Способ получения 7-метоксицефалоспори-HOB или иХ СОлЕй Советский патент 1981 года по МПК C07D501/36 A61K31/546 C12P35/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 7-МЕТОКСИЦЕФАЛОСПОРИНОВ ИЛИ ИХ СОЛЕЙ -1,3,4-тиадиазол-2-ил и 1,3,4-тиадиазол-2-ил или 1-метилтетразол-5-ил. Катионный остаток М для образования соли цефалоспорина означает неорганический или органический остаток. Примерами неорганического остат ка служат щелочные металлы {натрий и калий), щелочноземельные металлы (кальций, магний и барий), тяжелые . металлы (железо, медь и цинк). Примерами органического остатка служат основания, образующие четвертичные соли, как соли аминов (.триэтиламин, диэтаноламин, пиперидин и морфолин). Штамм рода Trigonopsis выбирают из типовой культуры или вьщеляют из почвы. Для увеличения активности образования вещества формулы I можно применять мутанты, получаемые из ука занных штаммов. В качестве микроорга низма, обладакйдего активностью энзим ного окисления О-аминокислоты, можно указать на Trigonopsis variabiMs. Для получения вещества I с помощью микЕЮОрганизма, имеющего энзимную ак тивность по окислению D-аминокислоты предпочтительно микроорганизм сначал культивировать, а полученный мицелий или обработанный мицелий подвергать взаимодействию с цефалоспориновым со единением формулы II, В качестве мет да культивирования с получением мицелия обычно применяют аэробное куль тивирование , еа$е лучше применять жид кое культивирование при перемешивани и при аэрации. В этом прюцессе приме няют обычную культуральную среду. Мо но применять искусственную, полуискусственную или природную культураль ные среды. В качестве источника угле рода в такой среде применяют глюкозу сахарозу, Манитол, глицерин, декстри крахмал и растительное масло, в качестве источника азота применяют мяс ной экстракт, пептон, глютеновую муку, муку из хлопковых семян,соевую муку, арахисовую муку, рыбную муку, кукурузную барду, сухие дрожжи, дрож жевой экстракт, сульфат аммония, нитрат а №юния, мочевину и другие ор ганические или неорганические азотсодержащие соединения. При необходимости в культуральную среду добавляют металлические со ли (сульфаты, нитраты, хлориды, карбонаты, фосфаты натрия, калия, магния, кальция, цинка и железа). Кроме того, при необходимости в культуральную среду добавляют метионин., цистеин, цистин, метилолеат, силиконовое масло, поверхностно-активное вещество в качестве промотора образования или противовспенивателя. Хорошие результаты получают при рН культуральной среды около 4-10, лучше 5-6. В частности, если в культуральной среде содержится 0-(или DL-)аминокислота, например О-(или 01-)ме тионин, 0-(или 01-)эланин, 0-(или DL -) валин, то достигается высокая активность энзима, окисляющего 13-аминокислоту. Температура культивирования обычно составляет 18-37°С, лучше около ЗЭ°С. Длительность культивирования меняется в зависимости от условий культивирования, в частности используемого аппарата для культивирования, состава культуральной среды, температуры культивирования, но предпочтительно заканчивать культивирование, когда активность окисляющего D-аминокислоту энзима становится максимальной. Обычно для этого требуется 2-10 дней. Полученный таким образом мицелий или обработанный мицелий применяют для окислительной реакции О-аминокислоты в исходном веществе формулы II. Обработанный мицелий означает мицелий, который превращен в форму для продуцирования вещества I путем увеличения активности окисляющего D-аминокислоту энзима применением его соответствующей обработки. Например, активно окисляющий В-аминокислоту энзим обычно существует в мицелии, и обработанный мицелий означает освобожденный от клеток экстракт, с помощью физической или химической обработки мицелия, собранный из продукта культивирования штс1мма, продуцирующего окисляющий В-аминокислоту энзим. Промывают и частично или полностью очищают окисляющий D-аминокислоту энзим, полученный из несодержащих клеток экстракта путем применения методов разделения и очистки энзимов, активированный мицелий, полученный комбинацией частично или полностью очищенного окисляющего ТУ-аминокислоту энзима, соединяют с водонерастворимым полимером или неорганическим носителем физическим или химическим методом и получают твердый активатор окисляющего Б-аминокислоту энзима или мицелия, затем активатор или мицелий подвергают активирукяцей обработке. Получение и циркуляция указанного растворимого энзима практически ограничены, но применение нерастворимого энзима, например активированного мицелия, удобно для промышленного применения, поскольку его можно легко выделить и применять повторно. Активирующую обработку мицелия проводят путем нанесения мицелию слабого повреждения в такой степени, чтобы его не разрушить. Примером такой активирующей обработки служат: метод, по которому мицелий замораживают до температуры ниже при рН около 3-4, затем размораживают;метод, по которому мицелий обрабатывают в ванне одним или несколькими органическими растворителями, например ацетоном, бутлнолом, 2-фонилэтанолом, ДИЭТИЛОВЕ ПИ эфиром, .толуолом/метод, по которому мицелий обрабатывают 0,1-10%-ньам раствором поверхностно-активного вещества, например катионным поверхностно-актив ным веществом ..(цетилтриметиламмонием, цетилпиридинием, цетилдиметилбензиламмоний галоидом), анионным поверхностно-активным веществом (до децилсульфатом, алкиларилсульфонато щелочного металла, дезоксихолатом натрия) или неионным поверхностноактивным веществом (монолауратом со битана, тритоном Х-100 в его водном растворе); метод, по которому мицелий обрабатывают разбавленным водным раство ром гидроокиси калия или гидроокиси натрия и метод, по которому мицелий суспе дируют в растворе с большим осмотическим давлением, например 2М растворе сахара, а затем раствор быстро разбавляют водой. На такую активирующую обработку сильно влияют разные факторы (напри мер, температура, длительность обра ботки, величина рН, концентрация ре гента и другие), следовательно, необходимо подбирать условия активации .. Кроме того, когда действие каталазы, обычно присутствуквдей в мицелии, не ингибируется, то окислитель ное декарбоксилирование в конечный продукт Т становится неполным с обра зованием одновременно 7-(5-карбокси-5-оксовалерамидо)-7-метоксицефало споринового производного, ПЕ едставленного общей формулой 11Г Hooc-co-(CHi,,coNH -Ь-Г .. 1 А-MNj - lbR ° соон Для селективного получения вещес ва I желательно ингибировать активность каталазы. Примерами соответст вующих ингибиторов каталызы служат аскорбиновая кислота, З-амино-1,2,4 -триазол, азид щелочного металла (лучше азид натрия). Ингибитор можн добавлять в реакционную смесь во вре мя превращения исходного вещества11 в вещество I, или мицелий можно пред варительно обработать ингибитором перед применением. Количество азида натрия для этой цели составляет 1100 мм. Кроме того, каталазу в мицелии можно дезактивировать термообработкой мицелия до использования его в стадии превращения. При обработке мицелия при 40-60°С {лучше при в течение не менее 3 ч значительно снижается активность каталазы, но активность Т) -аминокислотной оксидазы сохраняется. Термообработку мицелия можно Осуществлять в водном растворе или в буферной суспензии. Особенно эффективно применять одновременную термообработку и обработку активирующим реагентом. Например, проводя активирующую обработку мицелия при 50 С в течение 4 ч с примеиением такого растворителя, как толуол, одновременно удается ингибировать каталазу и активировать мицелий. Реакцию энзимной смеси активированного мицелия и исходного вещества (.2) обычно ведут при рН 6-8. Желательно проводить реакцию при 3040 С. Длительность реакции зависит, главным образом, от активности энзима, но обычно она составляет 1-5 ч. Энзимная реакция проводится в аэробных условиях,, т.е. при аэрации воздухом или кислородом. Выделение продукта I можно вести при соответствующих условиях из ферментированного бульона исходного вещества формулы IT после удаления из него мицелия, т.е. образовавшееся вещество I можно легко выделить экстракцией растворителем или сорбцией ионообменной смолой. Например, реакционную продуктовую смесь подкисляют до рН 2,5, затем нужное вещество экстрагируют из этой смеси соответствующим органическим растворителем (этилацетатом, бутилацетатом, бутанолом). В этом случае лучшие результаты дает комбинация ионообменной смолы и экстракции растворителем. Соответствующими ионообменными смолаили являются жидкие аминовые анионообменные смолы. Целе&ой продукт можно также вьщелить с помощью твердой ионообменной смолы. В этом случае хороший растворитель можно выбрать путем предварительного опыта. Целевое вещество формулы I можно выделять не только в виде свободной кислоты, но и в виде его соли щелочного или щелочноземельного металла, соли органического амина. Примеры исходных соединений формулы I: 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-3-(5-карбоксиметилтио-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-тиометил-7-метокси-З-цефем-4-карбоновая кислота (А); 7-(5-амино-5-карбоксивалерамкдо)-3-С1-метил-1Н-тетразол-5-ил)-ТИО-. метил-7-метокси-3-цёфем-4-карбоновая кислота (В); 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3-(5-метил-1,3,4-тиадиаЗОЛ-2-ИЛ)-тиометил-З-цефем-4-карбоновая кислота (С) и 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-З-(1,3,4-тиадиазол-2-ил)-тиометил-З-цефем-4-карбоновая кислота (о). Примеры 7-метоксицефалоспориновых производных формулы (I), полученных

