Способ получения алкогольдегидрогеназы Советский патент 1977 года по МПК C12D13/10 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам иолученмя фермента -алкогольдегидрогеназы, применяемого в молекулярной биологии и медицине для лечения нервных заболеваний, нанрнмер алкоголизма.

Известен сиособ получения алкогольдегидрогеиазы из биомассы дрожжей, включаюиигй илазмолиз дрожжей толуолом, осаждение фермента сульфатом аммония и его кристаллизацию.

Активность алкогольдегидрогеназы иосле первой нерекристаллизации 62,40 ед/мг белка 1.

Активность алкогольдегидрогеназы зависит от качества биомассы дрожжей.

Недостатком известного способа является низкий выход, т. е. низкая активность алкогольдегидрогеиазы в первоначальном экстракте био.массы дрожжей, так как обработка биомассы иеред выделением для повышения активности алкогольдегидрогеназы не ироводится.

С целью повышения выхода фермента по иредлагае.мому способу перед плазмолизом дрожжей толуолом дрожжи активируют пу-. тем культивирования их на питательной среде, содержащей фосфат калия в течение 1 - 6 ч, а затем в питательную среду вводят этанол, витамины груииы В, соль цинка и осуществляют культивирование в течение 3-6 ч.

2

Согласно оиисываемому способу проведе1П1ем культивирования био.массы дрожжей с активностью 0,11-0,30 ед/мг белка получают биомассу дрожжей с активностью 0,86-

1,80 ед/мг белка.

Выход алкогольдегидрогеназы повышается благодаря дополнительному культивированию исходной биомассы дрожжей. Культивирование исходной биомассы дрожжей проводят в две стадии. На первой стадии введением фосфата калия происходит активация ферментных систем клетки, в том числе ферментов цикла гликолиза. Это достигается путем частичного и обратимого блокировапия окислительных железоферментов дрожжей, в результате чего дыхание клетки частично тормозится и поэто.му активируется анаэробная фаза дыхания. На второй стадии добавлением этанола в качестве нндуктора

активности алкогольдегидрогеназы вместе с биологически активными веществами в фер.мептациониой среде осуществляется следующая реакция:

1°С 30°С этанол - ацетальдегнд

фермент алкогольдегидрогеиаза; аэробные условия; перемешивание.

Таким образом по предлагаемому способу проводят культивирование исходного дрожжевого сырья. Биомассу дрожжей (500 г прессованных дрожжей на 1 л среды) суспендируют в растворе фосфата калия (2,7% КН2РО4) и при непрерывном перемешивании и аэрации культивируют 2-6 ч. Температура культивирования 25-35°С, рН среды 4,5-5,5. Затем к ферментационной среде добавляют этанол, витамины группы В (, Be - биотин) или их источники и соли цинка. Процесс культивирования продолжают еще 3-6 ч. Активность алкогольдегидрогеназы в биомассе дролокей 1,8 ед/мг белка. Дрожжи плазмолизируют толуолом, фермент осаждают сульфатом аммония с последующей его кристаллизацией.

Пример 1. В качестве исходного сырья используют биомассу спиртовых дрожжей Saccharomyces cerevisiae. 1500 г прессованных дрожжей с активностью алкогольдегидрогеназы 0,3 ед/мг белка подвергают культивированию в реакторе емкостью 10,0 л. В первой стадии культивирования применяют питательную среду, состоящую из 81,0 г КН2РО4 и 1,5 л воды. Температура культивирования 30°С. В реактор через распределитель подают стерильный воздух (3л/мин). Культуральную жидкость перемешивают со скоростью мешалки 600 об/мин.

После 3 ч начинают вторую стадию культивирования биомассы и в реактор добавляют 150,0 мл этанола, 15,0 г экстракта дрожжей и 4,5 мг ZnCl2-6H2O. После этого процесс культивирования дрожжей при данном режиме продолжают 6 ч.

Полученную биомассу дрожжей отделяют от культуральной жидкости на вакуумном фильтре. Концентрация алкогольдегидрогеиазы в биомассе 1,8 ед/мг белка. В сравнении с исходным сырьем активность алкогольдегидрогеназы повышается с 0,3 до 1,8 ед/мг белка.

Дрожжи плазмолизируют толуолом, экстракт фракционируют сульфатом аммония с последующей кристаллизацией фермента. Получают ферментативную активность алкогольдегидрогеназы 65,3 ед/мг белка.

Пример 2. В качестве исходного сырья используют биомассу хлебопекарных дрожжей Saccharomyces cerevisiae. 1500 г прессованных дрожжей с активностью алкогольдегндрогеназы 0,11 ед/мг белка подвергают культивированию в реакторе емкостью 10 л.

В первой стадии культивирования применяют питательную среду, состоящую из 81,0 г КН2РО4 и 1,5 л воды. Температура культивирования 30°С. В реактор через распределитель подают стерильный воздух (3 л/мин). Культуральную жидкость перемешивают со скоростью мешалки 600 об/мин.

После 3 ч начинается вторая стадия, культивирования био.массы дрожжей и в реактор добавляют 180,0 мл этанола, 15,0 мг витамина BI, 15,0 мг витамина В2, 15,0 мг витамина Вб, 0,3 мг биотина и 4,5 мг ZnCl2-6H2O.

После этого процесс культивирования дрожжей продолл ают 6 ч.

Полученную биомассу дролсжей отделяют от культуральной л идкости на вакуумном фильтре. Концентрация алкогольдегидрогеназы в биомассе 0,86 ед/мг белка.

В сравнении с исходным сырьем активность алкогольдегидрогеназы повышается с 0,11 до 0,86 ед/мг белка. Алкогольдегидрогеназу из биомассы дрожжей выделяют, как в примере 1.

Предлагаемый способ обеспечивает повышение активности алкогольдегидрогеназы в биомассе до 0,86-1,80 ед/мг белка

Формула изобретения

Способ получения алкогольдегидрогеназы из биомассы , включающий плазмолиз толуолом, осаждение фермента сульфатом аммония и его кристаллизацию, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода фермента, перед плазмолизом дрожжей толуолом дрожжи активируют путем культивирования их на питательной среде, содержащей фосфат калия в течение 1 - 6 ч, а затем в питательную среду вводят этаиол, витамииы группы В, соль цинка и осуществляют культивирование в течение 3-6 ч.

Источник информации, принятый во внимание при экспертизе

1. Журнал «Biochemical Journal, 1970, 118, 375.