Способ получения 11-оксизамещенных прегенен-4-диол-17 ,21-диона-3,20 или его производных Советский патент 1976 года по МПК A61K31/573 A61P5/24 

Среду стерилизуют в течение 20 мин при 120°С, рН среды после стерилизации 7,3-7,4.

Инокулятом является культура первой геперации, которую в строго стерильных условиях переносят в ферментер из расчета 0,6% от объема питательной среды в ферментере. Выращивание проводят в течение 24 час при температуре 33°С, скорости -перемешивания 400 об/мип, аэрации 0,7 л/л в 1 мин. Третью генерацию проводят в стеклянном ферментере с жидкой питательной средой, следующего состава: дрожжевой экстракт 2,5 г, сахароза 0,5 г Na2HPO4- 12Н2О 4,5 г, КНаРО 1,0 г, вода техническая 1,0 л, рН среды 7,0-7,1.

Культуру выращивают в течение 14 час при температуре 33°С, аэрации 0,7 л/л в 1 мин и скорости перемешивании 400 об/мин.

К полученной трансформирующей культуре добавляют дробно водную суспензию 40 г моноацетата вещества R в течение 21 час. Трансформацию проводят в течение 22 час при температуре 33°С, аэрации 0,2 л/л в 1 мин, скорости перемешивания 800 об/мин, рН 7,6-- 8,4, атмосферном давлении.

В качестве пеногасителя используют подсолнечное масло.

Контроль процесса трансформации осуществляют методом тонкослойной хроматографии на силикагельных пластинках Silufol UV-254.

По окончании процесса трансформации культуральную жидкость нагревают до температуры 80°С и выдерживают ее при температуре в течение 20-30 мин, затем охлаждают до 28°С.

В обработанную таким образом культуральную жидкость вносят мицелий Beauveria spp. Р/130.

Рабочую культуру Beauveria spp. Р/130 выращивают при 28°С в течение 9 дней в наклопном положении на плотной питательпой среде следующего состава: сахароза 20,0 г, NaNOa 2,0 г, К2НР04-ЗН2О 1,0 г, MgSO4-7H2O 0,5 г, КС1 0,5 г FeSO4-7H2O 0,01 г, агар белый вымороженный 30,0 г, вода дистиллированная до 1 л.

Культуру первой генерации выращивают в колбах Эрленмейера на жидкой питательной среде следующего состава: глюкоза безводная 20,0 г, пептон ферментативный 5,0 г, дрожжевой автолизат 5,0 г, КН2РО4 5,0 г, вода дистиллированная до 1 л.

Рабочую культуру суспендируют в дистиллированной воде и вносят в колбы в качестве посевного материала, выращивают в течение 48 час при температуре 28°С.

Культуру второй генерации выращивают в стеклянном ферментере на жидкой питательной среде, используемой для первой генерации. Инокулятом служит культура первой генерации. Инокулят в стерильных условиях вносят в ферментер из расчета 3% от объема питательпой среды в ферментере и выращивают в течение 24 час при температуре 28°С, аэрации 0,6 л/л в 1 мин, скорости перемешивания

800 об/мин, слабо положительном давлении.

Третью генерацию проводят в стеклянном ферментере на жидкой питательной среде того же состава. Культуру второй генерации в

стерильных условиях вносят в ферментер из расчета 7% от объема среды в ферментере.. Выращивают в течение 18-20 час при температуре 28°С, аэрации 0,6 л/л в 1 мин, скорости перемешивания 800 об/мип, слабо положительном давлении.

Культуральную жидкость фильтруют через тканевый фильтр. Отфильтрованный мицелий промывают 1-3 раза дистиллированной водой, отмывают из расчета 35-40 г хорошо отмытого мицелия на 1 л трансформирующей среды.

Отвешенный мицелий суспендируют в небольшом количестве воды и вносят в термически обработанную культуральную жидкость для трансформации содержащегося в ней вещества S Рейхштейна.

Трансформацию проводят в течение 18- 24 час при рН-6,0-7,5 температуре 28°С, аэрации 0,6 л/л в 1 мин, скорости перемешивания 700-800 об/мин и атмосферном давлении.

В процессе трансформации рН среды контролируют и поддерживают в указанных пределах 3%-пым раствором NaOH или 3%-ным

НС1.

Пеногашение осуществляют добавлением подсолнечного масла.

Процесс трансформации контролируют методом тонкослойной хроматографии на силикагельных пластинках.

Silufol UV-254.

После окончания трансформации выделяют 11-эпикортизол. Для этого отделяют мицелий от жидкой фазы фильтрацией на нутч-фильтре. Мицелий суспендируют в аппарате с мешалкой в 3 л воды при 30°С, перемешивают в течении 3 мин и отфильтровывают на нутчфильтре. Жидкие фазы объединяют и содержащийся в них целевой продукт экстрагирую трижды по 8 л этилацетатом в аппарате с мешалкой в течение 2 час, после чего смесь отстаивают в течение 1-1,5 часов до полного разделения фаз. Объединенный экстракт упаривают в вакууме при температуре 40°С до 0,5 л, кристаллизуют при О-5°С в течение 5-8 час.

Выделившийся кристаллический продукт отделяют фильтрацией на воронке Бюхнера, промывают этиловым эфиром (100 мл) до получения прозрачного фильтрата. Маточник снова упаривают в вакууме досуха. Остаток суспендируют в 150 мл этилового эфира, отделяют фильтрацией на воронке Бюхнера и присоединяют к основному веществу. Сушат продукт в вакуум-сушильном шкафу при температуре 60°С в течение 5 час. Получают

27,2 г 11-эпикортизола. 5 Формула изобретения Способ получения 11-оксизамещенных прегнен-4-диол-17а, 21-диона-3,20 или его производных путем микробиологической трансфер-5 мации мопоацетата вещества R в вещество S Рейхштейна культурой Corynebacterium mediolanum Р/383 с последующим проведением 6 процесса И-гидроксилирования культурами Beanveria spp. Р/130 или Curvularia lunata Р/132, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, раствор, содержащий вещество S Рейхштейна, нагревают до инактивации культуры Corynebacterium mediolanum Р/383, а затем вносят культуру, осуществляющую процесс 11-гидроксилирования.