предлагаемым способом, и их свойства.

Пример 1.. 7-(4-Kapбoкcибyтиpaмидo)-3- (5-карбоксиметилтио-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-тиометил-7-метокси-3-цефем-4-ка1 боновая кислота (I)

ОСИ,

HOOC-(CH2 CONH-1(

а-Nxi Vu-ty О Т 2 S SCHXOOH. СООН

Исходное соединение А формулы Т,

1

где / S- S-CHiCOOHj Л-И

Физические и химические свойства.

Белый порошок, т.пл. 75-78°С. Легко растворим в метаноле и этаноле, растворим в воде, этилацетате, бутилацетате и бутаноле, плохо растворим Э других органических растворителях. Кислое вещество, дает отрицательную нингидриновую реакцию. Для УФ-спектр поглощенйя при определении в фосфорном буферном растворе 0,01 М и рН 6,5 максимум поглощения при ч 278 NMK. ИК-спектр поглощения (при определении в виде -таблетки КВг) при 3250, 2925, 1770, 1715, 1520 и 1380 см. ЯМР-спектр, определенный в TMS в качестве внутреннего стандар та в тяжелом метаноле, дает сигналы: величина (f (части/млн) 1,93 (2Н, мультиплет); 2,41 {4Н, мультиплет); 3,1 (ЗН, синглет); 3,37-3,81 (2Н, квартет, 3 18 Гц); 4,11 (2Н, синглет); 4,15-4,63 (2Н, квартет, О 14 Гц); 5,05 (1Н, синглет).

Элелюнтный анализ для С. Н м о S. 2Н20.1в лза V 4

Вычислено,%: С 35,99; Н 4,03; N 9,33.

Найдено,%: С 35,77; Н 3,81; N 9,-12.

Масс-спектр, определенный после гидролиза вещества 6 и соляной кислотой в течение 2,5 ч при 100°С, экстракции продукта этиловым эфиром, сушки продукта испарением и силилирования бис-триметилсилилацетамидом (БСА), дает фрагмент при м/е 276

(CH4), Si - ООС - (CHj)-COO-Si BtCH,) .

Конечное соединение представляет собой 7-метоксицефалоспориновое соединение, исходя из наличия, в частности, линий поглощения при 1770 см {циклический лактам) в инфракрасном спектре поглощения и из сигналов 3,5 (ЗН, синглет, 7-ОСН.,);

5.05(1Н, синглет, 6-СН); 3,37-3,81 (2Н, квартет, J 18 Гц, 2-СН2); 4,154.6(2Н, квартет, J 14 Гц, 3 - боковая цепь CHj,) и 4,11 имп/мин (2Н,

синглет, СНi цепи -S-CHj-COOH).Кроме того, имеются сигналы 1,93 (2Н, мультиплет, Ъ-СНд) и 2,41 имп/мин (4Н, мультиплет, о(., У-СНг), показывающие наличие 4-карбоксибутирамидо в спектре ЯМР, и масс-спектр производного данного целевого соединения, которое гидролизуется соляной кислотой и силилируется, дает фрагмент м/е 276, поэтому конечное соединение (I)

имеет указанную структуру, т.е.

5-амино-5-карбоксивалерамидогруппа в .7-ом положении исходного соединения подвергнута окислительному дезаминированию до 4-карбоксибутирамидогруппы.

5 Пример 2. 7-(4-Карбоксибутирамидо) -7-метокси-З- (1-метил-1Н-тетразол-5-ил)-тиометил-3-цефем-4-карбоновая кислота (II) ОСН

oHOOC-(CH,vcoNHp; j-N

оЛ-ГЧГ иХ,/

N

ссхзн

I

CHis

ИсТсодное соединение в формулы I ,

(

где Jj

f CHi

Физические и химические свойства. 0 Белый порошок, т.пл. 80-83 С. Легко растворим в метаноле и этаноле, растворим в воде, этилацетате, бутилацетате и бутаноле, плохо растворим в других органических растворителях, r натриевая соль легко растворима в воде. Кислое вещество, дает отрицательную нингидриновую реакцию. Для УФспектра в фосфатном буферном растворе 0,01 М с рН 6,5 максимум поглощения при 269 ммк. ИК-спектр определяют 0 в виде таблетки КВг при 3420, 2940, 1765, 1680, 1610, 1525 и 1390 см л ЯМР-спектр, определенный в TMS в качестве внутреннего стандарта в тяжелом метаноле, дает сигналы: величина 5 S (части/млн) 1,94 (21, мультиплет); 2,40 (4Н, мультиплет); 3,51 (ЗН, синглет) ;3,40-3,83 (2Н, квартет, 3 18 Гц); 3,99 (ЗН, синглет);4,17-4,50 (2Н, квартет, 3 14 Гц); 5,02 (1Н, синглет). Q Элементный анализ для . 2 Н 2 О .

