Способ получения 11 ,21-диоксистероидов Советский патент 1977 года по МПК C07J5/00 A61K31/573 

Изобретение относится к области усовер шенствования микробиологического способа получения 11 р) 21-диоксистероидов, при меняющихся в качестве лечебных препарато в фармацевтической промышленности. Известен способ получения 11 р, 21-ди оксистероидов общей формулы I СНоОН -атом водорода или фтора; -атом водорода; -гидрокдйльная группа, или R и RJ вместе составляют изопропилидендиоксигруппу, путем микробиологического гидроксилирювания 21-оксистероидов при помощи кульгури; TiegliemeFK0 Ofchidi, выращенной в аэрируемых условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, ааключаюшийся в том, что исходный стероид вносят в культуральную жидкость однократно в растворителе, например в этаноле l. Известно также использование для аналогичной цели культуры CaTvaEoria Eunata при внесении стероида в культуральную жидкость в виде мелкодисперсной суспензии 2, При этом концентрация стероида в культуральной жидкости не превышает 0,5-1 г/л. Повышение концентрации стероида при использовании мелкодисперсной суспензии затрудняется деструкцией стероида в процессе трансформации. Кроме того, размельчение стероида требует сложного аппаратурного оформления 3J. Процесс трансформации при таком способе введения стероида осложняется сильным вспениванием. Применение растворителей в связи с их токсичностью для тиикроорганизмов не лозволяет увеличивать концентрацию стероидов в культуральной жидкости. При обоих методах внесения стеровда лишьнезначительная часть находится в раст воренном состоянии (10-20%), что ограничивает скорость процесса. Целью изобретения является устранение недостатков известных способов, интенсификация процесса за Счет увеличения концентрации стероидов в процессе 11 (3-гидрокайли рования, повышения скорости реакции и упрощ ние процесса. Для этп,го производное 21-оксистероида вводят в культуральную жидкость в виде водного раствора натриевых солей кислых эфиров 21-оксистероидов формулы II CHpOR С 0 I ..Кч .чХХ) где R Rj и R имеют указанные значе ния; R - остаток натриевой соли янтарной или фосфорной кислоты (-COCH CHjCOONo или -PO(ONoi).j.Предлагается способ получения 11 ( -диоксистероидов формулы. 1 путем микробиологического гид;оксилирования при помощи культуры гриба такого, как T- e5hemeB8o( orchidiS , /выращенного в аэрируемых условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минерал ных солей, эаклкзчаюшийся в том , что исход ный стероид вводят в виде водного раствор натриевых солей кислых эфиров 21-оксистероидов формулы Н. По предлагаемому способу для процесса трансформации используют культуру T- e§hemetEoi orelji ie . Можно также использовать гриб CurvuEaria tanata. Трансформирующую культуру выращивают в аэрируемых условиях на среде, содержащей углеводы, органические источники азота и неорганические соли. К выросшему мицелию добавляют стероид в виде водного раствора. Трансформацию осуществляют на отмытом мицелии при концентрации стероида в культуральной жидкос ти 3-5 г/л, в пересчете на 21-о1ссистероЙД. По окончании процесса трансформации культуральную жидкость отделяют от мицелия и экстрагируют несмещивающимися с водой растворителями. Растворитель упаривают и целевой продукт выделяют известным способом. Использование для микробиологического получения 11 |Ь,21-диоксистероидов в качестве исходных соединений натриевых солей кислых эфиров 21-оксистероидов позволяет увеличить нагрузку стероида в 6-10 раз по сравнению с известными способами и довести ее до 3-5 г/л (в пересчете на 21-оксистероид), за счет чего достигается повышение производительности аппаратуры, упрощение и ускорение процесса производства. Воднорастворимые натриевые соли кислых эфиров формулы П получают этерификацией соответствующих 21-оксистероидов органическими и неорганическими кислотами, например янтарной или фосфорной кислотами по методике 4. Пример 1.К суспензии 20 г (О,О58 моля) кортексолона в 240 мл тетрагидрофурана, охлажденной до -4О С прикапывают расувор 29,2 г (0,16 моля) пирофосфорИлхлорида в 4О мл тетрагидрофурана в течение 15 мин. Смесь перемешивают при -40 С 3-3,5 часа до исчезновения кортексолона (тех). Затем прикапывают ЮОмл воды при температуре не выще О С в течение 15 мин. Тетрагидрофуран отгоняют в вакууме, к суспензии приливают 10О мл воды и охлаждают при 5 С в течение часа. Осадок отфильтровывают, промывают водой до рН 5 и после сушки получают 23,1 г (94%) 21-фосфатакортексолона 1, R-j ОН; R ротону Т.пл. 170°С (разложение); оС, + 112° (с 1; метанол); Е 359; 24О нм. Найдено, %: Р 7,37%; . Вычислено, Р 7,26%. 20 г 21-фосфата кортексолона растворяют в 1ОО мл метанола при 60 С. К охлажденному раствору при 1О С приливают 2Н спиртовой раствор едкого натра до рН 1О. Смесь охлаждают при -5 С в течение часа. Осадок отфильтровывают, промывают 2О мл cyxoix) хлороформа и 20 мл абсолютного этанола. После сушки получают 2О,5 г (92,5%),R R| Н; R, ОН; l PO( + iOO° тиллированная вода). Таким образом, выход динатриевой соли 21-фосфата кортексолона составляет 87%, считая на кортексолон.

