СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА МУЛЬТИФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 2011 года по МПК C12N9/60 C12N9/04 

Изобретение относится к области получения мультиферментных препаратов, в частности получению этанол-окисляющего мультиферментного препарата, и может быть использовано на предприятиях биотехнологической промышленности в качестве получения препаратов, направленных на снижение токсического действия алкоголя и продуктов его метаболизма.

Известен способ получения ферментного препарата алгкогольдегидрогеназы, культивирование дрожжей при аэрации в периодическом режиме на синтетической питательной среде, содержащие источники азота, фосфора, минеральные соли и 2% метилового спирта в качестве источника углерода, а также выделение фермента (Metra, R.J. Pyridine Nucleotide-Linked Oxidation of methanol in methanol-assimilating yeasts.- Bacteriology. - 1975. - V.3. - P.1165-1167). Однако данный способ не позволяет получить из дрожжей ферментный препарат, специфичный к алкоголю и ацетальдегиду высокой каталитической активности. Кроме того, он не может быть использован в пищевой промышленности, в связи с тем, что не отвечает требованиям по микробиологической чистоте ГосФармакопеи.

Известен также другой способ получения ферментного препарата из дрожжей, предусматривающий культивирование дрожжей в проточных условиях, где в качестве источника углерода используют этиловый спирт, после чего дрожжи подвергают растиранию на стеклянных бусах и центрифугированию с последующей очисткой хроматографическим методом на ДЕАЭ-целлюлозе (авторское свидетельство SU 763464, 15.09.1980). Это техническое решение является наиболее близким к заявленному по совокупности существенных признаков (прототип). Недостатками является то, что данный способ позволяет выделить из дрожжей один фермент с низкой каталитической активностью к субстрату, кроме того, полученный препарат загрязнен микрофлорой и балластными белками.

Технической задачей изобретения является выделение алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы с высокой каталитической активностью в одном препарате, повышение их каталитической активности, предназначенной для применения в биотехнологической промышленности.

Технический результат достигается за счет культивирования дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae в биореакторе на питательной среде, состоящей из мелассы и молочной сыворотки (соотношение 1:1) при температуре процесса 30±2°С, продолжительностью 18 ч, при скорости аэрации воздуха 30±0,2 л/ч и скорости перемешивания 500±5 об/мин. При меньшем содержании молочной сыворотки наблюдается увеличения выхода биомассы дрожжей и снижается каталитическая активность ферментного комплекса состоящего из АДГ и АЛДГ. При массовой доле молочной сыворотки в питательной среде более 50% не наблюдается увеличение выхода биомассы дрожжей и целевого продукта. По окончании процесса культивирования дрожжи отделяют от культуральной жидкости центрифугированием в течение 15±1 мин при 15000±100 об/мин и промывают дистиллированной водой. При этом каталитическая активность ферментного комплекса составляет для АДГ 20±1,2 Е/мг белка, а для АЛДГ 0,3±0,02 Е/мг белка, что значительно выше, чем при культивировании дрожжей на питательной среде, не содержащей сыворотку.

Для более полного извлечения дрожжевые клетки подвергают трансформации на планетарной шаровой мельнице РМ400, в которой разрушение клеток происходит за счет быстрой вибрации, создаваемой стеклянными шарами марки Glass beads approximately 80 mesh. Процесс трансформации ведут при скорости вращения ротора 10000 об/мин в течение 2,0±0,03 ч.

