Способ получения производных борсодержащих пептидов Советский патент 1993 года по МПК C07K5/08 C07K5/06 C07K5/08 A61K37/02 

Rl-Z-NH-CH-BY HW,

t

где Ri - H, As, Bz, Bos, Bos-Leu;

R2 (CH2)nNH-C(NH)NH2, где n 3, 4;

Y - остаток пинаконового или пинанди- олового эфира;

HW-CeHsSOaH.HCl, HBr;

Z D или L-Phe, DPhe-Pro, DPhe-Phe, Ala-Lys, Pro-Phe, Ala-Phe, Gl.u-Phe, Ala-Glu, Glu-Gly, Gly-Leu-Ala, pyro-Glu-Phe, Val-Val, DVal-Leu, Lys-Pro, Leu-Thr, заключающийся в том, что амин формулы (II)

H2N-CHBY HW, .(CH2)nW гдеп 3, 4; W и W1 - CI, Вп;

Y - остаток пинаконового или пинаиди- олового эфира, вводят во взаимодействие с аминокислотой или пептидом формулы (111)

Ri-ZHDH. X значения Ri и Z указаны выше и полученный продукт формулы (IY) . R1-Z-NHCH-BY HW,

(CHa)nW1.. . значения Ri, Z, Y, W, W и п указаны выше, обрабатывают азидом щелочного металла с образованием соединения формулы (Y)

R -Z-NH-CH-BY HW,/

(сн2)п№- - значения Ri, Z, Y, W и n указаны выше, которое затем восстанавливают в присутствии органической или минеральной кислоты, предпочтительно бензолсульфокислоты, р образованием соединения (Yl) ;

R -Z-NH-CH-BY- HW,; : (CH2)nNH2 ; : .;. С значения R , Z, Y, W и n указаны выше, последнее подвергают взаимодействию с: цианамидом в низшем спирте при 50- 150°С. . г

В описаний изобретения используются следующие сокращения для аминокислотных остатков: :.

Ala L-аланин

Arg и-аргинин

Asn L-аспарагин

Asp L-аспарагиновая кислота

Cys L-цистеин

Gin L-глутамин.

Glu L-глутаминовая кислота

Gly глицин

His L-гистидин

lie L-изолейцин

Leu L-лейцин

Lys L-лизин

Met L-метионин

Phe L-фенилаланин

Pro L-пролин

Ser L-серин

Thr L-треонин

Trp L-триптофан

Tyr L-тирозин Val L-валин

Там, где прибавлен префикс D, упомянутые сокращения обозначают аминокислоту D-конфигурации. Там, где прибавлен префикс D или L, упомянутые сокращения обозначают то, что аминокислота может иметь или конфигурацию D, или конфигурацию L.

Используемый термин М-концевая за щитная группа относится к различным ами- ноконцевым защитным группам, используемым в синтезе пептидов. Примеры пригодных групп включают ацильную защитную группу, например ацетил (Ас), бензоил (Bz), или алифатические уретано- вые защитные группы, например третбуток- сикарбонил (Вое).

Приводимые далее в описании примеры

иллюстрируют конкретные варианты осуществления изобретения. Все указанные точки плавления не откорректированы. Все части приведены в весовых частях, а температуры указаны в °С. Химические сдвиги в результате спектроскопии протонного .ядерного магнитного резанйнса (ЯМР или ЯМР) указаны в дельта-единицах, частях на млн., исходя из внутреннего тетраметилсилано- вого стандарта. Многочисленные сокращёния, используемые в указанных примерах, имеют следующие значения: TFA - трифто- руксусная кислота; ОМР-М,К1-димётилфор- мамид; МС - масс.-спектрометрия; ТСХ - тонкослойная хроматография; оф-ТСХ-тонкослойная хроматография с обращенной

фазой. Сложноэфирные защитные группы борных кислот имеют аббревиатуры:-СбН 12 пинаконовая группа и -CioHie пинанди- оловая группа.

Все аминокислотные остатки представлены в L-конфигурации, если не оговорено особо.

ТСХ и оф-ТСХ осуществляют на пластинках из силикагеля 60 фирмы E.Merk и

пластинках KCI8F для оф-ТСХ фирмы Whatman. Нейтральные соединения наблюдали в УФ-области и после экспонирования парами иода, Соединения, содержащие свободные аминогруппы, подкрашивали нингидрином-, а соединения с гуанидиногруппами подкрашивали красителем Sakaguchl. Краситель Sakaguchi проявляет значительную специфичность к монозамещенным гуанидинам, например,

которые содержатся в бораргининовых пеп- тидах.

П р и м е р 1,а. 1-амино-4-бром-бутилбо- ронат пинандиол HCI.

NH2-CH(CH2)3Br B02-CioHi6 HCI

4-бром-1-хлорбутилборонат пинандиол получают по методике, описанной Matteson и др. В обычном эксперименте осуществляют гидроборирование аллилб- ромида (173 мл, 2 моль) бораном пирокате- хина (240 мл, 2 моль) путем, прибавления борана к аллилбромиду с последующим нагреванием реакционной смеси в течение 4 ч до 100°С в атмосфере азота. Полученный продукт, пирокатехин 3-бромпропилбрро- ната (т.кип. 95-102°С, 0,25 мм), выделяют перегонкой с выходом 49%. Указанный пи- рокатехиновый эфир (124 г, 0,52 моль) трансэтерифицируют (+)альфа-пинандио- лом (88 г, 0,52 моль) при смешивании их в 50 мл тетрагидрофурана (THF), интенсивно перемешивая указанную смесь в течение 0,5 ч при 0°С, а затем 0,5 часа при комнатной температуре. Растворитель упаривают и прибавляют 250 мл гексана. Пирокатехин удаляют в виде кристаллического твердого вещества. Количественный выход получают путем последовательного разбавления гек- саном до объема 500 и 1000 мл с выделением кристаллов при каждом разведении. При упаривании растворителя получают про- дукт (147 г) в виде масла.

Вычислено, %: С 51,85; В 7,38; В г 26,54.