Пример 2. Способом, описанным в примере 1, получают 21-фосфат 6-Л -фтор-16 Л , 171 -изопропилидендиоксипрегнен-4-ол-21-диона-3,20 l,R. F, . Rg и {«,,. - изопрорилидендиоксигруппа,

R; Р0( OH)jl с выходом 71,5%.

64

64 (с 0.5;СНзОН); Е 321,3; 236 нм.

Способом, описанным в примере 1, получают динатриевую соль 21-фосфата 6 Л 4})тор-16 вС, 17 -изолропилидеш1иоксипрегнен-4-ол-21-диона-3,20.

Пример 3. Суспензию 18 г кортексолона 1, R Rg Н, R ОН, ) и 14 г (3 моля) янтар ного ангидрида в 9О мл пиридина в токе аргона перемешивают 10 час. Затем раствор охлаждают и при 0-10 С в течение часа к смеси прибавляют 108 мл соляной кислоты, 90 мл воды и 9О г льда. После этого температуру првышают до 20 Си перемешивают в течение 3 час. Осадок отфильтровывают, промывают водой и после сушки получают 22,87 г гемисукцината кортексолона (1,F R R, ОН, R COCHgCHjCOOH) с тЬш. J93 195°С. Выход 95%; на пластинке .giguf о Е UV 254 в системе этилацетат/ циклогексан (4:6) при-просматривании в УФ-свете исходное не обнаружено.

После перекристаллизации из ацетона j т.пл. 195-19 7°С, 118,4°(1% этаноJia ).

К раствору 1,36 г бикарбоната натрия в 136 мл воды прибавляют 4,52 г гемисукционата кортексолона (т.пл. 193-195 С перемешивают в течение 2 час и используют на стадии трансформации.

Пример 4. 11р -Гидроксилирование динатриевой соли 21-фосфата кортексолона при помощи TieShemetfia oroliidis.