Для выделения ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, проводят экстракцию разрушенных клеток дрожжей 0,06 мМ фосфатным буфером рН 8,5 при температуре 37±2°С в течение 2 ч, с последущим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 мин. Далее супернатант двукратно обрабатывают охлажденным до минус 2±1°С раствором ацетона с массовой долей 95%, выдерживают для образования осадка 30 мин и центрифугируют при температуре минус 2±1°С при скорости ротора 15000 об/мин в течение 30 мин. Осадок растворяют в дистиллированной воде и раствор подвергают диализу в течение 3 часов против дистиллированной воды при температуре плюс 4±2°С. По окончании диализа раствор центрифугируют при скорости ротора 15000 об/мин в течение 40 мин и проводят ультрафильтрацию супернатантана при температуре 25±2°С, давлении 0,1-0,3 МПа в течение 3 ч. Концентрат направляют на микрофильтрацию на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм при температуре плюс 19±2°С, давлении 0,3-0,4 МПа, что позволило получить концентрат, соответствующий по микробиологическим показателям требованиям Государственной Фармакопеи.

Очистку фракции от положительно заряженных белков проводят с использованием метода ионообменной хроматографии (ИОХ) на колонке с карбоксиметилцеллюлозой (КМ-целлюлоза). Для этого элюцию осуществляют ступенчато в фосфатном буфере (рН 6,5) со скоростью 10 см³/ч. При этом степень очистки фермента на этой стадии составила 10,5, выход по активности и белку 25,4 и 4,3% соответственно.

Последующую очистку проводят на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Для этого ферментный комплекс, состоящего из АДГ и АЛДГ, наносят на предварительно уравновешенную фосфатным буфером рН 7,5 колонку с ДЭАЭ-целлюлозой. Элюцию сорбированных белков осуществляют раствором 4,5М NaCl в ступенчатом градиенте концентраций 0-15 моль/л. Степень очистки ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, составляет 90,3%.

С целью устранения действия пептидаз на полученный высокоочищенный ферментный комплекс, состоящего из АДГ и АЛДГ и создания оптимальных условий его работы в живом организме (рН 8-9,5, присутствие коферментов НАД и НАДН) подвергают полимеризации с помощью водного раствора агарозы с массовой долей 9%. С этой целью ферментный комплекс, содержащий АДГ и АЛДГ, коферменты НАД и НАДН добавляют в 9% водный раствор агарозы и оставляют при температуре 2±2°С на 1 час, после застывания продукта его подвергают гомогенизации.

В результате приведенной технологии из дрожжей выделяют ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, и получают этанол-метаболизирующий препарат с высокой каталитической активностью АДГ 1290 Е/мг белка и АЛДГ 39,0 Е/мг белка.

Пример 1. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae культивируют на питательной среде, содержащей 50% мелассы и 50% молочной сыворотки в периодическом ферментере с рабочим объемом 5,0 л. Для предотвращения спенивания в среду добавляют силиконовое масло в количестве 0,01%. Аэрацию воздуха ведут со скоростью 30±0,2 л/ч, скорость перемешивания питательной среды и биомассы составляет 500±5 об/мин. Процесс культивирования ведут при температуре 30±2°С в течение 18 ч.

По окончании процесса культивирования дрожжи отделяют от культуральной жидкости центрифугированием в течение 20±1 мин при 12000±100 об/мин и промывают дистиллированной водой. При этом каталитическая активность ферментного комплекса составляет для АДГ 20±1,2 Е/мг белка, а для АЛДГ 0,2±0,01 Е/мг белка, что значительно выше, чем при культивировании дрожжей на питательной среде, не содержащей молочную сыворотку.

Для более полного извлечения ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, дрожжевые клетки подвергают трансформации на планетарной шаровой мельнице РМ400, в которой разрушение клеток происходит за счет быстрой вибрации, создаваемой стеклянными шарами марки Glass beads approximately 80 mesh. Процесс трансформации ведут при скорости вращения ротора 10000 об/мин в течение 2,0±0,03 ч.