С1зН2202ВгВ:

Найдено, %: С 52,85; Н 7,30, Вг 26.58:

4-бром-1-хлорбутилбороната пинандиол получают гомологизацией соответствующего пропилбороната. Хлористый метилен; (34,8 мл, 0,540 моль) растворяют в 500 мл THF и затем медленно прибавляют к 1,54М н-бутиллития вгексзне(350мл,0,54рммрль) ;при-10р°С. Пинандиол 3-бромпропилборо- ната (148 г, 0,490 моль) растворяют в 500 мл THF, охлаждают до точки замерзания указанного раствора и вводят в реакционную смесь. Хлорид цинка (33,5 г, 0,246 моль) рас- тврряют в 250 мл THF, охлаждают до 0°С и прибавляют несколькими порциями к реакционной смеси. Реакционную смесь при одновременном перемешивании нагревают постепенно до комнатной температуры в течение ночи. Затем растворитель упаривают, а полученный осадок растворяют в гек- сане и промывают водой. После просушивания над безводным сульфатом магния и фильтрования растворитель удаля- ют с выходом целевого продукта (140 г),

Пинандиол 1-амино-4-бромбутилборо- ната получают путем растворения гексаме- тилдисилизана (28 г, 80 ммоль) в 30 мл THF, охлаждения полученного раствора до -78°С и прибавления к нему 1,62N н-бутиллития в гексане (49,4 мл, 80 моль). Затем раствор медленно нагревают до комнатной температуры, повторно1 охлаждают до -78°С и

прибавляют пинандиол 4-бром-1-хлорбу- тилбороната (28 г, 80 моль) а 20 мл THF. Реакционную смесь медленно нагревают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Растворитель удаляют упари- ванием, вводят сухой гексан (400 мл) и получают осадок, который выделяют фильтрованием в атмосфере азота. Фильтрат охлаждают до -78°С и добавляют4н. HCI в диоксане (60 мл, 240 моль). Затем реакционную смесь медленно нагревают до комнатной температуры и при этой температуре перемешивают ее 2 ч. Полученный продукт (20 г) выделяют фильтрованием в виде твердого вещества. После просушивания в вакууме неочищенный продукт растворяют в хлороформе и нерастворившееся вещество выделяют фильтрованием. Фильтрат упаривают и осадок растворяют в эти- лацетате.Целевой продукт выкристаллизовывают из этилацетата с выходом его 15,1 г(т.пл. 142-144,5°С, +16,7±0,80, С 1,0 в абсолютном метаноле.

Элементныйанализ для Ci4H26N02BrC B:

Вычислено, %: С 45,87, Н 7,16, N 3,82, В 2,95. . . ,

Найдено, %: С 45,76, Н 7,21, N 3,79, В 3,04. . : .: ;..: .:;;. ;

П р и мер 1,6. (0,1)1-амино-4-бромбу- тилборонат пинакон-HCI.

(о,дын2-сн(сн2)зВг во2-СбН12 HCI.

Пинакон 4-бром-1-хлорбутилбороната получают по методу, описанному для получения соответствующего пинандиола (пример 1,а), за исключением того, что вместо пинандиола используют пинакон, пинакон 3-бром-пропилбороната (т.кип. 60-64°С, 0,35 мм) и 4-бром-1-хлорбутилбороната пинакон (т.кип. 110-112°С, 0,20 мм) перегоняют.. . : . . :

Элементныйанализ для CioHi902BrCIB:

Вычислено, %: С 40,38, Н 6,45

Найдено, %: С 40,70, Н 6,37.

Хлористоводородную соль пинакона 1- амино-4-бромбутилбороната также получают по методике примера 1,а. Целевой продукт выкристаллизовывают из смеси этилацетат:гаксан с выходом его 52%.

Элементныйанализ для CioH22N02BrCIB:

Вычислено, %: С38,19, Н 7,05, N4,45, CI 11,27, Вг 25,41.

Найдено, %: С 38,28, Н 7,39, N 4,25, CI 11,68, Вг 26,00.

П р и м е р 1,в. Гидрохлорид 1-амино-4- хлорбутилборонат хлористоводородная соль пинакона.

(0,ЦМН2-СН(СН2}зС В02-СбН12 HCI.

Пирокатехин 3-хлорпропилборонат (т.кип. 80-85°С, 0,30 мм) и пинакон 3-хлорп- ропилового эфира бороновой кислоты (т.кип. 63°С, 0,20 мм) получают по методике примера 1,а за исключением того, что вместо аллилбромида используют аялилхлорид, а вместо пинандиола берут пинакон.

Элементный анализ для CgHisOaCIB:

Вычислено, %: С 52,85, Н 8,89, C117,33.

Найдено, %: С 53,41, Н8,15, CI 16,81.

Гомологизацию также осуществляют по методике примера 1,а, а полученный продукт выделяют перегонкой (т.кип. 95°С, 0.25 мм) с 65% выходом.

Элементный анализ Для CioHigOaClaB:

Вычислено, %: С 47,47, Н 7,58, CI 28,02.

Найдено. %: С 47,17, Н 7,45, CI 27,75.

Хлористоводородную соль пинакона 1- амино-4-хлорбутилового эфира бороновой (борной) кислоты получают по методике, аналогичной примеру 1,а. Целевой продукт выкристаллизовывают из этилацетата с получением 8.8 г продукта (т.пл. 132-135,5°С) и 2,2 г продукта (т.пл. 145-147°С). Продукт с т.пл. 145-147°С используют для анализа.

Элементный анализ для CioH22N02CIB: Вычислено, %: С 44,47, Н 8,23, N 5,19., В

4,00. , ; . ..-.--: . .. .: :..,

Найдено, %: С 44,01, Н 8,23. N 4,77, 8 3,80... ...-.-. ; .: . .,:; -v Г;.П р м м е р 1,г. (Ь,Ц1-амиНо-5-бромпён- тилового боронат эфира бороновой кислоты пинакон НС.; : :

(0,1)НН2-СН(СН2)4Вг В02СбН12 HCi.

Пинакон 4-бромбутилового эфира бороновой кислоты получают по методу, описанному для получения пинандиола 3-бромпропилового эфира борной кислотУ (пример 1,а), за исключением того, что ал- лилбромид заменяют на 4-бром-1-бутен, а пинандиол на пинакон. Продукт выделяют в виде масла (т.кип, 77°С, 0,3 мм). После го- мологизации получают 5-бром-1-хЛорг)ентй- лового эфира бороновой кислоты пинакоИ, Масс-спектроскопия(С1): CnH2i02BrCIB

Вычислено. %:Н: 310,47.

