Способ получения полипептидов Советский патент 1977 года по МПК A61K38/28 C12P21/06 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ виде их хлортдов при концентрации (молярной). При ишользоваики фер1ч5ен1а Миксобактер AL- протеазой II условия реакции подти такие же, которые используют с AM-протеазой. Соотношение э «нм-субстрат- ) при рН 4-10 и температуре 25-75° С. Предпочтательными условиями являются следующие: концентрация инсулина, близкая к его растворимости в инкубаторной среде, рН 6-9, температура 30-50° С и низкое соотношение энзимсубстрат, напртмер 1:1000 или менее. В инкубационную сред}- включают металлические ионы, например, кальция или магния. Реакцию осуществляют при использовании знзима, связанного ковалентно с подложкой. Одним. нз способов гфисоединения AM-протеазы к подложке является активирование шариков агарозногр геля цианогенбромидом с пространственными группами (или без них), происходящими, например, иэ пексиламина или гексановой кислоты. Затем активированную агарозу подвергают взаимодействию с АМ-протеазой. Если реакщ ю с энзимом осуществляют при помощи энзима, растворенного в водной среде, необходимый дес-Лиз -Ала -свиной (или бычий) инсулин можно отделять от друшх компонентов инкубационной смеси при помонди любого обшеприпятого технологаческого приема разделения полипептидов, например техники молекулярных сит. Водную среду, оставш тося после того как весь исходный инсулин деградрфовал, фильтруют через колонку из поперечно-связанного декстранового геля или пслиак риламидного геля, подходяидах для фракционирования соединений с мол.в. 5000-10000 при любом удобном значет1И рН, предпочтительно удаленных от полипептидов и предпочштельно с тжзкой изоэлектрической точкой. Колонку элюируют буферной смесью, состоящей из компонентов, которые являются летучими при сушке вымораживанием под высоким вакуумом, например водной уксусной кислоты, карбоната аммония или ацетата аммония, давая требуемый продукт, которЬ1Й отделяют при сушке вымораживанием злюата. Если реакцию с энзимом осуществляют с помощью энзима, присоединенного к подложке, то отделение требуемого полипептида от энзима осуществляют фильтровавшем, если подложка является нераст зоримой, или используют фильтр для DbiciuHX полимеров, сопи подложка является растворимой в водной среде. Лаже в кристаллизованном свином или бычьем инсулине содержатся {фугие полипептиды в качестве примесей. Эти примеси обычно присутствуют о количестве 3-5 вес.% от всего инсулина и состоят из таких BesnecTB, как про-инсулин, фрагменты про инсулина и глюкатон, которые трудно отделимы 01 инсулина. Под действием специфической амимо.иьишептнлазы лизина примеси разрушаются до более мелких полипептидов. Инкубацией свиного йтш бычьего инсулина со специфической аминоэвдопептидазой и отделением продукта, полученного из энзима, лизил-аланина и полипептидаз с меньщим молекулярным весом, чем инсулин, т.е. олигопептидов, получают продукт, содержащий меньцше количества примесей, чем было в исходном препарате. Примеси, присутствующие в инсулиновом препарате, способствуют его антигенности. Продукты и полипептвды, полученные по предлагаемому способу, имеют активность, подобную инсулину, а также вызывают малое количество антител, которые связывают вещества, подобные инсулину при последующем введении в организм, чем исходные вещества. Полученные полипептиды не обладают какимлибо токсическим действием. Их используют для лечения диабета, также как при, использовании свиного или бычьего инсулина. Назначают их парзнтерально, обычно подкожно или в виде раствора, или в виде препаратов, предназначенных для хранения. Препараты оказывают продолжительное действие, например до 24 час. Дозы выбирают в зависимости от требуемого лечения диабета, они могут быть высокими, например 200 ед. ежедневно. Пример 1. Свиной кнсулин, который предварительно был перекристаллизован 10 раз, растворяют в 0,1 М бикарбоната аммония (1,0 мл). Раствор инкубируют с АМ-протеазой (50 мкг) в течение 16 час при 37° С. Одну дозу (Шрлкг) инкубационной смеси затем анализируют на N - концевые амино-кислоты с помощью приема дансилировзния при использовании 1 - диметиламинафталин - 5 - сульфонилхлорида. Вторую дозу проверяют с помощью бумажного электрофореза в смеси уксусной и муравьиной кислот при рН 2,1 (20мл муравьиной кислоты, 80 мл уксусной кислоты, разбавленных до I л водой) и показьшают присутствие Н-.Пиз-Ала-ОН и епю одного компонента. Элюировапие второго компонента и анализ N - концевых аминокислот обнаруживает глицин и фенилалаиии.. Общий анализ аминокислот дает общее соотношение аминокислот аспарагиновой кислоты 3, сери(а 3, TpeofttiHa 2, глютаминовой кислоты 7, пролина 1, глицина 4, аланина 1, валина 4, изолейцика 2, лейцина 6, фенилаланина 3, тирозина 4, гистидина 2 и аргинина 1 вместе с цистенном количество которое точно не определено. Соединение отличается от свиного инсулина отсутствием в нем лизина и только одного остатка алаиина. Третью дозу помешают в верхнюю часть колонки из смолы амино-кислотного анализатора Локарта. Колонку из смолы элюируют при 55°С следующим образом; доладн (рН 3,28); 55 мин (рН 4,25), 2 час 5 мин (рН 6,65), на которой инсулин появляется 3 час 54 мин, Лиз-Ала через 4 час 5 мин и дес-Лиэ -Ала свиной инсулин через