Вычислено,%: С 37,79; Н 4,76, N 16,53.

Найдено,%: С 37,78; Н 4,75; N 16,41.

Масс-спектр, определенный после гидролиза вещества 6 н, соляной кислотой в течение 2,5 ч при 100°С, экстрагирования гидролизованного продукта этиловьои эфиром, сушки испарением и 0 силилирования БСА дает фрагмент при м/е 276

(СМз) Si-OOC-CH CH,CHJ CHJ-COO-Si(CH,). .

Конечное соединение представляет собой 7-метоксицефалоспориновое соединение, исходя, в частности,, из наличия линии поглощения при 1765 с (циклический лактам) в инфракрасном спектре поглощения и из сигналов 3, (ЗН, синглет, 7-ОСНз);5,02 (1Н, син глет, 6-СН); 3,99 (ЗН, синглет, 7-ОСНэ);5,02 (1Н, синглет, 6-СН); 3,99 (ЗН, синглет, N-CHa тетразола) 3,40-3,83 (2Н, квартет, 118 Гц, 2-СН2) и 4,17-4,50 имп/мин (2Н, квартет, J 14 Гц, 3 - боковая цепь СН).Кроме того имеются сигналы 1,9 (2Н, мультиплет, (Ь-СНт.) и 2,40 им /мин (,4Н, мультиплет, dL , j.), по казывающие наличие 4-карбокси6утирамидо в спектре ЯМР, и масс-спектр производного данного целевого соединения, гидролизованного соляной кислотой и силилированного, дает фрагмент м/е 276, поэтому конечное соединение имеет указанную структуру, т.е. 5-амино-5-карбоксивалерамидогруппа в 7-ом положении исходного соединения подвергнута окислительному дезаминированию до 4-карбоксибутирамидогруппы. - Пример 3. 7-(4-Карбоксибутирамидо) -7-метокси-З- (5-метил-1. -1,3,4-тиадиазол-2-ил)-тиометил-3-цефем-4-карбоновая кислоты (III) ОСИ, е HOOC-(CH2 -CONH- ( N-i( , Исходное соединение С формулы I, ИЗ Физические и химические свойства Белый порошок, т.пл. 95-99 С. Ле ко растворим в метаноле и этаноле/ растворим в воде, этилацетате, бути ацетате и бутаноле, плохо растворим в других органических растворителях Кислое вещество, дает отрицательную нингидриновую реакцию. Для УФ-спект ра в фосфатном буферном растворе 0,01м при рН 6,5 максимум поглощени при 273 ммк. ИК-спектр определяют в виде таблеток КВг при 3260, 2925, 1773, 1515 и 1375 ЯМР-спектр, определенный в качестве внутреннего стандарта в тяже лом метаноле, дает сигналы: величина cf (части/млн): 1,92 (2Н, мультиплет); 2,40 (4Н, мультиплет); 2,71 (ЗН, синглет);3,38-3,80 (2Н, квартет, Э 18 Гц);3,51 (ЗН, синглет)-, 4,17-4,64 (2Н, квартет, 3 14 Гц) и 5,03 имп/мин (1Н, синглет). Элементный анализ для Вычислено,%: С 41,79; Н 4,1; N 11,47. Найдено,%: С 41,89; Н 4,27/ N 11,17. Масс-спектр, определенный после гидролиза вещества 6 н. соляной кислотой при в течение 2,5 ч, экстрагирования продукта этиловым эфиром, сушки экстракта испарением и силилирования БСА дает фрагмент при м/е 276 (CH)Si-OOC-CH2CH2CH2-COO-Si (СН,),. Пример 4. 7-(4-Карбоксибутирамидо)-7-метокси-З-(1,3,4-тиадиазол-2-ил)-тиометил-3-цефем-4-карбоновая кислота (IV) НООС -(CHi -CONH N-N соон Исходное соединение D формулы I,, .N-N г-Де R-AtJ Физические и химические свойства. Белый порошок, т.пл. 88-92°С. Легко растворим в метаноле и этаноле , растворим в воде, этилацетате, бутилацетате и бутаноле; ограниченно растворим в других органических растворителях. Кислое вещество, дает отрицательную нингидриновую реакцию. УФ-спектр при определении в фосфатном буферном растворе 0,01 М при рН 6,5 дает максимум поглощения при 274 ммк. ИК-спектр определяют в виде таблетки КВг при 3250, 2925, 1770, 1515 и 1365 см-1 ЯМР-спектр; определенный в TMS в качестве внутреннего стандарта в тяжелом метаноле, дает сигналы: вели чина сГ (части/млн-) 1,92 (2Н, мультиплет); 2,40 (4Н, мультиплет); 3,393,83 (2Н, квартет, 3 18 Гц); 3,51 (ЗН, синглет); 4,24-4,73 (2Н, квартет 3 14 Гц)-, 5,03 (1Н, синглет) и 9,35 имп/мин (1Н, синглет). Элементный анализ для С.,Н.„Н, 0 си о . Вычислено,%: С 3,74; Н 3,96; N 11,59. Найдено,%: С 39,69; Н 3,87; N 11,32. Масс-спектр, определенный после гидролиза соединения 6 н.соляной ислотой в течение 2,5ч при 100°С, кстрагирования продукта этиловым фиром, сушки экстракта испарением силилированием его БСА дает фрагент при м/е 276 (СН), Si-OOC-CH2CH2CH.j-COO-Si (СN3)3. Конечное соединение представляет обой 7-метоксицефалоспориновое содинение исходя, в частности, из наичия линии поглощения при 1770 см циклический лактам) в инфракрасном пектре поглощения и из сигналов 3,51 ЗН, синглёт, 7-OCHi); 5,03 (1Н, синлет, 6-CH)j 9,35 (iH, синглет, СН иадиазола); 3,39-3,83 (2Н, квартет, J 18 Гц, 2-CHi) и 4,24-4,73 имп/мин 2Н, квартет, Т 14 Гц, 3 боковые

цепи CHi)-. Кроме того, имеются сигналы 1,92 (2Н, мультиплет, -CHj); и 2,40 НМЛ/мин (4Н, мультиплет, oL, y-CK-i) I показывающие наличие 4-карбоксибутирамидо в спектре ЯМР, и массспектр производного, полученного путем гидролиза конечного соединения соляной кислотой и силилирования продукта, дает фрагмент м/е 276, конечное соединение имеет указанную структуру, т.е. 5-амино-5-карбоксивалерамидогруппа в 7-ом положении исходного соединения подвергнута окислительному дезаминированию до 4-карбоксибутирамидогруппы.