Найдено. %:Н:310.;

Целевой продукт хлористоводородную соль пинакона 1-амино-5-бромпентипового эфира бороновой кислоты получают по методике примера 1 ,а при выходе 35%.

Элементныйанализ для CnH24N02BrBCt; %:

Вычислено: С 40,22, Н 7,36, N 4.26, CI 10,79, Вг 24,32, В 3,29.

Найдено: С 39,23. Н 7,18, N 4,04, С1 15.21. Вг25.66, 83,75.

П р и м е р 2. Boc-(D)Phe-Pro-NH- СНКСН2)зВгЗВ02-С1оН1б.

Синтез дипептида ВОС (D) Phe-Pro-OH осуществляют вначале с получения дипеп- тидного бензилового эфира, а затем удаления указанного сложного эфира каталитическим гидрированием. Вос- (D)Phe-OH (10,0 г, 37,7ммоль) растворяют в БОмлТНРи к полученному раствору прибавляют N-метилморфолин (4,14 мл, 37,7 ммоль). Раствор охлаждают до -20°С, а затем к нему прибавляют изобутиловый эфир хлормуравьиной кислоты (4,90 мл, 37,7 ммоль). Через 5 мин в реакционную смесь вводят H-Pro-OBZ 1 . HCI(9,11 г, 37,7 ммоль), растворенный в 50 мл хлороформа и охлажденный до -20°С. Прибавляют триэтиламин (5,25 мл, 37,7 ммоль) и полученную смесь перемешивают 1 ч при -20°С и 2 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь фильтруют и фильтрат упаривают. Оеадок

растворяют в.этилацетате с последующим промыванием 0,2н. HCI, 5%-ным водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлористого натрия. Органический слой сушат над безводным

сульфатом натрия, фильтруют и упаривают с получением 15,2 г Boc-(D)Phe-Pro-OBZ1 в

виде масла. Полученный бензиловый эфир

(15,2 г) растворяют в 100 мл метанола и

затем гидрируют при начальном давлении

40 фунтов/дюйм2 (2,812 кг/см2) в аппарате

Парра в присутствий 6,5 г 10% палладиевой

черни (Pd/C). Реакционный раствор фильтруют через целиттм и упаривают с выходом

твердого вещества. Указанный твердый

. продукт выделяют и промывают этилацетатом, а затем простым эфиром с получением 10 г требуемого продукта (т.пл. 176,5- 177°д. .;:. . Элементный анализ для CigH26N205, (%):: - .

Вычислено: С 62,95, Н 7,24, N 7,73. Найдено: С 62,91, Н 7,15, N 7,53. Booj))Phe-Pno-NH-CH i(CH2bBr BO2-CioHi6 получают связыванием указанного дипеп- тида с соответствующим амином по методике смешанного ангидрида. Смешанный ангидрид Boc-(D)Phe-Pro-OH получают при растворении указанной кислоты (4,94 г, 13,6 ммоль) в 30 мл THF с последующим прибавлением N-мётилморфолина (1,50 мл, 13,6 ммоль). Затем реакционный раствор охлаждают до -20°С и добавляют изобутиловый эфир хлормуравьинойкислоты (1.77 мл, 13,6 ммоль), После перемешивания в тече- ние 5 мин при -20°С в реакционную смесь вводят амин, который получен в примере 1,а, МН2-СН(СН2)зВг В02-СюН1б- HCI (5 г, 13,6 ммоль), растворенный в 10 мл охлажденного хлоформа. Охлажденный тетрагид- рофуран (10 мл) и триэтиламин (1,90 мл, 13,6

ммоль) прибавляют к реакционной смеси и перемешивают смесь в течение 1 ч при -20°С и примерно 2 ч при комнатной температуре. Смесь фильтруют и оставшуюся жидкость в фильтрате упаривают. Осадок растворяют в этилацетате и промывают 0,2н. HCI, 5%-ым водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором натрийхлорида. Органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют, а растворитель упаривают с выходом 9 г продукта в виде масла. Указанный продукт растворяют в метаноле и хроматог- рафируют на колонке 2,5 х 50 см с LH-20. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют и упаривают с получением 5,8 г твердого вещества. ТСХ в смеси метанол/хлороформ (1:9) показывает единичное пятно, Rf 0,70.

Mace-спектроскопия (FAB) для СззРзэМзОбВВг:

Вычислено: +Н: 674,30

Найдено: 674,30.

ПримерЗ. Boc-(D)Phe-Pro-NH- CH(CH2)3N3 B02-CioHi6.

Продукт примера 2. Boc-(D)Phe-Pro- NH-CH(CH2)3Bf)B02-CioHi6 (4,4 г, .6,54 ммоль) растворяют в 7 мл диметилформами- да(ДМР) и азид натрия (0,919 г, 14.1 ммоль) прибавляют к указанному раствору. Реакционную смесь нагревают при 100°С в течение 3 ч. Прибавляют этилацетат (100 мл) к реакционной смеси и затем промывают водой и насыщенным водным раствором хлористого натрия. Полученную органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и упаривают. Получают 4,1 г твердого продукта. Указанный продукт хро- матографируют на колонке 2,5 х 50 см из LH-20 в метаноле. Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют, оставшуюся жидкость упаривают с выходом 2,3 г названного азида. ТСХ в системе метанол:хлоро- форм (1:9) показывает единичное пятно, Rf 0,76.

Элементный анализ для CsaH sNeOeB,

(%):

Вычислено: С 62,35, Н 7,63, N 13,33, В 1,70.

Найдено: С 63,63, Н 8,02, N 11,58, В 1,80.

Mace-спектроскопия (FAB) для СззН4вМбОбВ

Вычислено: +Н: 637,39

Найдено: 637,49.

П р и м е р 4. Boc-(D)Phe-Pro-NH- CH(CH2)3NH2 B02-CioHi6 Бёнзолсульфо- кислота.

Азид примера 3 (8,80 г, 13,8 ммоль) растворяют в 150 мл метанола и гидрируют на установке Парра при давлении 40 фунтов/дюйм2 (2,812 кг/см) в присутствии 0.50 г 10% палладиевой черни и бензолсуль: фокислоты (2,19 г, 13,8 ммоль). Через час катализатор удаляют и после упаривания

раствора получают 9,9 г требуемого продукта. оф-ТСХ в системе растворителей мета- нол:вода (85:15) показывает пятно в УФ-области, Rf 0,91 и пятно, позитивное к нингидрину, Rf 0.52.