3 час 43 мин. Обнаружены только два пика, соответствующие дес-Лиз - Ала °-свиному инсули(су

Лиз-Ала.

Остаток инкубационной смеси помещают на колонку из пористого поперечно-связанного декстранового геля, уравновешенного 0,1 моля карбонатааммония. Колонку проявляют 0,1 М карбонатом аммония при скорости потока 3 мл/час и собирают фракции 30 капель (1 мл). Фракцию анализируют fia пептидный материал измерением УФ-поглошения при 280 нм и фракции 25-35, содержащие основной пик, сочетают и лиофилизируют, давая дасЛиз - Ала - свиной инсулин.

П р и м е р 2. Свиной инсулин, перекристаллизовьтанный 10 раз, растворяют в 0,1 М бикарбоната аммония, содержащем хлористый кальций, давая раствор, содержащий 2 мг/мл инсулина и хлористый кальщ1Й в 3x1 б молярной концентрации. Порции зтого раствора затем инкубируют при рН 8,2 при температуре 37° С в течение 40 час с количеством AM-протеазы, дающим следующие соотношения энзим-субстрат: ;б25, 1:1250, .1:2500 и 1:5000. Анализ инкубационных смесей с некоторыми интервалами с помощью приемов, описанных в примере 1, показывает полное расщепление в каждом случае, за исключением 1:5000 реакции, в которой в конце :)ксперимента получают 88%-ное расщепление.

П р и м е р 3. Свиной инсулин, перекристаллизованный 10 раз, растворяют в буферных смесях, приготовленных из аммиака и уксусной кислоты с рН 4,0; 6,0; 8,0 и 10, содержащих хлористый кальций, давая 2 мг/мл инсулина и хлористый кальций в Зх Молярной концентрации. Растворы инкубируют с AM-протеазой при соотнощении энзим-субстрат 1:100 при температуре ЗТС в течение 6 час. Анализ показывает, что в каждом случае имеет место расщепление.

П р и м е р 4. Свиной инсулин, предварительно перекристаллизованный Шраз, растворяют в 0,1 М буферном растворе бикарбоната аммония при рН 8,2, содержащем хлористый кальций, давая раствор, содержащий 2 мг/мл илсулина и хлористый кальций в ЗхШ молярной концентрации. Порции раствора инкубируют с AM-протеазой при соотнощении знзим-субстрат 1:1000 в течение 3 час при температуре 23,37,45 и 55°С. Алализ, аиалогичный примеру 2, показывает полное расщепление при 37 и 45°С, прибшпительно 50%-ное расщепление при 55С и в небольшой степени расщепление при 23°С.

П р и м е р 5. Раствор свиного инсулина (120 мг- кристаллизованный один раз свиной инсулин, очищеиньш с помощью гелевой фильтрации в 0,1 М карбоната аммония) в воде (14мл), доведенный до рН 8,0 и содержаш}1Й хлористьш кальций в 3x10 молярной конценгращди, инкубируют при 37°С с АМ-протеазой (120 мкг) в течение 5 час. Во время инкубации рП подаерживают 8,0 с помощью добавления 0,005М раствора гидртокиси натрия. Полученный раствор помещают на кoлoF кy из ггористого

поперечно-связанного декстрапоного )еля и колонку проявляют 0,1М карбонатом аммония при скорости потока 13 мл/час при температуре 4°С. Фракцию по 150 капель (5 мл) собирают и анализируют на пептидный материал измерением их УФ-поглощения при 280 нм. Фракции (22-30), содержащие главный пик, собирают и лиофилизируют, давая де(;-Лиз -Ала - свиной инсулин (100мг). После электрофореза с помощью потшакриламидного геля при рН 8,9 материал представляет собой единственный компонент при окрашивании амидочерным. Он имеет подвижность по направлению к аноду 1,2 относительно подвижности свиного инсушна. Он также дает некоторые интегральные амино-кислотные соотношения (найденные в примере 1).