В табл. 1 представлены результаты анализа соединений I-1V и А-0 тонкослойной хроматографией.

Таблица

0,44 0,37+

0,79 0,720,44 0,34+

0,81 0,640,42 0,44+

0,82 0,770,42 0,36+

0,81 0,657- (5-амино-5-карбоксивалерамидо)-3- С(3-п-оксифенил-2-метоксипропеноил )-оксиметил -7-метокси-З-цефем-4-карбоновая кислота0,66 0,67

7- (4-карбоксибутирамидо)-3- (3-п-оксифенил--2-метоксипропеноил )-оксиметил -7-метокси-3-цёфем-4-карбоновая . кислота0,67 0,67 Примечание. Разтельные системы растворителей: 1-Изопропаноя:бутанол:уксусная лота:вода (21:3:7:9 по объему). 2-Бутанол:уксусная кислота:вода (4:1:2 i по объему).

Определение проводят при помощи нингидриновой реакции, ультрафиолетового поглощения 2536 А или биоавтографии (применяют Proteus mirabilis).

Все соединения дают положительный результат в двух последних пробах, Результаты высокоскоростной жидкостной хроматографии приведены в табл. 2.

Таблица2

Соединение

Время удерживания

Исходное соединение А3 мин 14 с

Целевое соединение I13 мин 24 с

Исходное соединение В1 мин 53 с

5 Целевое соединение II

4 мин 54 с

Исходное соедине2 мин 55 с ние С

Целевое соединение III

11 мин 18 с

Исходное соединение D

1 мин 56 с

Целевое соединение IV

5 мин 28 с

7-(5-амино-5-карбоксивалерс1мидо) -3

-С(3-п-оксифенил-2-метоксипропеноил)-оксиметил -7-метокси-З-дефем-4-карбоновая кислота

5 мин 18 с

7- С4-карбоксибутирамидо)-3-(3-п-оксифенил-2-метоксипропеноил)-оксиметил -7-метокси-3-цефем-4-карбоно5 мин 55 с вая кислота

Примечание. Система 55 растворителей ацетонитрил: 0,1%-ная уксусная кислота (1:9 по объему}; рН 3,3. Для двух последних цефалоспориновых соединений отношение 2:8.

Действие соединенийВ, С, II и III ДО в условиях in vivo определяют следующим образом.

В организм здорорыхпяти мышей самцов вида ddy вводятпутем внутрибрюшинной инъекции Ю клеток Е. 45 coli NIHY, И через двачаса вводят

путем подкожной инъекции каждое.соединение и определяют процент выживания после пяти дней. Аналогичные эксперименты осуществляют с вводом 10 клеток Proteus mirabilis 1287. Каждая контрольная группа включает 10 мышей. Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3

В100100100 О40 20ОО

TI1001000060 20ОО

С808040 О100 2020О

Г1180600040 2020О Пример 5. а) В эрленмейеррвские колбы объемом 500 мл помещгйот по 100 мл куль туральной среды, содержащей (рН 6,0 20 г глюкозы, 4 г двузамещенного фо форнокислого калия, 1 г сульфата ма ния, 0,5 г хлористого кальция, 0,1 борной кислоты, 0,04 г молибдата аммония, 0,04 г сульфата марганца, 0,04 г сульфата цинка, 0,045 г суль фата меди., 0,025 г сульфата железа (II), 20 мкг биотина, 2 мг хлоргидр та тиамина, 1 г DL-метионина и 1000 мл воды. После стерилизации на каждую порцию среды производят посев штамма 1 FO 0755 Trigonopsis variab lis и проводят культивирование при втечение 72 ч. По окончании культивирования полу чают около 1000 мл бульонной культуры, которую подвергают центрифугированию при 4с и 2000 об/мин в течени 30 мин, собирают мицелий и суспендируют его в 500 мл буферного раствора с рН 8,1, содержащего 0,1 М пирофосфата; к полученной суспензии мицеЛия прибавляют 5 мл Tritona Х-100 и, с целью активирования мицелия, в течение 20-40 мин взбалтывают смесь при З7с, снова центрифугируют при и 2000 об/мин в течение 30 мин,отделенный активированный дважды мицелий промывают буферным раствором пирофосфата с рН 7-8, снова суспендируют в 100-200 мл буферного раствора с рН 8,1, содержащего О,1 М пирофосфата, получая суспензию активированного мицелия. б) в10млО,1М пирофОсфатного буферного раствора с рН 8,1, содержащего 0,026% азида натрия, растворяют 54,5 мг 7-f5-aминo-5-кapбoкcивaлepaмидo)-7-мeтoкcи-3-f 1-метил-1Н-тетразол-5-ил) тиометил-3-цефем-4-карбоновой кислоты и, после прибавления к этому .раствору 0,5 мл суспензии активированного мицелия, производят перемешивание его в условиях аэрирования на водяной бане е С температурой 33°С. Каждые 30 мин реакционную систему проверяют с помощью аппарата Хитачи для скоростной жидкостной хроматографии. Система растворителей ацетонитрил:

n 0,1%-ная уксусная кислота (объемное отношение 1:9). Эту проверку осуществляют для определения окончания реакции, так как время задержки исходного соединения 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-35 -(1-метил-1Н-тетразол-5-ил)-тиометил-З-цефем-4-карбоновой кислоты 1 мин 53 с, а время задержки конвертированной при этом за счет окисления 3)-аминокислоты 7-(4-кар6окси0 бутирамидо)-7-метокси-3- {1-метил-1Н-тетразол-5-ил)-тиометил-3-цефем-4-карбоновой кислоты 4 мин 54 с. По окончании реакции мицелии удаляют центрифугированием, а всплывающий слой отделяют путем доведения рН до 1,5-2,0 с помощью разбавленного водного раствора соляной кислоты и четырехкратного экстрагирования равными объемами этилацетата. Экстракт в этилацетате отделяют и снова экстрагиру от буферным раствором фосфата, имеющим рН 6,0. После этого буферный раствор доводят до рН 1,5-2,О с пом(ью разбавленной соляной кислоты и снова экстрагируют четыре раза равными объемами этилацетата. Этилацетат ные вытяжки соединяют, сушат безводным сульфатом натрия и выпаривают досуха, после чего продукт хроматографируют на колонке с микрокристаллической целлюлозой Avicel (торговая марка) и смесью растворителей н-бутанол: уксусная кислота: вода (объемное отношение 4:1:2) при промывании колонки той же смесью растворителей . Каждую фракцию проверяют на антимикробную активность по отношению к Proteus mirabilis, отбирая фракции, облсщающие этой антимикробной активностью, хроматографируют на тонкослойной пластине Avicel SF (торговая марка) и разделяют с помощью смеси растворителей изопропанол: н-бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 21:3: :7:9) и смеси н-бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 4:1:2). После этого фракции, характеризуемые ультрафиолетовым поглощением в области света 2536 А аппарата Манасулу (фирмы Манасулу Кагаку Когио К.К.) и R 0,81 и Л{ 0,64 соответственно, собирают, концентрируют и лиофилизуют, получая 35 мг чистой 7- (4-карбоксибутирамидо)-7-метокси-3-(1-метил-1Н-тетразол-5-ил)-тиометил-З-цефем-4-карбоновой кислоты.