П р и м е р 5. Boc-(D)Phe-Pro-NH- CH(CH2)3-NH-C(NH)NH2 B02-CioHi6X

хбензолсульфокислота.

Boc-(D)Phe-Pro-6opoArg-CioHi6x хбензолсульфокислота. Boc-(D)Phe-Pro-6opoArg-CioHie)f

бензосульфокислоту, полученную в примере 4 (4,6 г, 6,11 ммоль), нагревают с обратным холодильником при 100°С в 20 мл абсолютного этанола, содержащего цианамид (50 мг/мл). Ход реакции регулируют оф- ТСХ в системе растворителей метанол: воды (85:15), где наблюдается исчезновение ни- нгидринового пятна из исходного материала амина (Rf 0,54) и появление красителя

Sakaguchi на полученном продукте (Rf 0- 0,13). Указанный продукт можно обнаружить после нагревания с обратным холодильником в течение 18 ч, причем его уровень постепенно повышается. Через 7

дней, когда амин нельзя обнаружить, реакционный раствор концентрируют до примерно 50 об.% пассивным упариванием. Затем реакционный раствор фильтруют, сгущают и хроматографируют на 2,5 х 100 см

колонке с LH-20 в метаноле. Фракции, содержащие требуемый продукт, объединяют и после упаривания получают 3,7 г требуемого продукта. Порцию продукта (2,3 г) кристаллизуют смесью этилацетзт.тексан с

выходом 0,89 г вещества, а остаток (1,2 г) получают порошкованием простым эфиром в виде твердого продукта,

Mace-спектроскопия (FAB) для CoiHsaNeOeSB:

Вычислено: +Н: 653,42 Найдено: 653,38. Элементныйанализ для

C40H59N609SB-H20, %:

Вычислено: С 57,95, Н 7,43, N 10,14, В 1.30

Найдено: С57.20, Н 7,14, N 10,94, В 1,01.

Примерб. H-(D)Phe-Pro-6opoArg- CioHi6 2HCI.

Продукт примера 5, Boc-(D)Phe-Pro- боро Агд-СюН1б,бензолсульфокислота (1,17 г, 1,54 ммоль), подвергают взаимодействию с 5 мл 4н. хлористого водорода в диоксане в течение 15 мин при комнатной температуре. Полученный продукт осаждают при добавлении простого эфира, выделяют и промывают простым эфиром с просушиванием в вакууме. Затем продукт растворяют в 10 мл воды и наносят на анионно-обменную колонку 5 мл с Вио-RADAGI Х8™ (СГ-форма, ВЮ-RADCo., Richmond, CA) с последующим промыванием колонки водой (примерно 30 мл). Элюент упаривают в вакууме, а осадок порошкуют простым эфиром с выходом требуемого продукта (0,80 г).

Mace-спектроскопия (FAB) для

C29H45N604B:

Вычислено: +Н: 553,37

Найдено: 553,40 и 538,40 (не идентифицирован).

Элементный анализ H-(D)Phe-Pro-6o- poArg-CioHi6-1BSA.TFA:

Найдено; 553,4

Пример ы7и 8. Ac-(D)Phe-Pro-6o- poArg-CioHi6 HCI (пример 7)

Ac-(D)Phe-Pro-6opoArg-OH.HCI (пример 8).

Boc-(D)Phe-Pro-6opoArg-CioHi6X бензосульфокислота, продукт примера 5 (0,86 г, 1,13 ммоль) подвергают взаимодействию с безводной трифторуксусной кислотой (TFA) (примерно 5 мл) в течение 15 мин при комнатной температуре. Избыток TFA удаляют упариванием, а полученный осадок порошкуют простым эфиром с выходом 0,76 продукта, Указанный продукт (0,70 г, 0,91 ммоль) растворяют в смеси, состоящей из 2 мл диоксана и 1 мл воды. Уксусный ангидрид (0,47 мл, 5 ммоль) и бикарбонат натрия (0,42 г, 5 ммоль) прибавляют к реак- ционному раствору, Затем полученную смесь перемешивают в течение 20 мин при комнатной температуре. Добавляют этила- цетат (50 мл) и воду (5 мл). Образовавшиеся фазы разделяют и органический слой сушат над безводным сульфатом натрия. После фильтрования и удаления растворителя упариванием получают 0,56 г полутвердого вещества.

Полученную пробу растворяют в 4 мл ледяной уксусной кислоты с последующим разбавлением раствора 16 мл воды. Затем сразу же наносят на колонку с 15 мл SP-ce- фадекса™ (Н -форма) и уравновешивают 20%-ым раствором уксусной кислоты. Колонку промывают 300 мл 20%-ой уксусной кислоты и устанавливают линейный градиент концентраций от 100 мл 20%-ой уксусной кислоты до 100 мл 20%-ой уксусной кислоты, содержащей 0,30 н.хлористоводородной кислоты. Фракции, собранные в градиенте концентрации от 0,08 до 0.17н. HCI. содержат N-ацетиловый пептид(0.29 г) в виде смеси из свободной бороновой кислоты и сложного пинандиолового эфира.

Сложный эфир пинандиола и свободную бороновую кислоту разделяют хроматогра- фией на 2,5 х 100 см колонке, содержащей LH-20 в метаноле. Размер фракций состав- ляет 8,2 мл. Пинандиоловый эфир (102 мг) элюируют в фракциях 41-43, в то время как свободную борную кислоту (131 мг) постепенно вымывают в фракциях 45-129.

Mace-спектроскопия (FAB) (пример 7): 0 Ас-(0)РЬе-Рго-бороАгд-СюНб для C3iH47N60sB:

Вычислено+Н: 595,33 . Найдено: 595,33 . Mace-спектроскопия (FAB) (пример 8): 5 Ac-(D)Phe-Pro-6opoArg-OH.HCI для С21НззМб05:

Вычислено+Н: 449,60 Найдено: 579,24-581,24. Последние данные нельзя объяснить. 0 Тем не менее данные ЯМР совпадают со структурой свободной бороновой кислоты, так как заданные полосы испускания для пинандиоловой группы, например как синг- леты метильных групп при дельта 0,85 (ЗН), 5 1,30 (ЗН) и 1,36 (ЗН), не наблюдались. В качестве дополнительного доказательства этой структуры образец продукта свободной бороновой кислоты переэтерифицируют с выходом материала примера 7. Аналитиче- 0 скую пробу (20 мг) обрабатывают двухкратным избытком пинандиола (14 мг) в 3 мл метанола в течение 5 мин. Растворитель упаривают, а избыток пинандиола удаляют по- рошк ованием простым эфиром указанного 5 образца с выходом требуемого продукта (26 мг). Mace-спектроскопия (FAB) (найдено: 595,38) и данные ЯМР совпадают со структурой, предполагаемой для этерифицирован- ного продукта, и почти идентичны 0 пинандиоловому продукту примера 7.

