Способ очистки водных растворов соединений инсулина с щелочным металлом или аммонием Советский патент 1978 года по МПК A61K38/28 

(54) СПОСОБ ОЧИСТ СОЕДИНЕНИЙ ИНСУЛ Изобретение относится к улучшенному спосрбу очистки (инсулвна - препарата, который нашел Применение в медицине для . лечения сахарного диабета. Применяемые в промьпиленности способы очистки инсулина включают в себя такие операции, как осаждение при изоэлектрической точке иеинсулиновых белков, содержащихся в водном экстракте поджелудочной железы, дифференцированное высаливание инсулина из экстракта хлористым натрием , осаждение или кристаллизация инсулина из растворов в виде комплекса с цинком 2. Однако, как выяснилось в последние годы , извлеченныйтаким образом инсулин содержит в незначительных количествах белки неинсулинового харгистера (проинсулин и проинсулиновый белйк), которые имеют антигенный и имунногенный характер . Для более полного отделения неинсулиновых компонентов от препаратов инсулина было предложени использовать гель-фильтрацию. Так, известен способ очистки водного раствора инсулина с концентрацией 6,5 %, ИЛИ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ С ЩЕЛОЧНЫМ МЕТАЛЛОМ ОНИЕМ путем гель-фильтрации через сефадекс -5О f i rt б , заполняющий шестисекциоцг ную колонку, Элюирование госулина проводят О,1М соляной кислотой при комнатной температуре . Однако описанный способ очистки инсулина не позволяет получить препарат требуемой чистоты. Для улучшения качества и увеличения выхора инсулина по предлагаемому способу набухший гель, 1оглощающий в сухом состоянки 4(5-ё(5 вес. % воды, с диаметром частицZO - 80 мкм помещают в колонку в качестве насадки, вводят в колонку с гелем водный раствор комплекса инсулина с щелочным металлом или аммонием, чистота которого составляет 8О%, с концентрацией инсулина 1-8 вёс«% на I объем и общим количеством инсулина 0,8-6,7 г/л насадки при рН раствора 2,0-3,5 элюируют инсулин водным элюентом, подкисленным той же кислотой, в которой растворен инсулин, и имеющим рН в том же интервале, что и раствор инсулина. Как предпочтительный вариант в качестве геля используют поперечносшитый декстран, загрузка колонки составляет 3,5 5,0 г инсулина на 1 л носителя; .обычно инсулин растворяют в 0,5 н.уксусной кислоте и рН устанавливают разбавленной соля ной кислотой, элюент содержит 0,5 н.уксусную кислоту,П р -и м е р 1, Гель поперечносшитого декстрана, поглощающего 5% воды и имеющего частицы размером 20-80 мкм, уравновешивают в О,5 М уксусной кислоте, В лабораторную колонну К100(1ОО/Фармациа Фаин Кемикалс) с внутренним диаметром , 1О см и длиной 100 см помещают набухший гель объемом слоя равным 7 л (глуби на слоя 89 см). Натрий-инсулин (из бычье поджелудочной железы) (17,5г), обладающийактивностью, равной 23,8 ед/мг и содержащий 4,21 вес, % проинсулина, растворяют в, 400 мл О,5 н, уксусной кис1Ц)ты, Раствор пропускают через колонну и элюируют 0,5 н. уксусной кислотой при давлении 0,35 кг/см. Скорость потока - 9ОО мл/ч (линейная скорость 0,19 мл/см мин). После элюиро ваная пустотного объема (1725 мл) отбирают фракции по 23,5 мл каждая. Содержание протеина определяют, измеряя ультрафиолетовую .адсорбцию при 28О нм. Определяют также содержание твердых веществ в мг/мл. Собирают всего 240 фракций, которые делят на 4 группы. Данные результатов приведены в таёл, 1. j( группе С добавляют 3,О мл 2О%-ного раствора хлористого цинка и полученный раствор разбавляют до ЗО25 мл 0,5 н.раствором гидроокиси аммония Устанавливают рН 6,0 конечного раствора разбавленным раствором гидроокиси аммония. Выпав- доий в осадок цинкинсулин отделяют центрифугированием, промывают последовательно водой, абсолютным спиртом и эфиром и сущат В вакууме. Выход цинкинсулина 13,9 г потенция инсулина - 25,6 ед/мг, содержание проинсулина 0,44%. Поскольку группа С содержала 86,4% общего количест а злюированных твердых веществ/ максимальный выход твердых веществ из группы С 86,4% 17,5 г или 15,1 г, В пересчете на единицы максималь ный выход был равен примерно ЗбООООед. Таким образом, выход цинкинсулина из гру пы С соответствует 91,9% по весу и 98,9 В пересчете на единицы. В пересчете на исходный продукт выход по весу и в пересчете на единицы/мг;был равен 79,4и85,4%соответственно. Группу В-2 осаждают избытком ионов цннка как описано выше аля группы С, осадок перерастворяют в О,5 М уксусной кислоте н снова фильтруют через колонку меньшего размера. Выделенный инсулин перекристаллизовывают, как описано для группы С, получают дополнительно 1,U г цинкинсулина, имеющего потенцию, соответствующую 26,7 ед,/мг. Таким образом, общий выход цинкинсулина: в пеоесчете на исходный продукт был равен 85,1% по весу и в пересчете на единицы 91,8%. На чертеже приведена диаграмма элюирования, которая имеет форму кривой зависимости оптической плотности при 28О мкм разных фракций от количества фракций. Диаграмма показывает содержание протеина во фракциях, отобранных во время алюирования. Отдельные фракции, собранные в несколько групп, описанных в примере 1, показаны пунктирными вертикальными линиями. Из диаграммы видно, что исходный продукт состоял в основном из инсулина и что инсулиновый компонент эффективно отделен от проинсулина и подобных протеинов. П р и М е р 2. Опыт провд)дят по примеру 1, но вместо бычьего берут 30 г свиного натрий-инсулина и количество 0,5 М уксусной кислоты в которой растворяют инсулин, увеличивают до 6ОО мл. Свиной натрий-инсулин- .меет потенцию 23,3 ед/мг и содержит 2,42 вес.% проинсулина. Данные Результатов приведены в табл. 2, Из группы С получают -26,5 г цинкинсулина, имеющего потенцию, соответствующую 25,3 ед./мг, и содержащего 0,57% -проинсулина. Таким образом выход :цйнкинсули- на соответствует выделению 98,1% по весу или 95,9% в пересчете на единицы. Цинкинсулин, приготовленный из той же партии поджелудочной железы, способом, при котором щелочная кристаллизация и фипнгрование через гель заменены обычным изоелектрическим осаждением из водного н водно-спиртового раствора, получают С таким же выходом на 1 единицу поджелудочной железы. Одаако потенция инсулина со ответствует 24,3 ед/мги продукт содержим 3,18% проинсулина.