Пример 6. В10млО,1М пирофосфатного раствора с рН 8,1, содержащего 0,026% азида натрия, растворяют 50 мг 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-З-(5-метил-1,3,4-тиадиаэол-2-ил)-тиометил-З-цефем-4-карбоновой кислоты, прибавляют к раствору 0,5 мл суспензии активированного мицелия Trigonopsis variabilis I FO 0755, полученного так же, как и в примере 1,а. Смесь перемешивают при нагревании на водяной бане при и аэрировании,, с целью окисления П-аминокислоты. Окончание реакции определяют тем же методом скоростной жидкостной хроматографии, как и в примере 16. Время задержки исходного соединения 7- (5-амино-5-карбоксива-. лерамидо)-7-метокси-3- (5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-ил) тиометил-З-цефем-4-карбоновой кислоты 2 мин 55 с, а время задержки полученной окислением D-аминокислотой 7- (4-карбоксибутирамидо)-7-метокси-З- (5-метил-1,3,4-тнадиазол-2-ил)тиометил-3-цефем-4-карбоновой кислоты 11 мин 19 с.

По окончании реакции мицелий удаляют при 4с, а всплывающий слой отделяют, доводят до рН 1,5-2,0 с помощью разбавленного раствора соляной кислоты и экстрагируют четыре раза равными объемами зтилацетата. Экстракты в этилацетате соединяют и экстрагируют буферным раствором фосфата, имеющШ4 рН 6,0. Этот экстракт доводя до рН 1,5-2,0 и снова экстрагируют четыре раза равными объемами этилаце тата, экстракты соединяют, сушат безводным сульфатом натрия и выпаривают досуха в вакууме. Используя колонку с микрокристаллической целлюлозой Avicei (торговая марка) и смесь растворителей н-бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 4:1:2, опта- ок продукта разделяют, применяя смесь растворителей того же состава, Затем отбирают фракции, обладающие активностью по отношению к Proteus mirabilis, хроматографируют их на тонкослойной пластине Avicel SF и проявляют соответственно смесью растворителей изопропанол : н-бутанол ; : уксусная кислота : вода (объемное отношение 21:3:7:9) и смесью н-бутанол : уксусная кислота : вода (объем кое отношение 4:1:2). Фракции, харак теризуемые поглощением в ультрафиолете 2536 X и R$ 0,82 и Rj 0,77 соответственно, собирают, концентрируют, лиофилизуют и получают 32 мг чистой 7- 14-карбоксибутирамидо)-7-метокси-З-С5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-ил) тиметнл-З-цефем-4-карбоновой кислоты.

Пример 7. В10млО,1М пирофосфатного буферного раствора с рН 6,1, содержащего 0,026% азида нат

рия, растворяют 50 мг 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо}-3-(5-карбоксиметилтио-1,3,4-тиадиазол-2-ил)тиометил-7-метокси-3-цефем-4-карбоновойкислоты и, после прибавления к раствору О,5 мл суспензии активированног мицелия, приготовленного таким же образом, как и в примере 1а, смесь перемешивают при аэрировании и нагревании на водяной бане при , чтобы осуществить окисление. Окончание реакции проверяют каждые 30 мин с помощью скоростной жидкостной хроматографии на аппарате Хитачи так же, ка и в примере 1б. При этом время задержки исходного соединения 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо )-3-( 5-карбоксиметилтио-1,3,4-тиадиазол-2-ил) тиометил-7-метокси-3-цефем-4-карбоновой кислоты 3 мин 14 с, а полученной в результате окислительного действия фермента -Б-аминокислоты 7 -(4-карбоксибутирамидо) -3-(5-карбоксиметилтио-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-тиометил-7-метокси-3-цефем-4-карбоновойкислоты 13 мин 24 с.

По окончании реакции мицелий удаляют центрифугированием при 4°с, а всплывающий слой отделяют, доводят до рН 1,5-2,0 разбавленной соляной кислотой и экстрагируют четыре раза равными объемами этилацетата. Экстракты в этилацетате собирают и снова экстрагируют буферным раствором фосфата с рН 6,0, экстракт доводят разбавленным раствором соляной кислоты в воде до рН 1,5-2,0 и повторно экстрагируют четырежды равными объемами этилацетата, экстракты соединяют, сушат безводным сульфатом натрия и выпаривают досуха в вакууме.

Остаток разделяют, используя смес растворителей н-бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 4:1:2 , на колонке с микрокристаллической целлюлозой Av/icel и тем же составом растворителей. Проверяют антимикробное действие каждой фракци по отношению к Proteus mirabilis, и активные фракции хроматографируют на тонкослойной пластине Avicel SF, проявляя разделение смесями растворителей изопропанол : н-бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 21:3:7:9 и н-бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 4:1:2). Затем фракции, характеризуемые поглощением света в ультрафиолетовой области 2536 А на приборе Манасулу и R 0,79 и 0,72 соответственно, собирают, концентрирую лиофилизуют и получают 30 мг чистой 7-(4-карбоксибутирамидо)-3-(5-карбоксиметилтио-1, 3,4-тиадиазол-2-ил-)тиометил-7-метокси-З-цефем-4-карбоновой кислоты.

