Способ определения бензофурокаина Советский патент 1992 года по МПК G01N33/48 A61K31/34 

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим методам исследования, и может быть использовано для количественного определения бензофурокаина в биологической жидкости.

Известны следующие способы количественного определения бензофурокаина: титрометрический, сущность которого состоит в титровании бензофурокаина хлорной кислотой в ледяной уксусной кислоте в присутствии индикатора кристаллического фиолетового, и спектрофотометри- ческий, основанный на измерении разности спектров поглощения в кислой и щелочной среде.

Однако этими методами невозможно определять количество бензофурокаина в биологической жидкости из-за низкой чувствительности и отсутствия специфичности способов определения, так как в ультрафиолетовой области поглощается огромное количество органических веществ, присутствующих в биологических жидкостях.

Целью изобретения является создание возможности определения препарата в биологической жидкости.

Поставленная цель достигается экстракцией бензофурокаина из биологической жидкости спирто-хлороформной смесью, очисткой тонкослойной хроматографией и флуориметрическим определением в среде диэтиламин-пентанол-гидроксид калия.

Экстракцию бензофурокаина из биологической жидкости проводят следующим образом.

К 1 части плазмы крови (1 мл) прибавляют 5 частей спирто-хлороформной смеси (соотношение 1:1) и встряхивают 5 мин, после чего центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин, отбирают спирто-хлорофор- минный экстракт, к остатку прибавляют еще 5 частей спирто-хлорформной смеси и повторно экстрагируют и выпаривают на водяной бане при 60-80°С досуха. Сухой экстракт растворяют в 0,1 мл воды и дозаторы наносят 0,05 мл на хроматографическую пластинку Силуфол фирмы ЧССР и хрома(Л

С

vi

к

о VI

тографируют в системе растворителей гек- санметиловый спирт-диэтиламин (соотношение 8:1:1), проявляя хроматограмму в ультрафиолетовом свете.

Способ экстракции охарактеризован в табл.1.

Из данных табл.1 видно, что способ экстракции обеспечивает извлечение основной части количества бензофурокаина.

Другие органические растворители да- ют значительно меньшую степень экстракции бензофурокаина (табл.2), что делает невозможным их применение для аналитического определения его в биологической жидкости.

Далее пробу, содержащую бензофуро- каин, очищают хроматографией в тонком слое сорбента. При проявлении хроматог- раммы в ультрафиолетовом свете бензофу- рокаин обнаруживается в виде зеленого пятна с ,33. После хроматографирова- ния пятно бензофурокаина очищают вместе с адсорбентом и проводят флуориметриче- ское определение препарата в среде диэти- ламин-пентанол-гидроксид калия. В связи с этим исследованы параметры флуоримет- рического определения бензофурокаина.

Из данных табл. 3 видно, что максимум флуоресценции достигается при длине вол- ны возбуждения 365 нм и длине волны испускания 490 нм.

Также была изучена зависимость интенсивности флуоресценции от количества бензофурокаина в пробе (табл.4).

Из данных табл.4 видно, что линейная зависимость флуоресценции сохраняется в пределах от 1 до 100 мкг препарата в пробе.

Воспроизводимость предлагаемого способа определения бензофурокаина была изучена при параллельном определении восьми проб, содержащих по 20 мкг препарата (табл.5).

Пример 1.Реактивы и материалы: хлороформ, спирт (95%-ный раствор); пентанол - 1; диэтиламин; 10%-ный раствор гидрокси- да калия в пентаноле; Гексан; метиловый спирт; хроматографические пластины фирмы Силуфол (ЧССР). Код определения. К1 части плазмы крови (1 мл) прибавляли 5 частей спирто-хлороформной смеси (соотно- шение 1:1) и встряхивали 5 мин в колбе с притертой пробкой. Затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 мин, после чего отбирали спирто-хлороформный экстракт. К остатку прибавляли еще 5 частей спирто-хлороформной смеси и повторно

экстрагировали. Спирто-хлороформные экстракты объединяли и выпаривали на водяной бане при 60-80°С досуха.

Хроматографическую пластину предварительно активировали в термостате при 120°С в течение 15 мин.