П р и м е р 9. Ac-Phe-6opoArg- CioHi6 HC.

По методике, описанной в примере 2, . получают Ас-Рпе-МН-СН(СН2) 5 СюНтб. Затем получают смешанный ангидрид Ac-Phe-OH (0,565 г, 2,73 ммоль) в 10 мл TFA, который связывают с NH2- СН(СН2)зВг В02-СюН1б-НС1 (продукт примера 1,а. 1 г, 2,73 ммоль), растворенного в 0 10 мл охлажденного THF с выходом 1,47 г белой пены. Указанный продукт перемешивают в течение ночи вместе с гексаном. Получают твердое вещество 1,01 г (т.пл. 106,5-109°С).

5 Элементныйанализ для C25H36N204BrB, %;

Вычислено: С 57, 81, Н 7.00, N 5.40, Вг 15,40, В 2,08

Найдено: С 58,33, Н 7.33. N 4,76, Вг 14,18, В 1,80.

Масс-спектроскопия (FAB) для

С25НЗбМ204ВгВ:

Вычислено +Н; 519,20 Найдено.: 519,23.

Ac-Phe-NH-CH(CH2)3N3 B02-CioHie получают при обработке Ac-Phe-NH- СН(СН2)зВг В02-СюН1б (3,22 г, 6,20 ммоль) натрийазидом по методике, описанной в примере 3. Полученный продукт (3,03 г) хро- матографируют на колонке с LH-20, Фракции, содержащие требуемый продукт, объединяют и упаривают. Осадок порошку- ют гексаном с выходом 2i21 г указанного азида,

. ,. Бензолсульфонат Ac-Phe-6opoOrn- CioHie получают из указанного азида Ас- РЬе-МН-СНг(СН2)з№ В02-СюН1б (2,21 г, 4,59 ммоль) по методике примера 4 за исключением того, что гидрирование осуществляют при атмосферном давлении. После фильтрования и упаривания растворителя путем порошков.ания простым эфиром получают требуемый продукт (2,22 г).

Ac-Phe-6opoArg-CioHi6X

бензолсульфонат получают путем обработки соединения Ас-РЬе-бороОгд-СюЖе-бен- золсульфокислота (2 г, 3,26 ммоль) 10 мл

раствора цианамида (100 мг/мл) в этаноле, Реакцию гуанидирования осуществляют по методике примера 5 за исключением того,

что реакционное время составляет 3 дня, а реакционная смесь содержит смесь из исходного материала и полученного продукта. Указанная смесь требует дополнительной

очистки, которую по всей вероятности можно не проводить, продлив продолжительность реакции. Реакционный раствор далее концентрируют и хроматографируют на колонке 2,5 х 100 см из LH-20 в метаноле.

Фракции, содержащие требуемый продукт, обнаруженные при помощи подкрашивающего агента Sakaguchi, объединяют и упаривают с выходом 1,4 г продукта. Полученный продукт (1,2 г) растворяют в 6 мл уксусной кислоты, разбавляют 30 мл воды и получают раствор молочного цвета. Этот раствор наносят на колонку объемом 30 мл с SP-Сефа- дексом™ С-25 fH-форма), доведенную до равновесного состояния .20%-ым водным раствором уксусной кислоты. Далее колонку промывают240 мл 20%-ой уксусной кислоты и устанавливают линейный градиент концентрации от 250 мл 20%-ой уксусной кислоты до 250 мл 20%-ой уксусной кислоты, содержащей 0,30 н, соляной кислоты. Фракции, элюированные из колонки в интервале от 0,12 до ОИ6 н. соляной кислоты, объединяют с выходом 0,42 г требуемого пептида в виде смеси свободной борной кислоты и сложного эфира пинандиола. Указанную

. смесь растворяют в метаноле (10 мл) и для этерификации свободной бороновой кислоты прибавляют 80 г пинандиола. После перемешивания в течение 30 мин 5 растворитель упаривают, а после порошко- вания осадка простым эфиром получают 0,28 г требуемого продукта.

Элементныйанализ для C26H40N504B-HCI-2H20, %:

0 Вычислено: С 54,78, Н 8,15, N 12,30. В 1,90.

- Найдено: С 55,34, Н 7,83, N 11,66, В 1,99. Масс-спектроскопия (FAB) для С2бН4о№04В:

5Вычислено+Н: 498,32 Найдено: 498,31.

Пример 10. Ac-{D,L)Phe-(D,L}-6o- poArg-CieHi2.

Промежуточное соединение Ас- 0 (0,ЦРпе-(О,1Н 1Н-СН-(СН2)зВг В02-СбН12 получают модифицированием методов, описанных в примере 1 и 2. Хлорангидрид Ас- Phe-OH получают при взаимодействии Ac-Phe-OH (30 г, 0,145 моль) с пентахлори5 дом фосфористой кислоты (30 г, 0,144 моль)

в 175 мл THF при-10°С, Реакционную смесь

перемешивают при 0°С приблизительно в

течение 1 ч, затем разбавляют до объема 350

. мл охлажденным простым эфиром, продукт

0 выделяют в виде твердого вещества, промывают холодным простым эфиром и после вы-, сушивзния в вакууме получают 21 г продукта. Активированное ацетилфенилп- роизводное (14,8 г, 65,6 ммоль) растворяют

5 в 40 мл THF и прибавляют к продукту взаимодействия пинакона 4-бром-1-хлорбутил- бороната и гексаметилдисилизана, приготовленных в 20 ммольной концентрации, при -78°С. Затем реакционную смесь

0 нагревают до комнатной температуры с последующим перемешиванием ее в течение ночи. Растворитель удаляют путем упаривания. Осадок растворяют в этилацетате и промывают последовательно водой, 5%-ым

5 раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлористого натрия. Органическую фазу полученной смеси сушат над безводным сульфатом натрия и после концентрированна получают требуемый

0 продукт продукт в виде кристаллического твердого вещества (1,37 г, т.пл. 146,5- 148°С). При исследовании структуры кристалла получен следующий химический состав.

