Способ очистки оксидазы д-аминокислот Советский патент 1977 года по МПК C07G7/02 

I

Изобретение относится к способу очистки оксидазы D - аминокислот, применяемой в химической

промышленности для получения а-кетокислот, В частности пировинофадной кислоты.

Известен способ очистки оксидазы D-аминокислот ггутем двукратного хроматографического разделения смеси белков, содержащей оксидазу D-аминокислот, на колонке со смесью геля фосфата кальщ(я с целлюлозойс последующей перекристаллизацией белка в присутствии сульфата аммония, растворением, хроматографировапием на колонке с гелем Сефа,иекса Gx 75 и повторной перекристаллизацией.

Однако известный способ труд1)емок, д;штелен и связан с ис ил1ьзованием хрома тог рафических носителей, которые мало ус7ойч1шы к действию тепла и давления и легко разрупкпогся при загрязнении микроорганизмами, по не позволяет применять его н 111)пм1 ппленньгл маспдгабах.

С пе.чыо унропюния пропесса предлагается смесь белкои наносить на минеральный носитель, соде 1жа1ний алкилкси;гнльн1)111 остаток, замеп{енHbiii rpyinioii ((юрмулы

-NH (СН, ) ,- NH- ((II. ); Vf00 l

И проводить отделение оксидазы в среде этиленгликоля, предпочтительно при концентрации этиленгликоля 5-35 об. %.

Минеральный носитель состоит из окисей, гидроокисей или других нфаствсримых и пористых минеральных соединений, на которых привиты замещенные или незамещенные группы галоидалкилсилана.

Для модифика1Ц1и носителя замещают галоид, содержащийся в носителе, остатком формулы -NH- (СН, ) , -NH-(CH) Г{ У-СООН. В зтом случае обрабатывают носитель, заме1ценный галоидалкилсиланом, соединением-формулы

NHj-(CH,)3-NH-(CHj/ y:OOC, Н, по любой известной методике, вт 3стностив суспензии при кипении, и проводят гидролиз в присутствии любой концетр1)ованной кислоты, в особе шости соляной.

Для очистки оксидазы D-аминокислот хроматофафическую колонку заполнялсп модифипиpOBainibiM носителем, суа1е1ц фоваш{ым в буфере, имеющем рН, при котором не происходит инактивации фермента, и чере з колонку пропускают смесь белков, содержащую оксш1азу и llaxoдяи yюcя в буферном pacTBOj)e. Колонку промывают водой для

удаления неактивных белков, а затем вводят рас твор этшюнгликоля о концентрацией менее 50 об. %. Практически активность очшценного фермента равна первоначальной активности смеси белков.

Применлемьк реагенты могут быть получена известными способами.

П р и м е р. К 230 мл перемешиваемого водного раствора серной кислоты (-120 г/л) добавляют по каплям водный раствор силиката натрия (220 г/д SiO,), при рН 3,8 добавление силиката натрия пре1фащают, добавляют 2 капли алкилсульфонат натрия, выливают полученный золь в 8 л сильно п емешиваемого трихлорэтилена, наблюдая осаждение шариков гидрогеля, добавляют 1 л аммиачной воды (рН 9) и фильт{ юг.

Шарики промывают 33 раза 0,1 н. соляной кислотой и водой. Полученньш гидрогель содержит ВО % воды.

120 г гидрогеля, 15 г триэтоксииодпропилсилана и 200 мл бензола нагрев аня до кипения и в течение 3 час удаляют 95 мл воды (азеотропная отгонка). После охлаждения о азовавшкйся продукт обезвоживают, промьшают ацетоном, сушат и получают привитой кремнезем с ipynnaiviH иодпропилсилана, содержащий 2,1 вес. % иода. Размер частиц менее 200 мк, уд. поверхность 425 , объем пор 1,1 мл/г.

11 г привитого кремнезема вводят в 25мл бен- зольного раствора содержащего 1,5 г соединения

H,N-(CH,),-NH-(CHJ,

СООС.Н,

нагревают дисперсию 24 час с офатным холодильником, охлаждают, отфильтровьтают кремнезем, промьшают его этанолом (удаление непрореапфовавшего соединения) до обесцвечивания растворителя и затем водой.

Полученный продукт и 50 мл 4 н. соляной кислоты кипятят 24 час, охлаждают, отфильтровывают шарики, промывают их дистиллированной водой и добавляют буферный раствор пирофосфата до рН 8,6. Фиксированное количество соединения 1 г.

В хроматографиюскую колонку загружают 11 г полученного привитого модифицированного кремнезема и со скоростью 9 мл/час пропускают 5 мл 0,2 М буферного раствора пирофосфата (рН8,5), . содержащего 150мг смеси белков, включакнцей оксидазу D-аминокислот.

Для раствора, выходящего из колонки, определяют ферментативную активность добавления а-аланина в 0,2 М буферном растворе пирофос0 фата (рН 8,3) и динитрофеиилгидразина с последунщим спектрофотометр1фованием при 440 им. I CTBOp не обнаруживает активности, что указьшает на полную задержку оксидазы на носителе.

Затем через колонку с той же скоростью пропускают воду до тех пор, пока спектрофото6метр ироваиие раствора, выходящего из колонки, при 280 им не подтвердит отсутствие неактивных белков.

Неактивные белки составляют 90 % от всего количества белков.

0

Потом через колонку со скоростью 9 мл/час пропускают 20 мл буферного раствора пирофосфата (рН-8,5), содержащего 30 об.% зтиленгликоля, и определяют ферментативную активность элюата. Активность злюата составляет 90 % от активности исходной смеси. Коэффициент обогащения МОО.

Формула изобретения

1. Способ очистки оксидазы D-аминокислот путем нанесения смеси белков, содержащих указанную оксидазу, на носитель с последующим отделением фермента от носителя, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве носителя применяют минеральный носитель, содержащий алкилсилильный остаток, замещенный группойNH-(СН J 3-NH-(СН,) j.- /V-COOH,

а отделение фермента проводят в среде этиленгликоля.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что применяют этиленгликоль при концентрации 5-35 об.%.