СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИДРОКОРТИЗОНА И АЦЁТАТА' Советский патент 1973 года по МПК C12P33/00 

1

Изобретение относится к микробиологическим методам .получения гормональных препаратов и касается спо-соба получения гидрокортизона и ацетата кортизона.

Известен Способ получения гидрокортизона и эпигидрокортизона, являющегося ис.ходным веществом для получения ацетата кортизона химическими методами, путем микробиологического превращения 21-ацетата вещества «S Рейхштейна при помощи микроорганизмов, выращенных ъ питательной среде, содержащей источники углерода, азота .и минеральные соли.

Однако этот способ весьма продолжителен и связан со значительными затруднениями при выделении чистых препаратов.

Цель изобретения - ускорение .и упрощение процесса.

Это достигается тем, что трансформацию осуществляют при помощи мицелия гриба Tieghemella orchidie, выращенного на среде, содержащей в качестве источника углерода дисахарид, например, сахарозу; исходный стероид вносят однократно в растворителе, например, этаноле; по завершении процесса трансформации гидрокортизон выделяют известными приемами; образовавщийся маслообразный осадок обрабатывают хлороформом и содержащиеся в нем стероиды превращают известными методами в ацетат кортизона.

Мицелий берут в количестве 5-6 г/л среды в пересчете на воздушно-сухой вес и в возрасте, соответствующем последней трети фазы экспоненциального роста и началу фазы затухающего роста. Этанол берут в количестве 3,8-3,9% к объему среды при концентрации исходного стероида 0,5 г/л.

Пример. Культуру гриба Tieghemella orchidis щт. 233 поддерживают при комнатной

температуре на скошенном сусле-агаре во флаконах. При пересеве гриб выращивают 12-14 дней при 26-28° С, а затем 6-8 дней при комнатной температуре. Споры гр.иба смывают с .поверхности агара 100 мл стерильной воды и споровой суспензией (в 1 мл 2,4-10 спор) из двух флаконов, засевают среду в фер ментере емкостью 32 л с 12-15 л среды ЛЬс, содержащей, г/л: 20 (сухой вес) кукурузного экстракта, 30,0 сахарозы, 1,0

NHlNOs; 3,0 (NH4)2HPO4; 0,2 MgSO.,; 0,04 FeS04-7H2O и 10 л водопроводной воды.

Среду стерилизуют при 0,8 атм 30 мин; рН после стерилизации 5,2-5,5. Культуру выращивают в течение 20-22 час, при 28° С и подаче воздуха 1,4 л на 1 л среды в 1 мин. Число оборотов .мешалки 150 обмин. Полученный инокулят в количестве 10-12 л вносят в ферментер емкостью 300 л со 120-130 л среды Мае и проводят вторую инокуляцию при том

же режиме ферментации. Через 18-20 час мицелий отфильтровывают и отмытый от литательной среды водой (рН 7,0-7,2) используют для процесса трансформации ацетата вещества «S. Рейхштейна, которую .проводят в том же фер|Менте. В качестве среды используют 110 л водопроводной воды, .в которую вносят 2,5-3,5 мг синтомицина, 5-6 г/л мицелия гриба и 55 г 21-ацетата вещества «S Рейхштейна в виде 0,05%-кого раствора в этаноле. Общее количество этанола в среде составляет 3,8-3,9%. Трансфюрмацию проводят при тех же условиях, что и выращ.ивание культуры гриба. Продолжительность процесса составляет 10-14 час и контролируется хроматографией на бумаге до исчезновения исходного вещества. Культуральную жидкость фильтруют, экстрагируют хлористым метилено, растворитель удаляют в вакууме, и растворяют остаток в 98 М.Л дихлорэтана. К раствору добавляют 98 мл 10% раствора хлористого кальция в абсолютном спирте и 196 мл воды, через 48 час (5° С) отфильтровывают юсадок. Такую очистку повторяют еще 2 раза и получают 32 г сольвата гидрокортизона (52,2% от теоретического количества). Для получения очищенного препарата полученный сольват растворяют в 3,2 л горячего этилацетата, обрабатывают углем, фильтруют, упаривают в вакууме до 100 мл и отфильтровывают. Выход очищенного препарата 26 г. После выделения сольвата гидрокортизона в объединенных маточных растворах отделяют дихлорэтановый слой, водный слой трижды обрабатывают этилацетатом, и из объединенного органического экстра1 та удаляют в вакууме растворитель. Остаток кипятят 10 мин с 50 мл хлорофор;ма и -через 24 час отфильтровывают 13,3 г вещества, содержащего, %: 47,7 эпигидрокортизона, 2,85 гидрокортизона .и 6-7 кортизюна. Осадок при 60° С растворяют в 65 мл ледяной уксусной кислоты, добавляют при 20° С 3,7 г ацетата бария и 29 мл уксусного ангидрида, выдерживают 5 час при 25-26° С, обрабатывают углем и при 0° С по каплям прибавляют 2 л воды. Смесь моноацетатов эпигидрокортизона отфильтровывают, «з фильтрата экстракцией хлористым метиленом выделяют дополнительное их количество и объединенный продукт (11,78 г) растворяют в 84 мл ацетона. Раствор фильтруют, добавляют при 25° С 15,8 мл раствора Килиони, через 30 лгын охлаждают до 20° С, выливают ори 0° в 850 мл воды, через 30 мин отфильтровывают .и сушат. Технический -продукт перекристаллизовывают из 170 М.Л спирта, получая 7,75 г ацетата кортизона (13,6% от теоретического количества). Пред м е т изобретения 1. Способ получения гидрокортизона и ацетата кортизона путем микробиологического превращения 21-ацетата вещества «S Рейхштейна при .помощи микроорганизма, выращенного в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения процесса, трансформацию осуществляют при помощи .мицелия гриба Tieghemella orchidis, выращенного на среде, содержащей в качестве источника углерода дисахарид, например, сахарозу, исходный стероид вносят однократно в растворителе, например, этаноле, это завершении процесса трансформации гидрокортизон выделяют известными приемами, о:браЗ0.вавшиЙ1Ся маслообразный осадок обрабатывают хлороформом, и содержащиеся в нем стероиды -превращают известными методами в ацетат кортизона. .2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что мицелий берут в количестве 5-6 г/л среды в пересчете на воздушно-сухой вес. 3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что мицелий берут в возрасте, 1соответст вующем последней трети фазы экспоненциального роста и началу фазы затухающего роста. 4.Способ -по п. 1, отличающийся тем, что этанол -берут в количестве 3,8-3,9% к объему среды при концентрации исходного стероида 0,5 г1л.