,$0 мл бикарбонатного буфера при рН 8,0, 0,05 мл хлорангидрида акрЕшовой хислоты. После добавленй52 всего количества хлорангидрйяа раствор перемешивают- 15 мин. Затем к ацшшрованному трипсину добавляют 50 мг акриламида к сополимернзадяю проводят в вакууме при 200С, используй в качестве жшцкатора полкмерйзации ри.бо.флавик, хонлектрадкя которо го 10 мг/л. Продукты сополимеркзадаи разделяют гель-.рнльтрацкей ка Сефадексе Q -50 используя колоьЕку 1,2x60 см Злюиик paci-воров проводят 0,01 М трис. ацетатным бу4-йром при рН 8,5. Продукты сополимерЕзаНИИ после разделения идентифицируют сдек-трофотометрическк, гравиметрически после осаждения ацетоном при С-)20°С и путем опрю деленяя протеолитической активности в кагк- дои фракции. Сополимер ацилированного трипсина с акркламидэм выходит их хроматогра- фичоской колонки раньще других компонентов Г1ол л18ризую1дейся системы, причем вьцсод сополимера увеличивается с увеличением вре-о ленн сополимеризации. Сополимер ацилирован-иого трипсина с акриламидом является линейным сополимером, представляет собой твердое вещество, растворимое в воде. П р и м е р 2. Иммобилизацию трипсина ,35 проводят по примеру 1. Количестве добавляемого к раствору 50 мг адилированного трипсина в 5О мл бикарбонатного буфера при рН 8,0 al fJилaмидa равно 10О мг. П р я м е р 3. Иммобилизацию трипсина 40 проводит по примеру 1. В качестве сомокомероз испо..т,т смесь 95 мг акрнламида я 5 мг Ыз --оасметиленакриламида. : П Р н М е р 4. Иммобилизацию -х.к- мотрнпснна проводят по примеру 1. Фермент КЗ геля не вь& ьшается. П р и м е р 5.. Иммобнлизадию трипсина проводят по примеру 1. В качестве сомоно мера Еспольэукзт N -Бкнклпирролидон, а в качестве якшшатора полимеризации N,/,,Л/ -те-граметалзтадекдкамин совместно с персульфатом аммоная. Реакцию сополямери- заяйи проводах прк . П р к м е р б. Иммобилизацию фермента проводят ко гфимеру 3 В качестве сшиваю- шего агента кспользуют- диэфир зтилекглиФеомент из Ф о р м у . а 3 П б Р е т 8 н и я 1, Cuot;o6 кммобклгюалин ферментов пуем ковалекткого скйзь веная молекул фермента с полимерным носителем, отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности фермента и его активность:, последний ирбдварнтельно ацилируют слорангидридом некасыщекной кислоты при Н 6,0-9,0 с последующей сополимарйзаций ацилнро.за:-1ного фермента с ненасыщенным полимеризуюшимся мономером. 2,Способ по п. 1, о т л к ч а :ю ш и й- с я тем, что процесс сополим-ьриза- цка веду-- в присутствии сшивающего агенгга. 3.Способ по п„ 1, э т л и ч а. ю ш к и с я там, что процесс сополимеризаиия ведут tipK О-бО-С, Fic-ro4 jgKK информации, принятые во вни мание при экспертизе: l. J.,.,3.B.A- 1970,212,362 2,Axen.,Po c;tt. j.,Ef-ntoac)( 5-. Naiur-e, 1967, 214, p. 1302 (прототип).