Пример 8. а). Культуральную среду, содержащую, %: крахмала 1,0/ глюкозы 1,0) муки соевых бобов 1,5, экстракта дрожжей 0,5; кислого фосфата калия 0,1; сульфата магния 0,0 и хлористого натрия 0,3, помещают в 500 мл колбы Сикагичи, по 100 мл в каждую, и стерилизуют при в течение 20 мин. В каждую порцию производят посев штамма y-G192 Stre tomyces Organonensis , a затем культивируют, при 30°C в течение 48 ч. Другую культуральную среду поме1дс1ют в двухлитровые колбы Сикагичи, по 400 мл в каждую, стерилизуют при 120°С в течение 20 мин и производят посев 2-3%-ной бульонной культуры. Затем производят культивирование при 30°С в течение 24 ч и получают культуру для посева. Отдельно в два 100-литровых ферментатора вместе с 10 мл Adecanol (торговая марка), помещают по 60 л культуральной среды-, содержащей,%: крахмала 7; тонко размолотой клейковины 2,0; муки соевых бобов 2,0) глицерина 0,8; кислоты Казамино 0,1 сульфата железа (ИГ) 0,01 и 55 г гидроокиси натрия, 30 мин стерилизую лри 120°С и производят посев 800 мл полученной ранее культуры для посева Затем культивируют при 30 С в течение 24 ч. К полученному культурально му бульону прибавляют растврр 5-мер капто-1-метил-1Н-тетразол,приготовл ный на водном растворе гидроокиси натрия и стерилизованный при высоко давлении так, что концентрация тетр зола 0,05%. Культивирование ведут в течение 90 ч. По окончании культивирования бул он доводят до рН 2,О и к нему при п ремешивании прибавляют Radiolite. (торговая марка). Полученную смесь фильтруют на фильтр-прессе, фильтрат соединяют и получают 100 л смеси фильтратов,содержащих 100 мкг/мл 7- (5-с1Мино-5-карбоксивалерамидо -7-метокси-3-(1-метил-1Н-тетразол-5-ил)-тиометил-З-цефем-4-карбоиовой кислоты. б) Фильтрат доводят до рН 3/0, пропускают через колонку с 12 л Амберлита XAD-2 (торговая марка), ко лонку промывают 30 л воды и элюируют 30 л 50%-ного раствора ацетона в во де. Элюат концентрируют до объема 5,5 л, доводят его рН до 7,5 с помощью водного раствора гидроокиси натрия, удаляют нерастворимый осгщок и прибавляют к раствору 320 мл суспензии активированного мицелия штамма Trigonopsis variabitis I -OF 0755 Смесь 4 ч перемешивают при аэрировании, доводят до рН 1,5-2,0 с помощью водного раствора соляной кислоты и экстрагируют 4 раза равными объемами этилацетата; экстракты соединяют, по лученные 20 л экстракта в этилацетате снова экстрагируют 2 л буферного раствора фосфата, имеющего рН 6,0. Этот экстракт в фосфатном растворе доводят водным раствором соляной кислоты до рН 1,5-2,О и снова экст- рагируют четыре раза равными объемами этилацетата. Этилацетатные вытяжки соединяют и полученные в результате 8 л экстракта упаривают в вакууме досуха, получая 15 г неочищенного продукта, который подвергают хроматографированию на колонке с порошком целлюлозы так же, как это производится в примере 56 и получают 6,1 г 7-(4-карбоксибутирамидо)-7-метокси-З- Ц-метил-1Н-тетразол-5-ил)тиометил-3 -цефем-4-карбоновой кислоты. Пример 9. На культуральной среде, содержащей,г: глюкозы 5,0; пептона 1,0; кислого фосфата калия 1,0, сульфата магния 0,5; экстракта солода 10,0; DL-метионина 1,0 и 1000 мл воды при рН 6,0 производят посев штамма Trigonopsis variabilts I FO 0755, затем культивируют по методике примера 5а и получают 1000 мл бульонной культуры, которую центрифугируют при 2000 об/мин и , и получают мицелий. Мицелий суспендируют в 200 мл 0,1 М пирофосфатиого буфера с рН 8,1. Полученную суспензию . помещают, по 50 мл в каждую,500 мл колбу Эрленмейера, прибавляют по 5 мл толуола и в течение 1 ч проводят культивирование при . После этого активированный мицелий отделяют на центрифуге при 2000 об/мин в течение 30 мин, промывают с помощью центрифуги 200 мл О,1 М пирофосфатного буферного раствора с рН 8,1. Активированный мицелий снова суспендируют в 200 мл 0,1 М пирофосфатного буфера с рН 8,1, а суспензию нагревают при перемешивании на водяной бане при , чтобы инактивировать каталазную активность. 5 мл полученной суспензии активированного мицелия прибавляют к раствору 100 мг 7- (5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-З-(1-метил-1Н-тетразол-5-ил)тиометил-3-цефем-4-карбоновой кислоты в 20 мл 0,1 М пирофосфатного буферного раствора с рН 8,1;5 ч перемешивают при 33°С при аэрировании, обрабатывают смесь, как указано в примере 56, и получают 7-(4-карбоксибутирамидо)-7-метокси-З-(1-метил-1Н-тетразол-5-ил)тиометил-3-цефем-4-карбоновую кислоту. Пример 10. Мицелий, полученный из Trigonopsis variabilis по методике примера 5а, заморгикивают при температуре ниже -20°С больше 1 ч, а затем оставляют при комнатной температуре до размерзания и суспендируют в 200 мл 0,1 М пирофосфатного раствора с рН 8,1; 5 мл этой суспензии прибавляют к раствору 100 мг 7- (5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3-(1-метил-1Н-тетразол-5-ил)тиометил-3-цефем-4-карбоновой кислоты в 20 мл.0,1 М пирофосфатного

буферного раствора с рН 8,1, содержащего 0,026% азида натрия. 5 ч перемешивают при аэрировании и 33°С и после обработки по методике примера 56, получают 7-(4-карбоксибутирамидо)-7-метокси-З- (1-метил-1Н-тетраэол-5-ил) тиометил-3-цефем.-4-карбоновую кислоту.

Пример 11. К раствору 50 мг 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо )-3- (З-п-оксифёнил-2-метоксипропеноил)-оксиметил-7-метокси-3-цефем-4-карбоновой кислоты в 10 мл 0,1 М пирофосфатного буферного раствора с рН 8,1, содержащего 0,026% азида натрия, прибавляют 0,5 мл суспензии мицелия, полученного из Trigonopsis variabilis по методике примера 5а, затем смесь обрабатывают, как в примере 56, и получают 7-(4-карбоксибутирамидо) -3- (З-п-оксифенил-2-мет-т оксипропеноил)оксиметил-7-метокси-З-цефем-4-карбоновую кислоту.

Полученные, фракции подвергают тонкослойной хроматографии на Avicel с использованием смеси растворителей изопропанол : н-бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 21:3:7:9 и бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 4: :1:2) и собирают фракции с И 0,67 и 0,67 соответственно. Время задержки фракции в скоростной жидкостной хроматографии 5 мин 55 с применяетйя смесь растворителей ацетонитрил: :0,1%-ный водный раствор уксусной кислоты (объемное отношение 2;8). Продукт имеет отрицательную реакцию с нингидрином.

