Способ получения гексокиназы Советский патент 1977 года по МПК C12D13/10 C07G7/03 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕКСОКИНАЗЫ

1

Изобрете5ше отнсюится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения фермента гексокиназы, применяемого в мопекупярной биологии и медицине.

Известен способ получения ксркииазы § из хлебопекарных дрожжей, предусматривающий плазм олиз дрожжей толуолом и осаждение фермента сульфатом аммония TlJПри этом исходная активность гексоки назы а первоначальном экстракте исходной ю биомассы составляет 4 ед/мг белка. Активность гексокиназы после осаждения супьфатом аммония равна 6 ед/мг белка.

Однако активность гексокиназы зависит от активности гексокиназы в биомассе дрож-и жей..

Цель изобретения - интенсификация rjpoаесса биосинтеза гексокиназы и увеличение активности фермента.

Для достижения поставленной цели перед плазмолизом дрожжи культивируют при аэрдции на питательной среде, содержащей фосфат калия и сернокислый магний в течение 1-3 ч, затем в питательную среду добавляют индук-тор гексокиназы- глюкозу в количестве 10-,25

15% и продолжают процесс в течение 0,5-1

При этом фосфат калия вводят враствор в количестве 2,7%, а сульфат магния -0,5 %

Дрожжи культивируют при. 30°С и рН 5-7 Пр предлагаем ому способу перед акстракций толуолом осуществляют культивирование ис- ходной биомассы дрожжей в растворе фосфата калия с добавлением солей магния при 30®С, рР 5-7 и режиме аэрации 0,5-1 (воэдух, культуральная жидкость) в течение 1-3 ч, затем добавляют индуктор гексокиназы-глюкозу в концентрации 10-15% и пр цесс продолжают в течение 0,5-1 ч.

При проведении .культивирования биомассы дрожжей с активностью 0,75 ед/мг белка получают биомассу дрожжей с активностью 6,2 белка.

Повышение активности .гекссжиназы npt исходит за счет культивирования исходной биомассы дрожжей. Культивирование исходной биомассы дрожжей проводят в две стадии. На первой стадии введением фосфата калия и солей магния происходит активация ферментных систем клетки, в том числе ферментов цикла гликолиза. Это достигается

путем частичного и обратимого блокировани окислительных железоферментов дрожжей, в результате чего flbfxaiffle клетки частично тормозится и поэтому активизируется анаэробная фаза дыхания. На второй стадии бла годаря добавлению глюкозы в качестве индуктора активности гаксокиназы в ферментационной среде осуществляется следующая реакция:

Д-глюкоза + АТФ гексокинааа Д-глюкоао-бфсхфат + АДФ.

Таким образом по предлагаемому способ проводят еторичное культивирование исходного дрожжевого сырья. Биомассу дрожжей (500 г йрессованных дрожжей на 1 л среды) суспендируют, в растворе фосфата калия (2,7% KHgPO) и солей магния (О,5 Мй50 -7НдО) и при непрерывном перемешивании и аерации культивируют 2-6 ч. Температура культивирования от 25 до 32 рН среды 5,0-7,0, режим аэрации 0,5:1 (воздух: культуральная жидксх;ть). Затем к ферментационной среде добавляют глюкозу в концентрациях 10-15%, Процесс культивирования продолжают еще ЗО-бО мин. Активность гексокиназы в биомассе дрожжей составляет 8,2 ед/мг белка. Дрожжи плаз- молизируют толуолом и экстракт фракционируют сульфатом аммония.

Предлагаемый способ иллюстрируется примерами его выполнения.

Пример.В качестве исходного CfiipbH используют биомассу хлебопекарных дрожжей Sci ОС ha thorny се5 cereviaia Е, Прессованные дрожжи в количестве 1 500 г с активностью гексокиназы 0,69 ед/мг белка подвергают вторичному культивированию в реакторе емкостью 10,0 л. В первой стадии культивирования применяется следую .пшй состав питательной среды в г: 81.0 , 15,OMg50j7H20 1.5 воды.

Температура культивирования , В реакторе и распределитель подают

стерильный воздух в количестве 1,5 л/мин, Культуральную жидкость перемешивают со скоростью мешалки 600 об/мин.

После 2 ч начинают вторую стадию культивирования биомассы дрожжей и в реактор добавляют 300 г глюкозы. (После этого процесс культивирования дрожжей при данном режиме продолжают 30 мин.

Полученную биомассу дрожжей отделяют ог культуральной жидкости на вакуумном фильтре. Концентрация гексоциназы в биомассе составляет 8,2 ед/мг белка. В сравнении с исходным сырьем активность гексо киназы повышается от 0,69 до 8,2 ед/мг белка.

Дрожжи плазмолиаируют толуолом и экс-ртракт фракционируют сульфатом аммония. Получают ферментативную активность гексо киназы 14,2 ед/мг белка.

Пример 2, В качестве исходногосырья используют биомассу спиртных арож «eEiSaccha omyces cei evisiaHj Пре 5сованные дрожжи в количеств 5ОО г с активностью гексокиназы 0,75 ед/ мг белка подвергают культивированию в реакторе емкостью 10 л. В первой стадии культивирования I применяется следующий состав питательной среды -в г: 81,0 KHjPO , 15,0 , 1,5 л вода,

Температура культивирования 30 С. В растворе через распределитель подают стерильный воздух в количестве 1,5 л/мин. Культуральную жидкость перемешивают со скоростью мешалки 1 2ОО об/мин. После 3 ч начинают вторую стадию культивирования биомассы дрожжей и в реактор добавляют 450 г глюкозы. После чего процесс культивирования дрожжей продолжают 1ч.

Полученную биомассу дрожжей отделяют от культуральной жидкости на вакуумном фильтре. Концентрация гексокивазы в биомасс составляет 7,9 ед/мг белка. Гексоки азу из биомассы дрожжей выделяют как в примере 1.

Предложенный способ обеспечивает повышение активности гексокиназы в биомассе дрожжей до 7,9- В,2 ед/мг белка. В сравнении с исходным сырьем активность повышается от 0,69 ед/мг белка до 8,2 ед/м белка и от 0,75 ед/мг белка до 7,9 ед/мг белка.

Формула изобретения

1,Способ получения гексокиназы из био массы дрожжей,- предусматривающий плазмопиа дрожжей толуолом и осаждение фермен та сульфатом аммония, отличающийс я тем, что, с целью интенсификации процесса биосинтеза гексокиназы и увеличения активности фермента, перед плазмолизом дрожжи культивируют при аэрации на питательной среде, содержащей фосфат калия

и сернокислый магний в течение 1-3 ч, затем в питательную среду добавляют индуктор гексокиназы - глюкозув количестве 10-15% и продолжают п зоцесс в течение 0,5-1 ч.

вор в (количестве. 2,7%, а сульфат магния -Источники информации принятые во внима0,5%.ние при экспертизе:

ВО°С и рН 5-7.5 1068, 151. 1, 307.