Культуру грибаT-ie liemeEEoi orctiidis выращивают на скошенном суслоогаре в пробирках в течение 2-3 недель при 26-28 С. Споры гриба смывают с поверхности агара 5 мл физиологического раствора и споровую суспензию в количестве 1 мл вносят в 1ОО мл стерильной среды следующего состава: глюкоза ЗЬ г, кукурузный экстракт 5 г (сухой вес), пептон 3 г, дрожжевой автолизат 3 5 г, вода водопроводная 1ООО мл; рЫ 6,8-7,2. Первый инокулят выращивают в конических колбах емкостью 0,75 л на круговой качалке 22О об/мин при 26-29 С. Через сутки

полученный инокулят в кол1гчестве 1О мл вносят в 15О мл средь( названного состава и проводят вторую инокуляцию при том же режиме,что и первую. Лорез 20-22 часа роста мицелий от 13 колб отфильтровывают, объединяют, промывают водой (рН 6,57 и ресуспензирузот в водопроводной воде комнатной температуры. Полученную водную суспензию мицелиг в количестве 195О мл разливают по 15О мл в Ki HHHecKHe колбы на 0,75 л, доведя предварительно рП до 7-7,2. В каждую колбу вносят 450 мг кортексолона (нагрузка 3 г/л) в виде водного раствора динатриевой соли 21-фосфата, для чего навеску соли 7,95 г (соответствующую 5,85 г кортексолона) растворяют предварительно в 65 мл воды. Трансформацию стероида вецут в тех же условиях, что и выращивание мицелия гриба. Контроль процесса осуществляют методом хро- , матографии на пластинках SiPufOt в системе метанол /хлористый метилен/ вода (5:95:0,5). Продолх ительность процесса 24-36 час. По окончании процесса трансформации культуральную жидкость отфильтровывают от мицелия, мицелий промывают водой, экстрагируют xnon«J)opMOM (1:1 по объему). Отгоняют хлороформ в в1акууме, остаток растирают с ЗО мп гексана.Осадок отфильтровывают и сушат. Все стероидов 5,3 г (87%), содержание гидрокортизона 65%.

Пример 5. 11|Ь -Гидроксилирование динатриевой соли 21-фосфата кортексолона при помощи CLirvuBofriof (.

А. Культуру гриба С. Bunoitaвыращивают в пробирке на скошенной агаризованной среде следующего состава: глюкоза 4 г дро гжевой экстракт -4 г, солодовый экстракт 10 г, агар 30 г, водопроводная вода 1ОО мл. Время выращивания 7-1О суток, температура 26-28 С. Споры гриба смывают 5 мл дистиллированной воды и споровую суспензию в количестве 2 мл вносят в 1ОО мл стерильной среды следующего состава: сахароза ЗО г, дроясжевой автолизат 2,5 г, NaNOj 2г (NH4)2HT04 - 3 г, 1 г, КСео,5 г, вода водопроводная 1000 мл; рН 6,0-6,1.