Пример 12. В10млО,1М пирофосфатного буферного раствора, содержащего 0,02% азида натрия, растворяют 54,5. мг 7- 5-амино-5-карбоксивалерамйдо)-7-метокси-З-(1-метил-1Н-тетразол-5-ил)тиометил-3-цефем-4-карбоновой кислоты. После прибавления 0,5 мл суспензии активированного мицелия,полученного по методике примера 5а, смесь перемешивают пр аэрировании и (водяная баня. Окончание реакции определяют по проверке через каждые 30 мин на аппарате скоростной хроматографии Хитачи система растворителей - ацетонитрил: 0,1%-ный раствор уксусной кислоты, объемное отношение 1:9К Время задержки исходного соединения 7- (5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3- (1-метил-1н-тетразол-5-ил)-тиометил -З-цефем-4-карбоновой кислоты iM 1 мин 53 с, а время, задержки 7-(4-карбоксибутирамидо)-7-метокси-З-(1-метил-1Н-тетразол-5-ил)тиометил-З-цефем-4-карбоновой кислоты, получаемой путем окисления D-аминокислоты, 4 мин 54 с. По окончании реакции мицелий отделяют центрифугированием при 4 С. Верхний слой отделяют, доводят до рН 1,5-2,0 с помощью разбавленного водного раствора соляной кислоты и четыре рааа экстрагируют равными объемами этилацетата. Экстракты в этилацетате соединяют и снова экстрагируют фосфатным буферным раствором с рН 6,0, эту вытяжку доводят до рН 1,5.-2,0 с помощью разбавленного раствора соляной кислоты, а затем экстрагируют снова четыре раза равными объемами этилацетата. Объединенные экстракты в этилацетате сушат безводным сульфатом натрия и упаривают .досуха. Остаток разделяют на колонке с микрокристаллической целлюлозой Avice, применяя смесь растворителей н-бутанол: уксусная кислота: :вода (объемное отношение 4:1:2). Проверяют антимикробное действие каждой фракции по отношению к Proteus mirabilis и отбирают фракции, обладающие активностью по отношению к этим микроорганизмам, подвергают их тонкослойной хроматографии на Avicel SF, используя смесь растворителей изопропанол : бутанол : уксусная кислота : вода (21:3:7:9) и смесь бутанол : уксусная кислота : вода (4:1:2). Собирают фракции, обладающие абсорбцией в ультрафиолетовой области света 2536 Д R 0,81 и 0,64 соответственно. Эти фракции соединяют, концентрируют и лиофил зируют, в результате чего получают 35 мг чисто 7-(4-карбоксибутирамидо)-7-метокси-3- {1-метил-1П-тетразол-5-ил)тиометил-З-цефем-4-карбоновой кислоты.

Пример 13. В10 мл хлороформа суспендируют 100 мг 7-(4-карбоксибутирамидо) -7-метокси-З-(1-метил-1Н-тетразол-5-ил) тиометил-3-цефем-4-карбоновой кислоты, к суспензии прибавляют 4 мл 1%-ного раствора диазометана в эфире, после чего 30 мин перемешивают при комнатной температуре. Полученную реакционную смесь промывают разбавленной уксусной кислотой и водой, сушат безводным сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остато подвергают колоночной хроматографии, с применением силикагеля и смеси расворителей бензол : этилацетат (объемное отношение 1:3). Требуемые фракции собирают, концентрируют при пониженном давлении и получают 80 мг метилового эфира 7-метокси-7-(4-метоксикарбонилбутирамидо)-3-(1-метил-1Н-тетразол-5-ил)тиометил-3-цефем-4-карбоновой кислоты.

ИК-спектр

KB см 1760 (лактам 0 )

Тмакс 1725 (сложный эфир,карбонил).

