Способ получения 21-ацетата 6 -фтор-16 ,17 -изопропилидендиоксипрегна-1,4-диен-11 ,21-диол3,20-диона Советский патент 1977 года по МПК C07J5/00 A61K31/57 

Ферментацию при этом можно проводить путем црдбной подачи стероида в растворе диметипформамииа при конечной концентрации его в среде 2%. Это дает возможность поддерживать исходный стероид в течение трансформации в растворенном виде, что обеспечивает его наиболее полную трансфсфмацию.

Гидроксилироваиие и дегидрирование целесообразно вести без постадийного выделении промежуточного продукта по совмещенной схме, что позволяет использовать гидроксилирующий и дегидрирующий микроорганизмы в единой ферментационной стадии, поскольку процессы протекают в одном и том же annaparg на одной и той же исходной среде.

Предлагаемый способ позволяет получить с удовлетворительным выходом (50%)/и за которое суммарное время трансформации (з 25-35 час вместо 129 час в известном способе) 21-ацетат 6оС-н})тор-16оС,17оСп1зот)опилидвн)ак6ксйпрегна-д,4-диен-11;0( «21-яиоп-Э,2С -диона, пригодный для следующих стадий синтеза синалара.

Трансформирующие культурй выращивают, раздельно на средах, содержащих углеводы, органические источники азота и минеральные соли. Процесс превращения исходного стеро|Нда осуществляют последовательно: сначала проводят процесс гидроксилирования при гриба Т. о г chid is , затем по окончании трансформации культуральную жидкость, отделенную от мицелия, стерилизуют, охлаждают и инокулируют культурой C.SimpPex или M.gPobiforme N« 193. Стероид перед подачей растворяют в диметилформамйдё и 2,5%-ный раствор его добавляют к выросшему мицелию дробно двумя порциями.-Конечная концентрация стероида в среде 0,5 г/л, димео лформамнда в среде 2%. По окончании процесса деги{фирования культуральную жидкость сеп ируют и экстрагируют хлористым метипевом.

Пример 1. Культуру грибаТогсНЫ1з выращивают на суслоагаре на флаконах в 2-3 недель при 26-28°С. Споры гриба смывают с псжерхности агара стирильной водой {1ОО МП) воды на флакон) и споровую суспензию с двух флаконов вносят в 7 л стерильной среды следующего состава: глюкоза ЗО г, кукурузный экстракт 5 г (сухой вес), пептон 3 г, гфожжевой автолизат 3 г, KHjjPO 5 г, водопроводная водаЮООмл; рН 6,8-7,2. Первый инокулят выращ1;вают в стеклянном ферментере емкостью Юл при подаче воздуха 0,5 л/мин, перемешивании (5ОО об/мин), температуре 26-28°С. Через сутки инокулят переносят в 120 л среды указанного состава.

Трансформирующую культуру выращивают в аппарате из нержавеющей стали емкостью 2ОО л при подаче воздуха 0,5 л/мин, перемешивании {800 об/мин) и температуре 262в°С. Через 2О час роста вносят первую порцию (ЗО г) (} гор-16с ,.-изoпpoпилидeндиoкcш1peгн-4 е№-21-ол-3,2С -диона в 12ОО мл диметилформамида. Вторую такую же порцию стероида вносят через 5 час после первой (общее количество стериода 60 г в 24ОО мл диметилформамида). Трансформацию проводят при том же режиме, что и выращивание культуры. Продолжительность процесса гидроксилирования 15-2О 4acj она контролируется методом хроматографии на пластинках SiPufoB. При содержании исходного стероида не более 5% трансформацию прекращают, мицелий отделяют фильтрацией на друкфильтре, промывают 10-2О л воды, культуральную жидкость вместе с промывными водами возвращают в аппарат и стерипизуют 30 мин при 120°С. После стерилизации и охлаждения до ЗО°С в аппарат подают культуру C.SyfrtpPeii, выращенную следующим образом. Исходной культурой засевают матрицы с агаризованной средой следующего состава: пептонв г, дрожжевой автолизат 3 г, мясной бульон 150 мл.гидролизау казеина 4 г, глюкоза 1 г, йгар 20, г,воден проводная вода 1ООО мл. На матриде культуру выращивают в течение трех суток при 26-28°С, после чего сливают-1ОО мл сте|И1Льной воды. Бактериальную суспензию с двух матрацев (количество культуры 1-1,5,г по сухому весу) вносят в 7л стерильной среды выщеприведенного состава за исключением агара. Культуру выращивают в стеклянйЬм ферментере в тех же условиях, что и инокулят Тде he те Ра oi chidns , но при 29-32°С. Через сутки роста ее передают в аппарат для проведения процесса дегидрирования. Последний осуществляют в тех же условиях аэрации, что и процесс гидроксилирования, но при 2 9-32 °С. Продолжительность процесса дегидрирования 12-15 час. При содержании исходного стероида не более 3% трансформацию прекращают, культуральную жидкость подкисляют 10%-ным раствором серной кислоты и передают на сепарацию и экстракцию хлористым метиленом. Остаток после отгонки хлористого метилена растворяют в ледяной уксусной кислоте и ацетилируют по С-21 уксусным ангидридом в присутствии ацетата бария. Получают 32 г 21-ацетата 6,ел-фтор-16ос ,17оС -изопропилидендиоксипрегна-1,4-диен-11/5 j21-диол-3,2О-диона, т. пл. 27ll272°C (сразл.). + 92,36 (1%, СНСРз ), ё 317,5, 242.

Пример 2. Процесс трансформации стероида проводят, как в примере 1, но вмесго культуры C.5 HipEex используют купьтуpyM.g obiforme № 193. Процесс дегидрирования длится 15-18 час. Получают цепеБой продукт с теми же выходом и константами, «1ТО в примере 1. Формула изобретения 1. Способ получения 21-ацетата 6о ;-фгго1 -1вос, 17об -иэопропилидендиоксипрегна-1,4-дие -11/5 ,21-диол-3,2О-диона с использованием процессов микробиологического 11/5 -гидроксилирования бсс -фтор-16сзй ,17 -изотфопилидендйокс ипрегн-4-ен-21-оп- 3,2О-15 -диона и его 1,2-дегидрирования с последующим апетилированием в целевой продукт, отличающийся тем что, с целью 5 10 интенсификации процесса, 11/3-гидроксилирование проводят действием штамма Tied hehie Pa orchid i а к 1,2-двгидрироваиив проводят непосредственно с помощью штамма Mycobtaicte i им ЕбЬИоиже. 2.Способ по п. 1,отпичаютиЙс я тем, что ферментацию проводят путем дробной подачи стероида в растворе диметилформамида при конечной концентрации его в среде 2%. 3.Способ по п. 1, о т л и ч а ю m и я тем, что процесс ведут без постааийного выделения промежуточного продукте. Источники инфомации, принятые во внимание при экспертизе: 1 . Патент США № 3124571, кп. 260239.55, 10,.03.64