П р и м е р 6. Раствор свиного инсулина (1 мг) в 0,1 М буферной смеси бикарбоната аммония с рН 8,2 (1 мл) помещают на верхнюю часть колонки,

содержащей 3 мл 4%-ного агарозного геля, к которому ковалентно присоединяют5 мг АМ-протеазы и уравновешивают в том же самом буферном растворе бикар&)ната аммония при 22° С-Колонку элюируют буферным раствором бикарбоната аммония

при скорости потока 7 мл/час в течение 1 час и фракцию анализируют на пептидньш материал путем измерения УФ-поглощения при 280 нм. Ф15ак1ЩИ, содержащие пептидный материал, собирают и

лиофилизируют, давая дес-Лиз -Ала - свиной

инсулин, имеющий те же физические свойства, что и продукт примера 5.

П р и м е р 7. Растворы свиного инсулина (кристаллизованные 10 раз), содержащие 1 мг инсулина на 1 мг растворителя, инкубируют при рН

8,0 и температуре 40° С в течение 2 час с АМ-протеаэой при соотношении знзим-субстрат 1:1000 в присутствии, хлористого магния при концентрациях 10, 1(Т, и iff молярных соответственно. Анализ, как в примере 2, показывает 90%-ное

расщепление с К молярной концентрацией Мо, 75%-иое расщепление с lO и 10 молярным Мо и 65%-ное расщепление с id молярным Мо. При отсутствии магния имеет место 68%-ное расщепление.

П р и м е р 8. Раствор кристаллического

бычьего инсулина (150мг) в воде (20мл), доведенной до рН 8,3 и содержащий хлористый кальций, инкубируют с AM-протеазой (240 мкг) в течение 3 час при 37°С.

Во время инкубирования рН поддерживают при

8,3 путем добавления 0,02М раствора гидроокиси натрия. Дозу раствора (10 мкг) проверяют при использовании амино-кислотного анализатора, как описано в примере 1, 1 лшн (рН 3,28); i мин

(рН 4,25), 60 мин (рН 6,65), затем цикл регенерации на колонке. Пик инсулина (элюирование в течение 90 мин) отсутствует, тогда как дес-Лиз -Ала - бычий инсулин (время элюирования 80 мин) и Ала-Ала (элюирование в течение 1 20 мин) присутствуют. Инкуби1) раствор затем лиофили:)ируют и твердое вещество раствсфяют в М уксусной кислоте (2ш). Этот раствар подвергают гепевой фильтрации л{ж 4° С с М уксусной кислотой в качестве растворителя. Фракции, включаняцие главный пик, измеренный с noMouiibto адсорбции УФ при 280 нм, объединяют и модифицируют, давая дес-Лиз -Ала -бычий инсулин (113 мг). После полнакрилаАвщ-гелевого электрофореза (рН 8) мате1шал выглядит как единственный компонент, когда окраишвается амидо-черным. Он имеет подвижность 1-2-кратную подвижности бычьего инсулина по направлению к аноду. Общий алтно-ютслотный анализ дает те же самые интегральные соотноившш аминокислот, что и бычий инсулин, за исключошем того, что отсут ствует лизин и только два остатка алаиина. Глидан и феюшаланин обнаруживаются как N концевые аминокислоты при приеме .дансилирования описшном в примере 1. П р и м е р 9. Один раз фисталлизованный свиной инсулин (150мг) растворяют в воде при добавлешш N гидроокиси аъоювия и раствор разбавляют до 3,0 мл 0,1 М бикарбонатом аммония. Добавляют раствор АМ-протеазы (150мкг, 0,5 мл) и раствор вьщерживают при телшературе в течение И час. Анализ дозы перевара с помощью приема, описанного в примере 8, показывает, что переваривание завершилось. Раствор разбавляют 40 об %/об водной уксусной кислоты (3 мл) и полученньш раствор помещают на колонку Сефадекс G-50. Колонку элюируют 20об %/об водной уксуснсж кислотой и элюат проверяют при измерении абсорбции2Ф при 280 нм. Собирают фракцию из 8(Ю капель со скоростью потока 15 мл/час. Инсулииовый пик появляется между фракци ми 45-56, зти фракции объединяют и сушат, получают дес-Лиз -Ала -свиной инсулин (135 лет). При этих условиях АМ-протеаза, меченая 1-125, появляется между фракциями 36-43. Формула изобретения Способ Получения погмпептидов из инсулина путем его обработки пептидазой с последующим выделением целевого продукта, отличающийс я тем, что, с целью пежьпиения качества препарата, обработку осуществляют ферментами АМ-прОтеазой из грибка Armillaria Meltea или Миксобактер 2-1 протеазой 11 из штамма MyxobactetA2-1. Источники информащш, принятые во внимание при зкспертизе: 1. Патент США № 3.364.116, кл. 424-178,1968.