Для выделения ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, проводят экстракцию разрушенных клеток дрожжей 0,06 мМ фосфатным буфером рН 8,5 при температуре 37±2°С в течение 2 ч, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 мин. Далее супернатант двукратно обрабатывают охлажденным до минус 2±1°С раствором ацетона с массовой долей 95%, выдерживают для образования осадка 30 мин и центрифугируют при температуре минус 2±1°С при скорости ротора 15000 об/мин в течение 30 мин. Осадок растворяют в дистиллированной воде и раствор подвергают диализу в течение 3 часов против дистиллированной воды при температуре плюс 4±2°С. По окончании диализа раствор центрифугируют при скорости ротора 15000 об/мин в течение 30 мин и проводят ультрафильтрацию супернатанта при температуре 25°С, давлении 0,1-0,3 МПа в течение 3 ч. Концентрат направляют на микрофильтрацию на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм при температуре плюс 19±2°С, давлении 0,3-0,4 МПа, что позволило получить концентрат, соответствующий по микробиологическим показателям требованиям Государственной Фармакопеи.

Очистку ферментной фракции от положительно заряженных белков проводят с использованием метода ионообменной хроматографии (ИОХ) на колонке с карбоксиметилцеллюлозой (КМ-целлюлоза). Для этого элюцию осуществляют ступенчато в фосфатном буфере (рН 6,5) со скоростью 15 см³/ч. При этом степень очистки фермента на этой стадии составила 10,5, выход по активности и белку 18,2 и 3,2% соответственно.

Последующую очистку проводят на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Для этого этанол-окисляющую систему наносят на предварительно уравновешенную фосфатным буфером рН 7,5 колонку с ДЭАЭ-целлюлозой.

Элюцию сорбированных белков осуществляют раствором 4,5М NaCl в ступенчатом градиенте концентраций 0-15 моль/л. Степень очистки ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, составляет 90,5%.

С целью устранения действия пептидаз на полученный высокоочищенный ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, и создания оптимальных условий его работы в живом организме (рН 8-9,5, присутствие коферментов НАД и НАДН) подвергают комплекс полимеризации с помощью водного раствора агарозы с массовой долей 9%. Полимеризацию ведут при температуре плюс 2±2°С в течение 1 ч, после чего продукт подвергают гомогенизации.

В результате приведенной технологии из дрожжей выделяют ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, и получают этанол-метаболизирующий препарат с высокой каталитической активностью АДГ 1290 Е/мг белка и АЛДГ 39,0 Е/мг белка.

Пример 2. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae культивируют согласно примеру 1. По окончании процесса культивирования дрожжи отделяют от культуральной жидкости центрифугированием в течение 30±1 мин при 10000±100 об/мин и промывают дистиллированной водой. При этом каталитическая активность ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, составляет для АДГ 16±1,2 Е/мг белка, а для АЛДГ 0,15±0,01 Е/мг белка, что значительно выше, чем при культивировании дрожжей на питательной среде, не содержащей молочную сыворотку.

Для более полного извлечения ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, дрожжевые клетки подвергают трансформации на планетарной шаровой мельнице РМ400, в которой разрушение клеток происходит за счет быстрой вибрации, создаваемой стеклянными шарами марки Glass beads approximately 100 mesh. Процесс трансформации ведут при скорости вращения ротора 10000 об/мин в течение 2,0±0,03 ч.

Для выделения ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, проводят экстракцию разрушенных клеток дрожжей 0,06 мМ фосфатным буфером рН 8,5 при температуре 37±2°С в течение 2 ч, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 мин. Далее супернатант двукратно обрабатывают охлажденным до минус 2±1°С раствором ацетона с массовой долей 95%, выдерживают для образования осадка 30 мин и центрифугируют при температуре минус 2±1°С при скорости ротора 15000 об/мин в течение 30 мин. Осадок растворяют в дистиллированной воде и раствор подвергают диализу в течение 3 часов против дистиллированной воды при температуре плюс 4±2°С. По окончании диализа раствор центрифугируют при скорости ротора 12000 об/мин в течение 60 мин и проводят ультрафильтрацию супернатанта при температуре 26±2°С, давлении 0,1-0,3 МПа в течение 3 ч. Концентрат направляют на микрофильтрацию на мембранах с диаметром пор 0,40 мкм при температуре плюс 19±2°С давлении 0,3-0,4 МПа, что позволило получить концентрат соответствующий по микробиологическим показателям требованиям Государственной Фармакопеи.

