Способ получения -аспарагиназы Советский патент 1974 года по МПК C12D13/10 

1

Изобретение относится к области медицины и касается ферментных препаратов.

Известен способ получения L-аснарагиназы путем культивирования Erwinia cairotovora на средах с высоким содержанием определенной фракции дрожжевого экстракта (5% Glatex) в качестве источника аминного азота и глутаматом натрия в качестве источника углерода. Средняя удельная активность клеток 4-6 МЕ/мг сухих клеток.

Целью изобретения является интенсификация процесса биосинтеза фермента.

Для достижения поставленной цели культивирование осуществляют на среде, содержащей до 0,5% аминного азота; 0,1 -1,0% неорганической соли аммония; 0,5-2% органической кислоты, например лимопной, или многоатомного спирта, например глицерина; до 1,5% фосфатов; до 0,05% сернокислого магния, при рН 6,5-7,5 и температуре 28- 42°С.

Способ получения L-аспарагиназы заключается в следующем. Культуру Erwinia сагоtovora 268 поддерживают на скошенном МПА (или рыбном агаре, картофельном агаре), пересевают один раз в месяц, сохраняют при температуре ±4 ±1°С. Для получения инокулята используют свежепересеянную 18-часовую культуру, выращенную при 28-37°С.

Размнолсают культуру в колбах емкостью 750 мл со 150 мл среды состава, аналогичного ферментационной среде при 28-37°С в течение 18-24 час.

Для засева ферментационной среды используют 0,005-0,01% посевного материала (ио сухому весу). Ферментацию осуществляют в ферментерах объемом 100 л с рабочим объемом ферментационной жидкости

75 л. Среду стерилизуют 40-60 мин при I атм. Пеногаситель вводят или одновременно со средой или по ходу ферментации. Ферментацию ведут при 28-42°С, аэрации 20- 75 л/мин, работе мешалки 250-400 об/мин.

Продолжительность выращивания 8-18 час.

В ходе ферментации контролируют рН,

прирост биомассы, удельную активность Lаспарагиназы.

По окончании ферментации биомассу сепарируют и используют Д.ЯЯ выделения фермента. Выделение L-аспарагиназы из клеток может осуществляться одним из известных способов.

Пример 1. Посевной материал в количестве 0,01% используют для засева колб, емкостью 750 мл в 150 мл среды следующего состава (в %): К2НРО4 0,7; КН2РО4 0,3; MgSO4 0,02; NH4PO4 0,5; яблочная кислота 1.0.

рН среды после стерилизации 6,,0. Условия выращивания: температура 30°С, скорость качалки 220 об/мин, продолжительность выращивания 18 час. В конце ферментации удельная активность клеток составляет 8 МЕ/мг сухих клеток, съем 12,5 МЕ/мл культуральной жидкости. Аналогичный выход Lаспарагиназы дает замена яблочной кислоты на янтарную, аспарагиновую кислоту или глицерин.

Пример 2. Биосинтез по примеру 1 проводят на среде (в %): К2НРО4 0,7; КН2РО4 0,3; MgSO4 0,02; NH4PO4 0,3; яблочная кислота 1,0; дрожжевой экстракт 0,3 (по амипному азоту).

При изготовлении сред с дрожжевым экстрактом экстракт предварительно растворяют при нагревании, осадок отделяют центрифугированием и добавляют требуемые компоненты, рН среды после стерилизации 6,8- 7,0. Продолжительность ферментации 8- 12 час, температура 39-42°С, аэрация 280- 300 об/мин.

Получают клетки с удельной активностью 8 МЕ/мг сухих клеток, съем 50 МЕ/мл.

Пример 3. Посевной материал в количестве 0,01;%; используют для засева ферментера емкостью 100 л в 75 л среды состава, указанного в примере 2. Пеногаситель - силикон ЭПО-40 в количестве 0,01%- Условия ферментации: температура 37°С, аэрация 75 л/мин, мешалка 250 об/мин, продолжительность ферментации 8 час (до достижения стационарной фазы). Получают клетки с удельной активностью 7 МЕ/мг сухих клеток, съем 33 МЕ/мл.

Пример 4. Посевной материал в количестве 0,005% используют для засева ферментера емкостью 100 л в 75 л среды состава (в %): сульфат аммония 0,1; кукурузный экстракт 0,1 (по аминному азоту); ферментный гидролизат казеина 0,1 (по аминпому 5 азоту); молочная кислота 0,5; рН перед посевом 7,0.

При приготовлении сред с кукурузным экстрактом используют экстракт с содержанием не более 4%. углеводов (на сухой вес), рН

0 среды доводят до 7,5 40%-ным NaOH, осадок отделяют, добавляют остальные компоненты среды. Молочную кислоту добавляют с учетом ее количества, вносимой в среду с кукурузным экстрактом.

5 Условия ферментации: температура 28- 30°С, аэрация 20 л/мин, мешалка 400 об/мин, продолжительность выращивания 18 час. В конце ферментации получают клетки с удельной активностью 7 МЕ/мг сухих клеток,

0 съем 17 МЕ/мл.

Предмет изобретения

Способ получения L-аспарагиназы путем 5 аэробного глубинного культивирования культуры Erwinia carotovora на средах, содержа ших источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением фер мента, отличающийся тем, что, с целью 0 интенсификации процесса биосинтеза фермента, культивирование осуществляют па среде, содержащей до 0,5% аминного азота; 0,1 - 1,0% неорганической соли аммония; 0,5- 2,0% органической кислоты, например лимон5 ной, или многоатомного спирта, например глицерина; до 1,5% фосфатов; до 0,05% сернокислого магния, при рП 6,5-7,5 и температуре 28-42°С.