Таблица

1О-69

1405

70-119

1193

В-1

120-160

В-2

978

161-225

15 2О

1410

120О

820

192О

Фор.мула изобретения

протеины н энзимы

Главным образом

2,4 проинсулин

Промежуточные продукты

Инсулин

86,4

Таблнпа2

1,3 2.7 6.0

90,0

ку, в последнюю добавляют указанные ра,створ соедЕненвй инсулина, с чистотой 8О%, концентрацией инсулина 1-8 вес.% ва 1 объем общим количеством инсулина О,8--6,7 г/п слоя геля и рН 2,О-3,5, и проводят элюир1 вание водым элкжнтом, подкисленным той же кнслбтой, в которой растворен инсулин, и имекхцим рЕГ, соответствующий значению рН раствора инсулина.

2,Способ по п. 1, отличаюшийс я тем, что в качестве геля используют поперечносшитый декстран,

3,Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что общее количество инсулнна со7.SQS ставляет 3,5-5,0 г инсулина на 1 л слоя еля. 4. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что используют раствор инсулина в 0,5 М уксусной кислоте и рН этого раствора устанавливают разбавленной соляной кислотой. 5. Стфсоб по п. 1, о т л и ч a ю щ и и с я тем, что используют элюент содержащий ю 0,5 н.укс усную кислоту. Источники информации, принятые во вни-, мание при экспертизе:, f го 0 М 10 109 ПО м S8 1, Патент США i 2449086, кп. 260-112.7, 1948. 2. Патент США № 2626228, ют. 260-112.7, 1953. . З.Т.Е .ChattCe ,T.M.,M/.W.BrQrHeM, Pofcitte PvomauPiw: CharacteKizaiiOtt - j 1 . 4 /. .and AmiMo Acid 6е иексе,5с1вяся Ш - / ., в .J.C.aa«&ow, CoEum« tor Lerge-Seo g FiEtralioit on Porous jgePb.Tt aciiowaliow ol seed Pr oieiws aitd 3H&uEm,I.Agt.Pood Chem.,197i, 19 (4) , .581. teo