5 Элементныйанализ для C2iH32N204BrB, %:

Вычислено: С 53,98, Н 6,92, N 6,00, Вг 17,10, В 2,31.

Найдено: С 54,54, Н 6,78, N 5,89, Вг 16,46,63,40.

151807988 16

Алкилбромид превращают в соответст-5,33 г, 14,5 ммоль) по методике, описанной в

вующий азид по методике примера 3. Про-примере 2, за исключением того, что не выдукт выкристаллизовывают из этилацетатаполняютхроматографии на колонке с LH-20.

(т.пл. 143-144°С).Полученный продукт выкристаллизовывают

Элементный анализ для С21Нз2№04В, 5из этилацетата с выходом в первом погоне

%:2,47 г продукта (т.пл. 132-134°С) и 5,05 г

Вычислено: С 58,74, Н 7,53, N 16,31, Впродукта (т.пл. 133-135°С) во втором погоне.

2,53.При оф-ТСХ в системе метанол: вода (85:15)

Найдено: С58,85,Н7,48, N16,53, В 2,93.отмечено единичное пятно. Rf 0,29.

Полученный азид превращают, в соль 1 оЭлементный анализ для CayHsiNaOeBrB,

бензолсульфокислотыАс-(0,1)Рг1е-(0,1)-бо-%:

ррОгп-СбН 12 по методике примера 4 за иск-Вычислено: С 61,32, Н 7,11, N 5,80, Вг

лючением того, что гидрирование проводят11,03.

при атмосферном давлении.Найдено: С 61,21, Н 7,02, N 5,59, Вг

Ac-(D,L)Phe-(D,L)6opoOrn-C6H 12X1510,22.

Хбензолсульфокислота (0,243 г, 0,433 ммоль)Вос-(0)Рпе-Рпе-ЫН-СН(СН2)зМз В02подвергают взаимодействию с цианамидом-CioHie получают при обработке соответству(0,20 г, 0,476 ммоль) при 100°С в 2 мл абсолют-ющего алкилбромида (7,15 г, 9,87 ммоль) ази.ного этанола в течение ночи. Раствор кон-дом натрия по методике, описанной в

центрируют и после порошкования простым 20примере 3, за исключением того, что для

эфиром получают 0,21 г белого вещества.очистки не нужно проводить хроматографиПри оф-ТСХ отмечено характерное положи-ческого разделения на колонке с LH-20. Третельное окрашивание полосы при использо- буемый продукт элюируют из смеси

вании красителя Sakaguchl в случаерастворителей этилацетаттексан в виде ге-.

бороаргининовых пептидов (Rf 0-0,55) и ди- 25ля и после выделения и промывания гексаскретное пятно (Rf 0,68), соответствующееном получают 3 г требуемого продукта в

непрореагированному исходному материа- :.первом погоне и 2,9 г во второй порции,

лу. Полученный продукт (81 мг) повторно об- ;Бензолсульфонат B oc-(D)Phe-Phe-6oрабатывают 2 мл раствора цианамида (10ррОгп-СюЖб получают из указанного азида

мг/мл) в течение ночи по указанной методй- 30(5,37 г, 7,82 ммоль) по методике, описанной

ке и после порошкования просты м эфиром ;в примере 4, с выходом 5,33. При оф-ТСХ в получают мг целевого продукта. : . /смеси метанрл:вода (85:15) отмечается ин Mace-спектроскопия (FAB) длятенсивное положительное окрашивание ниG22H37NsO4B: :;.нгидрином, Rf 0,42 .и слабое пятно в

Вычислено Н: 446,30. 35УФ-области, 0,92 (образование пятна в УФНайдено: 446,23 и 404,19 (соответствую-области при Rf.0,92 характерно для аминов

. щий непрореагированному борорнитиново-или гуанидйновых соединений, которые явму пептиду).ляготся солями бензолсульфокислоты).

Следует иметь в виду, что методика по: Mace-спектроскопия (FAB) для примеру 5 представляет собой наилучший 40Сз7Н5зМ40бВ: V способ получения бороаргининовых пепти-Вычислено+Н: 661,76. дов и отличается в том, что используют боль-Найдено: 661,14. ший избыток цианамида и более.Boc-(D)-Phe-Phe-6opoArg-CioHi6 пол- продолжительное время взаимодействия. :учают по методике, списанной в примере 5.

Пример 11. Boc-(D)Phe-Phe-6o- 45Бороорнитиновый пептид(4.83 г, 5,90ммоль)

роАгд-СюНМш бензолсульфонат.обрабатывают раствором цианамида (50

Boc-(D)Phe-Phe-OH получают по мёто-мг/мл) в 20 мл абсолютного этанола в тече- дике, описанной для получения дипептида .ние 7 дней. Из реакцйоннрй смеси выделяют Bpc-(D)Phe-Pro-OH в примере 2. После гид-порцию продукта, соответствующую 1 г ис- рирования сложного бензилового эфира 50ходного материала, и нагревают отдельно полученный продукт выкристаллизовываютбез обратного холодильника в течение ночи из смеси хлороформ:гексан с выходом тре-с полным превращением амина в гуанидино- буемого пептида (т.пл. 133-133,5°С).соединение. После хроматографии на колон- Элементный анализ для С2зН28№05. %:ке с LH-20 и порошкования продукта

Вычислено: С 66,96, Н 6,86, N 6,79. 55простым эфиром получают 0,52 г требуемого

Найдено: С 66,75, Н 6,79, N 6,56.борнила,

8oc-p)Phe-Phe-NH-CH(i;CH2)3 BrpOj-CioHi6Элементный анализ для C HeiNeOgSB,

получают путем смешивания Boc-(D)Phe-%;

-Phe-OH (6 г, 14,5 ммоль) с NH2-Вычислено: С 61,38, Н 7.16, N 9,76, В

-СН(СН2)зВг В02-СюН1б НС1 (пример 1,а,1,25.