Сухой экстракт растворяли в 0,1 мл воды и дозатором наносили 0,05 мл на хроматог- рафическую пластину. Рядом с пробой наносили стандартный раствор бензофурокаина для сравнения. В цилиндрическую емкость наливали 10 мл смеси растворителей гекса- нметиловый спирт-диэтиламин (соотношение 8:1:1 соответственно), в которую помещали хроматографическую пластину и закрывали емкость крышкой. После того, как фронт растворителя поднимался на высоту 80-100 мм, пластину вытаскивали и сушили при 120°С в течение 5 мин. Затем по раствору бензофурокаина для сравнения определяли пятно, соответствующее в пробе бензофурокаина (пятна должны быть на одном уровне от линии старта), которое очищали вместе с адсорбентом в пробирку. Туда же наливали 3 части диэтиламина (3 мл), 2 части пентанола (2 мд) и 0,02 части раствора гидроксида калия (0,02 мл). После перемешивания центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин.

После центрифугирования пробу переносили в кювету и определяли интенсивность флуоресценции на флуориметре при длине волны возбуждения 365 нм и длине волны испускания 490 нм. Количество бензофурокаина определяли по градуировочно- му графику, построенному по стандартным растворам бензофурокаина.

Пример 2. К1 части мочи (1 мл) прибавляли 8 частей спирто-хлороформной смеси (соотношение 1:1) и встряхивали 5 мин в колбе с притертой пробкой, затем центрифугировали при 300 об/мин в течение 30 мин, после чего отбирали спирто-хлороформный экстракт и выпаривали на водяной бане при 60-80°С досуха. Хроматографическую пластину предварительно активировали в термостате при 120°С в течение 15 мин. Сухой экстракт растворяли в 0,1 мл дистиллированной воды и дозатором наносили 0,05 мл на хроматографическую пластину. Рядом с пробой наносили стандартный раствор бензофурокаина для сравнения. В цилиндрическую емкость вносили 10 мл подвижной фазы , гексан-мети- ловый спирт-диэтиламин (соотношение 8:1:1), помещали хроматографическую пластину и закрывали емкость крышкой. После того как фронт подвижной фазы поднимался на высоту 80-100 мм пластину вытаскивали и сушили при 120°С в течение 5 мин. Затем

ющее бензофурокаина в пробе, которое вместе с адсорбентом очищали в пробирку, туда же наливали 3 части диэтиламина, 2 части пентанола и 0,02 части 10%-раствора КОН в пентаноле. После перемешивания центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин, далее пробу переносили в кювету и определяли интенсивность флуоресценции на флуориметре при длине волны возбуждения 365 нм и длине волны эмиссии 490 нм. Количество бензофурокаина определяли по градуировочному графику, построенному на стандартных растворах бензофурокаина..

Использование предлагаемого способа позволяет повысить специфичность способа определения бензофурокаина, что даст возможность определять бензофурокаин в биологической жидкости, а также более глубоко изучать влияние препарата на биоло-

гические объекты (построить фармакокине- тические препарата на биологические объекты (построить фармакокинетические графики, количественно оценить биодоступность бензофурокаина, определить возможные метаболиты).

Формула изобретения Способ опредедления бензофурокаина, отличающийся тем, что, с целью определения препарата в биологических жидкостях, биологическую пробу экстрагируют спирто-хлороформной смесью, затем полученный экстракт подвергают тонкослойной хромотографии в системе растворителей гексан-диэтиламин-метанол и определяют препарат флуориметрически в среде пентанол-диэтиламин-едкое кали при соотношении ингредиентов, соответственно равном 2:3:0,2, при длине волны возбуждения 365 нм и длине волны эмиссии 490 нм.

Таблица

Использование: фармацевтическая химия, биохимические методы исследования для количественного определения бензофу- рокаина в крови, моче и других биологических жидкостях, Сущность изобретения : биологическую пробу экстрагируют спирто-хлоро- формнойсмесью.Экстракт хроматографируют в системе растворителей гексан-диэтиламин-метанол. Содержание препарата определяют флурометрически при длине волны возбуждения 365 нм и длине волны испускания 490 нм. Среда для определения: пентанол-диэтиламин-едкое кали при их соотношении 5-3:0,2. 5 табл.

Примечание: раствор плазмы, содержащий бензофурокаин, готовили следующим образом к 1 мл плазмы крови добавляли 0,02 мл раствора с известным содержанием бензофурокаина и проводили экстракцию.

25

Таблица2

Примечание: в пробе содержится 40 мкг бензофурокаина, определения проводили на

флуориметре БИАН-130 М, в качестве регистрирующего прибора использовали зашунтированный цифровой вольтметр с сопротивлением шунта 10 кОм.

Примечание: Ер- единица флуоресценции раствора бензофурокаина, Ек - единица флуоресценции контроля (раствора, не содержащего бензофурокаина).

Таблица4

Таблицаб