Очистку ферментной фракции от положительно заряженных белков проводят с использованием метода ионообменной хроматографии (ИОХ) на колонке с карбоксиметилцеллюлозой (КМ-целлюлоза). Для этого элюцию осуществляют ступенчато в фосфатном буфере (рН 6,5) со скоростью 10 см³/ч. При этом степень очистки фермента на этой стадии составила 10,5, выход по активности и белку 20,7 и 3,8% соответственно.

Последующую очистку проводят на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Для этого ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, наносят на предварительно уравновешенную фосфатным буфером рН 7,5 колонку с ДЭАЭ-целлюлозой. Элюцию сорбированных белков осуществляют раствором 4,5М NaCl в ступенчатом градиенте концентраций 0-15 моль/л. Степень очистки этанол-окисляющей системы составляет 83,5%.

С целью устранения действия пептидаз на полученный высокоочищенный ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, и создания оптимальных условий его работы в живом организме (рН 8-9,5, присутствие коферментов НАД и НАДН) подвергают комплекс полимеризации с помощью водного раствора агарозы с массовой долей 9%. Полимеризацию ведут при температуре плюс 2±2°С в течение 1 ч, после чего продукт подвергают гомогенизации.

В результате приведенной технологии из дрожжей выделяют ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, и получают этанол-метаболизирующий препарат с высокой каталитической активностью АДГ 780,0 Е/мг белка и АЛДГ 28,0 Е/мг белка.

Пример 3. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae культивируют согласно примеру 1. При этом каталитическая активность ферментного комплекса для АДГ 18,0±1,2 Е/мг белка, а для АЛДГ 0,2±0,01 Е/мг белка, что значительно выше, чем при культивировании дрожжей на питательной среде, не содержащей молочную сыворотку.

Дрожжевые клетки подвергают трансформации на планетарной шаровой мельнице РМ400, в которой разрушение клеток происходит за счет быстрой вибрации, создаваемой стеклянными шарами марки Glass beads approximately 60 mesh. Процесс трансформации ведут при скорости вращения ротора 10000 об/мин в течение 2,0±0,03 ч.

Для выделения ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, проводят экстракцию разрушенных клеток дрожжей 0,06 мМ фосфатным буфером рН 8,5 при температуре 37±2°С в течение 2 ч, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 15 мин. Далее супернатант двукратно обрабатывают охлажденным до минус 2±1°С раствором ацетона с массовой долей 95%, выдерживают для образования осадка 30 мин и центрифугируют при температуре минус 2±1°С при скорости ротора 15000 об/мин в течение 30 мин. Осадок растворяют в дистиллированной воде и раствор подвергают диализу в течение 3 часов против дистиллированной воды при температуре плюс 4±2°С. По окончании диализа раствор центрифугируют при скорости ротора 12000 об/мин в течение 60 мин и проводят ультрафильтрацию супернатанта при температуре 24±2°С, давлении 0,1-0,3 МПа в течение 3 ч. Концентрат направляют на микрофильтрацию на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм при температуре плюс 19±2°С, давлении 0,3-0,4 МПа, что позволило получить концентрат, соответствующий по микробиологическим показателям требованиям Государственной Фармакопеи.

Очистку ферментной фракции от положительно заряженных белков проводят с использованием метода ионообменной хроматографии (ИОХ) на колонке с карбоксиметилцеллюлозой (КМ-целлюлоза). Для этого элюцию осуществляют ступенчато в фосфатном буфере (рН 6,5) со скоростью 15 см³/ч. При этом степень очистки фермента на этой стадии составила 10,5, выход по активности и белку 18,2 и 3,2% соответственно.