Пример 14. В10млО,1М пирофосфатного буферного раствора

с рН 8,1, содержащего 0,026% азида натрия, растворяют 50 мг 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-Ч-(5-метил-1,3,4-тиадилзол-2-ил)тиометил-З-цефем-4-карбоновой кислоты и, после прибавления к раствору 0,5 мл суспензии мицелия, приготовленного, как в примере 1а, из штамма Trigonopsis variabilis IFO 0755, смесь перемешивают при аэрировании и нагревании на водяной бане с температурой для окисления О-аминокислоты. Окончание реакции определяется по методу скоростной жидкостной хроматографии, описанному в примере 56, Время задержки исходного продукта 7-(5-амино-5-карбокси валерамидо)-7-метокси-3-(5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-ил) тиометил-3-цефем-4-карбонойой кислоты 2 мин 55 с, а 7-(4-карбоксибутирамидо)-7-метокси-З-(5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-ил) тиометил-3-цефем-4-карбоновой кислоты, получаемой путем окисления D-аминокислоты, 11 мин 18 с. По окончании реакции мицелий отделяют при 4°С, верхний слой собирают, доводят разбавленным раствором соляной кислоты в воде до рН 1,5-2,0 и четыре раза экстрагируют равными объемами этилацетата. Экстракты в этилацетате соединяют и сно экстрагируют буферным раствором фос фата с рН 6,0, экстракт доводят до рН 1,5-2,0 и повторно экстрагируют четыре раза равными объемами этилац тата. Экстракты в этилацетате соеди няют, сушат безводным сульфатом нат рия и упаривают досуха. Продукт раз деляют на колонке с микрокристаллической целлюлозой, используя смесь растворителей н-бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 4:1:2), как для растворенного продукта, так и для самой колонки. Пос ле этого фракции, обладающие антимикробной активностью по отношению к Proteus mirabitis, собирают, подвергают тонкослойной хроматографии на пластинах с Avicel SF и разделяю используя смеси растворителей изопропанол : бутанол : уксусная кисло та : вода {.объемное отношение 21:3: :7:9) и н-бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 4:1: :2), для получения фракций, отвечающих поглощению света в ультрафиоле товой части спектра 2536 А по прибо ру Манасулу (фирмы Манасулу Кагаку Когио К.К.) и R 0,82 и 0,77 соответственно. Полученные фракции соединяют, концентрируют, лиофилизуют и получают 32 мг чистой 7- (4-карбоксибутирамидо)-7-метокси-З-(5-метил-1,3 ,4-тиадиазол-2-ил)тиометил-З-цефем-4-карбоновой кислоты. Пример 15. В5мл буферног раствора 0,1 М пирофосфата QpH 8,1 содержащего 0,026% азида натрия, растворяют 25 мг 7-(5-амиио-5- карбоксивалерамидо) -3- (,5-карбоксиметилтио-1,3,4-тиадиазол-2-ил)тиометил-7 -метокси-З-цефем-4-карбоновой кислоты и после добавления к раствору 0,5 мл суспензии активированного мицелия, приготовленной как в примере 5а, смесь перемешивают при аэрировании и нагревании на водяной бане при 33°С для окисления D-аминокислоты. Течение процесса проверяют каждые 30 мин по скоростной хроматографии методом Хитачи, так же, как это производится в примере 5а, с целью определения окончания реакции. При этом время задержки исходного соединения х7- {5-амино-5-карбоксивалерамидо) -3-(5-карбоксиметилтио-1,3,4-тиaдиaзoл-2-ил)тиoмeтил-7-мeтoкcи-3-цeфeм-4-кapбoнoвoй кислоты 3 мин 14 с, а вещества, полученного окислением D-аминокислоты- 7-(4-карбоксибутирамидо)-3-(5-карбоксиметилтио-1,3,4-тиадиазол-2-ил)тиометил-7-метокси-З-цефем-4-карбоновой кислоты 13 мин 24 с. По окончании реакции мицелий удаляют центрифугированием при 4°С, отделяют верхний слой, доводят его до рН до 1,5-2,0 с помощью разбавленного водного раствора соляной кислоты и экстрагируют четыре раза равными объемами этилацетата. Соединенные экстракты в этилацетате снова экстрагируют буферным фосфатным раствором, имеющим рН 6,0. Экстракт, в котором доводят рН до 1,5-2,0 с помощью разбавленного водного раствора соляной кислоты, снова экстрагируют четыре раза равными объемами этилацетата. Последний экстракт соединяют и сушат сульфатом натрия, а затем упаривают в вакууме досуха. Концентрат разделяют, используя смесь растворителей бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 4:1:2) на колонке с микрокристаллической целлюлозой (А - торговая марка) и пользуясь тем же составом растворителей. Проверяя антимикробную активность каждой фракции, отбирают те фракции, которые обладают активностью по отошению к Proteus mirabilis, и подергают их тонкослойной хроматографии а Avicel SF, применяя растворители зопропанол : уксусная кислота : воа (объемное отношение 21:3:7:9) и месь бутанол : уксусная кислота : воа (объемное отношение 4:1:2), для оответствующего отбора фракций, бладающих поглощением в ультрафиоетовой части спектра 2536 А на приоре Манасулу и R 0,79 и 0,72 сответственно. Эти фракции концентриуют, лиофилизуют и получают 16 мг истой 7- (4-карбоксибутирамидо)-3(5-карбоксиметилтио-1,3,4-тиадиаол-2-ил)тиометил-7-метокси-З-цеем-4-карбоновой кислоты. Пример 16. В10млО,1М ирюфосфатного буферного раствора. рН 8,1, содержащего 0,026% азида натрия, растворяют 50 мг 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо -7-метокси-3-(1,3, 4-тиадиазол-2-ил)тиометил-З-цефем-4-карбоновой кислоты, прибавляют к нему 0,5 мл суспензии, полученной с мицелием Trigonopsts vaг iab i П S, согласно методике примера 5а, смесь перемешивают при аэрировании на водяной бане при 33 С, осуществляя окисление D-аминокислоты. Окончание реакции определяют с помощью того же метода, что в примере 56. Время задержки исходного продукта в скорюстной жидкос ной хроматографии 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3-(1,3,4-тиадиазол-2-ил)-тиометил-З-цефем-4-карбоновой кислоты 1 мин 56 с, а 7-(4-карбоксибутирамидо) -7-метокси-3-(1,3,4-тиадиазол-2-ил) тиометил-З-цефем-4-карбоновой кислоты, полу ценной при окислении 33-аминокислоты, 5 мин 28 с. По окончании реакции мицелий уда ляют при , верхний слой собирают значение его рН доводят с помощью разбавленного водного раствора соля ной кислоты до 1,5-2,0 и экстрагирую четыре раза равными объемами этилаце тата. Соединенные этилацетатные экст ракты экстрагируют буферным раствором фосфата, имеющим рН 6,0, а этот раствор снова экстрагируют четыре рд за равными объемами этилацетата, эк ракты соединяют, сушат безводным сульфатом натрия и упаривают в ваку уме досуха. Полученный продукт разделяют, при меняя смесь растворителей бутанол : : уксусная кислота : вода (объемное отношение 4:1:2) и колонку, наполнен ную микрокристаллической целлюлозой и смесью растворителей такого же состава. При этом отбирают фракции, об Лс1дающие антимикробной активностью п отношению к Proteus mtrabHis. Эти фракции подвергают тонкослойной хроматографии на Avicel SF и проявляют смесью растворителей изопропанол : б танол : уксусная кислота : вода (объ емное отношение 21:3:7:2) и бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 4:1:2), собирая фрак ции с поглощением в ультрафиолетовой части спектра 2536 А на приборе Мана сулу и Я{0,81 и 0,65 соответственно Собранные фракции концентрируют, лиофилизуют и получёиот 40 мг чистой 7- (4-карбоксибутирамидо) -7-метркси-3-(1,3,4-тиадиазол-2-ил)тиометил-3-цефем-4-карбоновой кислоты. Пример 17..В10млО,1М пирофосфатного буферного раствора с рН 8,1, содержащего 0,026% азида натрия, растворяют 50 мг 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3-(1,3,4-тиалиазол-2-ил)тиометил-3-цефем-4-карбоновой кислоты, после того, как к раство ру прибавят 0,5 мл суспензии активированного мицелия, приготовленной на Trigonopsis variabilis, таким же путем, как и в примере 5а. Смесь перемешивают при аэрировании и нагревании на водяной бане при 33°С для окисления и-аминокислоты. Окончание реакции определяют по методу скоростной жидкостной хроматографии. Время задержки исходного материала - 7-Х5-амино-5-карбоксивалерамидо) -7-метокси-З-(1,3,4-тиадиазол-2-ил)тиометил-З-цефем-4-карбоновой кислоты 1 мин 56 с, а полученного при окислении D-аминокислоты 5 мин 28 с. По окончании реакции мицелий удаляют при , а верхний слой отделяют, разбавленным раствором соляной кислоты в воде доводят его до рН до 1,5-2,0 и четыре раза экстрагируют равными объемами этилацетата, экстракты соединяют и снова экстрагируют буферным раствором фосфата с рН 6,0. Эти экстракты доводят до рН 1,5-2,0 и повторно экстрагируют четыре раза равными объемами этилацетата, после соединения которых их сушат безводным сульфатом натрия и упаривают досуха в вакууме. Продукт разделяют, применяя смесь растворителей бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 4:1:2) и колонку, наполненную микрокристаллической целлюлозной Avicel и смоченную той же смесью растворителей. При этом отбирают фракции, обладающие антимикробной активностью по отношению к Proteus mirabills. Эти фракции подвергают тонкослойной хроматографии на Avicel SF, применяя смеси растворителей изопропанол : бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 21:3:7:9) и бутанол : уксусная кислота : вода (объемное отношение 4:1:2) соответственно, и собирают фракции, обладающие поглощением света в ультрафиолетовой части спектра света 2536 А на приборе Манасулу. Фракции концентрируют, лиофилизуют и получают 40 мг чистой 7- (.3-карбоксибутирамидо) -7-метокси-3-(1,3,4-тиадиазол-2-ил)тиометил-З-цефем-4-карбоновой кислоты. Формула изобретения Способ получения 7-метоксицефалоспоринов или их солей формулы I HOOC-CCHaVCONH / -NNXA . Qу где 1 - азотсодержащая пяти- или шестичленная гетероциклическая груп;Па, 25 799 М - атом водорода или катионный остаток , образующий соль, отличающийся тем, что, на соединение формулы 11 ц СН CH-CCHnVtCHiVtONH-l-l иц рпп °° где Ким имеют указанные значения, 66826 аэробно воздействуют мицелием микроорганизма рода Trigonopsis, продуциpi«) окисляющий 15-аминокислоту энзим, или обработанным продуктом мицелия и выделяют целевой продукт в виде свободной кислоты или ее соли. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Патент Великобритании № 1321412, кл. С 2 А, опублик. 1973.