Первый инокулят выращивают в конических колбах емкостью 0,75 л на круговой качалке 160 об/мин при 26-28 С. Через ЗО час полученный инокулят в количестве 1О мл вносят в 150 мл среды названного состава и проводят вторую инокуляцию при тех же режимах, что и первую. Через 24часа роста мицелий используют для трансформации. Подготовку мицелия для трансформйции осуществляют как в примере 4. Для трансформации берут 4,9 г динатриевой соли 21-фосфата кортексолона, что соответствует 3,6 г кортексолона. Навеску растворяют в. 4О мл воды и распределяют в 8 колбах (нагрузка 3 г/л). Продолжительность процесса трансформации 24-36 час. По окончании процесса трансформации культуральную жидкость отфильт{ювывают от мицелия, дважды промывают по 15О мл воды и 4раза экстрагируют хлористым метиленом (1:1 по объему). После отгонки хлористого метилена на роторном испарителе остаток растирают с 20 мл н-гексана и фильтруют, на фильтре промывают 20 мл н-гексана. Получают сумму стероидов 3,О5 Г (81%), в которой содержится 62,5% гидрокортизона. Б, Выращивание культуры С. Cuncyta и процесс трансформации ведут по примеру 5А. Для трансформации берут 8,16 г динатриевой соли 21-фосфата кортексолона, что соответствует 6 г кортексолона, навеску растворяют в 80 колбах (нагрузка 5 г/ 26 час опыт заканчивается. Обработ ка такая же, как в опыте 5 А. Получают 3,9 г (7О%, считая на трансформироваьный стероид, с учетом возвращен ного) 21-фосфата кортексолона) суммы стероидов с 6О%-ным содержанием гидрокорти зона. После экстракции кул туральной жидкост . хлористым метиленом и выделения стероидо культурапьную жидкость подкисляют до рН разбавленной серной кислотой и трижды экс рагируют этилацетатом по 150 мл. После отгонки этилацетата 0,8 г 21-фосфата кортексолона. Пример. 6. 11 Р -Гидроксилирование натриевой соли 21-гемисукцината кортексолона при помощи otcliidis. Выращивание культуры, or chid is процесс трансформации 136 мл водяного раствора натриевой :;оли 21-гемисукцината (соответствует 3,6 г кортексолона) распре деляют в 8 колбах с культурой гриба (нагрузка 3 г/л). Продолжительность опыта 24-36 час. После обработки (пример 4) получают 3,3 г (87%) технического гидрокортизона содержащего около 63% гидрокортизона. Пример 7. 11 |Ь-Гидроксилирование натриевой соли 21-гемисукцината кор- тексолона при помощи Tie hetrjeEBaoroliidis. Выращивание культуры Т. o-nobidia и процесс трансформации осуществляют по примеру 5. Для трансфорк$ации 85 мл водного раствора натриевой соли 21-гемисукцината, соответствующих 2,25 г кортексолона, распределяют в 5 колбах с культурой гриба. Продолжительность трансформации 24-36 час. После соответствующей обработки получают 2,1 (89%) технического продукта, содержащего 65% гидрокортизона. Пример 8. 11 Р -Гидроксилироваие динатриевой соли 21-фосфата 6 фтор-1б jt, 17 оС -изопропилидендиокси регн-4-ен-21-ол-3,20-диона при помои Tie hetneeBa ofchjdii. Процесс трансформации ведут по примеу 4. В колбу вносят 15О г 6 е -фтор16сС, 17 ос -изопропилиЗ ндиоксипрегн4-ен-21-ол-3,20-диона (нагрузка 1 г/: виде водного раствора динатриевой соли 1-фосфата.. Получают 6о1-фтор-16 эС-17 ot-изопропилдендиоксипрегн-4-11 .(5, 21-диол-3,20-дион выходом 60-7О% по хроматографическому нализу культуральной жидкости. Формула изобретения 1. Способ получения -11 ft 21-диокситероидов обшей формулы где R - атом водорода или фтора; R. - атом водорода; К. - гидроксильная группа или R и RJ вместе составляют изопропилидендиоксигруппу, путем микробиологического гидроксилирования при помощи культуры гриба такогх), как Tte hemefta prchidis выращенного в аэрируемых условиях на питательной спаде, содержащей источники углерода, азота и минеральных солей, производных 21-оксистероидов в растворителе, отличающийся тем, что, с целью интенсификации и упрощения процесса, используют водный раствор натриевых солей кислых эфиров 21-оксистероидов общей формулы || ,

9 55511510

где R,R2 ъ указанные значе-2. Патент США № 3419470, кл. 2.60ния;195.51, 1968 г.

R -остаток натриевой соли янтарной илиз. Могильницкий Г. М., Кашеенко К. А.

фосзфорной кислоты-COCH2CH2COONa или-PO|bNa)j,.Особенности трансформации 21-ацетата вег1 г 1 5щества nS Рейхштейна грибом Т(ебЪетебtor

2, Способ по п. 1, отличающий-

с я тем, что в качестве гриба используютОГсЪ131$.Прикл. биохимия и микробиология,

Carvit o(Tia iancda .1973 г., вып. 3, т, 9, с. 380.

Источники информации, принятые во при экспертизе:4.Т. Miki и др., А pTiosphoryga-fcion of

1. Авторское свидетельство СССР steroids, Chem. and Phorm. Ъа&В.,1974 г.,

№ 370229, кл. С 12 1 13/ОО, 1973 г.V, 22, № 7. с. 1439.