Последующую очистку проводят на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. Для этого этанол-окисляющую систему наносят на предварительно уравновешенную фосфатным буфером рН 7,5 колонку с ДЭАЭ-целлюлозой. Элюцию сорбированных белков осуществляют раствором 4,5М NaCl в ступенчатом градиенте концентраций 0-15 моль/л. Степень очистки ферментного комплекса, состоящего из АДГ и АЛДГ, составляет 83,5%.

С целью устранения действия пептидаз на полученный высокоочищенный ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, и создания оптимальных условий его работы в живом организме (рН 8-9,5, присутствие коферментов НАД и НАДН) подвергают комплекс полимеризации с помощью водного раствора агарозы с массовой долей 9%. Полимеризацию ведут при температуре плюс 2±2°С в течение 1 ч, после чего продукт подвергают гомогенизации.

В результате приведенной технологии из дрожжей выделяют ферментный комплекс, состоящий из АДГ и АЛДГ, и получают этанол-метаболизирующий препарат с высокой каталитической активностью АДГ 830,0 Е/мг белка и АЛДГ 25,0 Е/мг белка.

Предлагаемый способ позволяет получить этанол-окисляющий мультиферментный препарат с высокой степенью чистоты и высокой каталитической активностью по алкогольдегидрогеназе (в 4,0 раза выше чем в прототипе) и альдегиддегидрогеназе. Также разработанная технология позволяет повысить выход биомассы дрожжей и использовать этанол-окисляющий мультиферментный препарат в пищевой промышленности.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению мультиферментных препаратов, и может быть использовано на предприятиях пищевой промышленности в качестве получения препаратов, направленных на снижение токсического действия алкоголя и продуктов его метаболизма. Способ предусматривает культивирование дрожжей в биореакторе на мелассной среде с добавлением молочной сыворотки в количестве 50% от общего объема питательной среды. Клетки дрожжей отделяют от культуральной жидкости центрифугированием и подвергают трансформации на шаровой мельнице при температуре 25±2°С при скорости вращения ротора 10000 об/мин в течение 2,0±0,3 ч. Трансформированные клетки дрожжей экстрагируют 0,06 мМ фосфатным буфером рН 8,5 при температуре 37±2°С с последующим центрифугированием с получением супернатанта. Полученный супернатант подвергают двукратной обработке охлажденным раствором ацетона с получением осадка. Полученный осадок растворяют в дистиллированной воде и подвергают диализу против дистиллированной воды в течение 3 ч при температурем +4±2°С и центрифугируют с получением супернатанта. Полученный супернатант подвергают микрофильтрации на мембранах с размерами пор 0,22 мкм и удаляют балластные белки с помощью ионообменной хроматографии на колонке с КМ- и ДЭАЭ-целлюлозой. Изобретение позволяет получить этанол-окисляющий мультиферментный препарат с высокой степенью чистоты и высокой каталитической активностью и повысить выход биомассы дрожжей.

Способ производства мультиферментного препарата, предусматривающий культивирование дрожжей в биореакторе на мелассной среде с добавлением молочной сыворотки в количестве 50% от общего объема питательной среды, отделение клеток дрожжей центрифугированием, трансформацию дрожжей на шаровой мельнице при температуре 25±2°С при скорости вращения ротора 10000 об/мин в течение 2,0±0,03 ч, экстракцию разрушенных клеток дрожжей 0,06 мМ фосфатным буфером рН 8,5 при температуре 37±2°С с последующим центрифугированием с получением супернатанта, двукратную обработку полученного супернатанта охлажденным раствором ацетона с получением осадка, растворение осадка в дистиллированной воде, диализ против дистиллированной воды в течение 3 ч при температуре плюс 4±2°С, центрифугирование с получением супернатанта с последующей микрофильтрацией на мембранах с размерами пор 0,22 мкм и удалением балластных белков с помощью ионообменной хроматографии на колонке с КМ- и ДЭАЭ-целлюлозой.