Найдено: С .59,69, Н 7,41, N 9,82, В 1.26.

Mace-спектроскопия (FAB) для CaeHssNeOeB:

Вычислено+Н: 703,43

Найдено: 703,49.

П р и м е р 12. H-(D)Phe-Phe-6opoArg- CioHi6 2HCI.

Бензолсульфонат Boc-(D)Phe-Phe-6o- poArg-CioHi6, полученный по примеру 11 (0,59 г, 1,25 ммоль), деблокируют по методике примера 6 за исключением того, что пробу наносят на ионнообменную колонку в 20% этаноле с последующим промыванием указанной колонки 20%-ым раствором этанола. Продукт получают (0,424 г) в виде белого твердого вещества.

Mace-спектроскопия (FAB) для СззНзтМбСиВ:

Вычислено+Н: 603.38.

Найдено: 603,41,

П р и м е р 13. Бензолсульфат Ac-Ala- Lys(Boc)-6opoArg-CioHi6.

Ac-Ala-Lys(Boc)-OH получают путем сопряженной реакции N-оксиянтарной кислоты имидоэфира Ac-Ala-QH. полученного по методу Anderson, с H-Lys(Boc)-OH. N-окси- кукцинимид Ac-Ala-OH (6,25 г, 27,4 ммоль) растворяют в 30 мл диоксана и прибавляют к раствору H-Lys(Boc)-OH (7,50 г, 30,4 ммоль), который растворен в смеси, состоящей из 30 мл 1 н. NaOH и триэтиламина (2,12 мл, 15 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи, а затем подкисляют соляной кислотой. Для получения требуемой насыщаемости раствора добавляют нужное количество сухого хлорида натрия. Продукт экстрагируют в этилацетате и затем промывают 0,2 н. HCI, полученной в насыщенном водном растворе хлористого натрия. Растворитель удаляют путем упариванйя. После кристаллизации продукта из смеси этилаце- тат:гексан получают 7,3 г требуемого продукта (т.пл. 86-89°С).

Ac-AJa-Lys(Boc -NH-CH(CH2bBr B02-CioHi6 получают по методике примера 2 за исключением того, что получаемый продукт очищают фракционированной кристаллизацией из этилацетата. В продукте (1,13 г), полученном во второй и третьей фракциях, отмечается единичное пятно при оф-ТСХ в смеси растворителей метанол:вода (85:15) при значении Rf 0,51. Тонкослойную пластинку подвергают воздействию паров хлористоводородной кислоты, на которой после прибавления нингидринового индикатора обнаруживают целевой амин.

Ac-Ala-Lys(Boc)-NH-CH(CH2)3N3 B02CioHie получают из соответствующего алкилбромида (1,95 г, 2,9 ммоль) по методике,

описанной в примере 3. за исключением того, что очистку продукта осуществляют кристаллизацией его из этилацетата, а не хро- матографией на LH-20. После кристаллизации неочищенного продукта 5 (1,6 г) получают 0,55 г чистого продукта (т.пл. 79-84°С) и 0,96 г осадка. Ниже представлен химический состав кристаллического продукта.

Элементный анализ для CaoHsaNyOyB,

0 %:

Вычислено: С 56,86, Н 8,29, N 15,48, В 1,71.

Найдено: С 56,76, Н 8,26, N 15,89, В 1,65. Бензолсульфонат Ac-Ala-l ys(Boc)-6o- 5 poOrn-СюН 16 получают из соответствующего алкилазида (0,433 г, 0,683 ммоль) по методике, описанной в примере 4. После удаления катализатора и растворителя получают названный продукт (0,45 г) при порош- 0 ко.вании простым эфиром.

Mace-спектроскопия (FAB) для СзоНмМбОтВ:

Вычислено+Н: 608,42. Найдено: 608,49.

5Бензолсульфонат Ac-Ala-Lys(Boc)-6o- роАгд-СюЖе получают при взаимодействии соответствующего бороорнитинового пептида с цианамидом по методике, описанной в примере 5, Хроматографические фрак- 0 ции, содержащие требуемый продукт, порошкуют простым эфиром с выходом 0,83 г продукта в виде белого твердого вещества. Элементный анализ для CaTHezNyOioBS, %: . 5 Вычислено: С 55,00, Н 7,75. N 12,14, В

1,34:

Найдено: С 54,09, Н 7,53, N 12.22, В 1,34.

Пример14, Ac-A a-Lys-6opoArg-CioHieX x2HCI.

Бензолсульфонат As-Ala-Lys(Boc)-6o- роАгд-СюН1б(0,200 г, 0,248 ммоль) деблокируют по методике примера 6. После ионнообменной хроматографии, упариванйя растворителя, просушивания в вакууме и порошкования простым эфиром получают 0,14 г требуемого продукта.

Mace-спектроскопия (FAB) для

C26H48N705B:

Вычислено+Н: 550,39, 0 Найдено: 550,42.

П р и м е р 15. Бензолсульфонат Вос Leu-Gly-Leu-Ala-6opoArg-CioHi6.

Вoc-Leu-Ala-OBzL получают по методике синтеза дипептидов, описанной в приме- 5 ре 2. Boc-Leu-Ala-OBzL (23,7 г, 57,7 ммоль) растворяют в 40 мл безводной трифторук- сусной кислоты. Через 15 мин удаляют избыток трифтор-уксусной кислоты путем упариванйя и после обработки полученного

5

осадка простым эфиром получают трифто- рацетат H-Leu-Ala-OBzL в виде кристаллического продукта (22,8 г).

Элементный анализ для CieHasNaOsFa,

%:5 Вычислено: С 53,19, Н 6.21, N 6,89. Найдено: С 53,37, Н 5,68, N 6,84. Boc-Gly-Leu-Ala-OBzL получают реакцией сопряжения Boc-Gly-OH (5,70 г, 32,6 ммоль) с H-Leu-Ala-OBzL по методике сме- 10 шанного ангидрида, описанной в примере 2. Продукт (13.8 г) получают в виде аморфного твердого вещества. Boc-Gly-Leu-Ala- OBzL деблокируют трифторуксусной кислотой по методике, описанной для при- -15 готовления H-Leu-Ala-OBzL, за исключением того, что трифторацетатная соль может быть растворена в простом эфире. Продукт растворяют в этилацетате и очищают безводным хлористым водородом. После осаж- 20 дения полученного продукта при добавлении простого эфира получают 7,7 г хлорида H-Gly- Leu-Ala-OBzL в первом сборе.

Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-OBzL получают 25 сопряженной реакцией Boc-Leu-OH (2,62 г, 10,5 ммоль) с H-Gly-Leu-Ala-OBzL по методике получения смешанного ангидрида, описанной в примере 2. После кристаллизации полученного продукта из смеси этила- 30 цетат:гексан получают в первом сборе 2,7 г названного продукта (т.пл. 95-96°С).

Элементный анализ для C29H46N407, %: Вычислено: С 61,89, Н 8,26, N 9,96. Найдено: С 62,00, Н 8.40, N 9,83.35 Boc-Leu-G y- eu-Ala-OH получают каталитическим гидрированием сложного бензилового эфира (2.6 г, 4,62 ммоль) по методике, описанной в примере 2, с выходом 2,1 г требуемого продукта. После кри- 40 сталлизации полученного продукта из горячего раствора этилацетата получают 1,4 г вещества.

Элементный анализ для C22H40N407. %: Вычислено: С 55,90. Н 8,55. N 11,86 45 Найдено: С 55,42, Н 8,47, N 11,73. Boc4ЈiH3ly-Leu-Ala-NH-CH(CH2) BO2-CioHie получают реакцией сопряжения Boc-Leu-Gly-Leu-A a-OH (1.40 г, 2,96 ммоль) с амином из примера 1,а по методи- 50 ке, описанной в примере 2, за исключением того, что не проводят хроматографического разделения. После кристаллизации продукта из смеси этилацетаттексан получают 1,17 г требуемого продукта. При ТСХ в системе 55 растворителей метанол:хлороформ (1:9) отмечено единичное пятно при значении Rf 0,68.

Элементныйанализ для C36H63N5OaBrB, %:

Вычислено: С 55,10, Н 8,11, N 8,93, В 1.38.

Найдено: С 55,96, Н 8,30, N 8,74, В 1,33.

Соответствующий азид получают по методике примера 3 с 97% выходом, который превращают в Boc-Leu-Gly-Leu-Ala-6o- poOrn-CioHie согласно методу в примере 4. Аналитическую пробу приготавливают путем осаждения указанного продукта простым эфиром и хроматографического разделения его на колонке с LH-20 с последующим элюированием из смеси хлороформа с гексаном.

Mace-спектроскопия (FAB) для CseHesNeOeB:

Вычислено: : 721,50.

Найдено: 721,55.

Бензолсульфонат Boc-Leu-Gly-Leu- Ala-6opoArg-Cio-Hie получают по методике, описанной в примере 5. Соответствующий бороорнитиновый пеп- тид (0,695 г, 0,791 ммоль) подвергают взаимодействию с 5 мл раствора цианамида (50 мг/мл) в абсолютном этаноле. После хрома- тографирования указанной смеси и порош- кования простым эфиром получают 0,41 г требуемого продукта.

Mace-спектроскопия (FAB) для Сз7Рб7Мв08В: ; :у

Вычислено:+Н: 763,53.

Найдено: 763,8.

П р и м ё р 16. Бензолсульфонат H-Leu- G y-Leu-Ala-6opoArg-CioHi6-HCI.

Бензолсульфонат Boc-Leu-Gly-Leu- Aia-6opoArg-CioHie, полученный в примере 15 (0,050 г, 0,0543 ммоль), подвергают взаимодействию с 2 мл 4н.хлороводорода в ди- оксане в течение 5 мин при комнатной температуре. Растворитель и избыток HCI удаляют упариванием. Полученную пробу высушивают над гидроксидом калия в вакууме в течение ночи, а затем после порошкования простым эфиром получают требуемый продукт (46 мг) в виде смешанной соли.

Mace-спектроскопия (FAB) для Сз2Н5эМ80бВ:

Вычислено Н: 663,47.

Найдено: 663,50.

П р и м е р 17. Бензолсульфонат Bz-Glu- (OBu)-Gly-6opoArg-CioHi6.

(OBu)-Gly-NH-CH-(CH2) СюН 16 получают сопряженной реакцией Bz- Glu-(OBu)-Gly-OH с указанным амином по методике, описанной в примере 2, Соответствующий азид получают в соответствий с методом, описанным в примере 3, а бороорнитиновый пептид получен по методике примера 4.

Mace-спектроскопия (FAB) для

C32H49N407B:

Вычислено +Н: 613,38.

Найдено: 613.60.

Конечный продукт получают по методике, описанной в примере 5.

Mace-спектроскопия (FAB) для СззН51Мб07В:

Вычислено+Н: 655,40. . Найдено: 655,37,

Элементныйанализ для СзэНзуМбОюЗВ, %:

Вычислено: С 57,62, Н 7,08, N 10,34, В 1 33 Найдено: С57,43, Н 7,25, N9,91,8 1,23.

П р и м е р 18, Бензолсульфонат Bz-Glu- Gly-6opoArg-CioHi6.

Бензолсульфонат Bz-Glu-(OBu)-Gly- 6opoArg-CioHi6 (0,13 г, 0,16 ммоль) растворяют в 5 мл диоксана. прибавляют бензолсульфокислоту (0,10 г, 0,66 ммоль) и реакционный раствор перемешивают в те- чение ночи при комнатной температуре. После концентрации раствора до объема примерно 1 мл путем упаривания с последующим порошкованием простым эфиром получают твердое вещество (0,14 г). Пол- ученный продукт хроматографируют на 2,5 х 50 см колонке с Ш-20 в метаноле. Фракции, содержащие требуемый продукт, упаривают, а осадок порошкуют простым эфиром с выходом 53 г названного п роду к- та.. .

Mace-спектроскопия (FAB) для СгэНззМеОтВ: .

Вычислено Н: 599,34.

Найдено: 599,35, 613,36 (не идентифицирован).

Пример 18,а. Бензолсульфонат Bz- Glu-бороАгд-СюН 16.

-.. Бензолсульфонат Bz-Glu-(OBu)-Gly- 6opoArg-CioHie (пример 17, Q,20 r, 0,246 ммоль) обрабатывают безводным хлори- стым водородом по методике, описанной в примере 6, в течение 45 мин. После порош- кования указанного продукта данные ЯМР показывают, что примерно 30% трет-бути- ловой защитной группы все еще находится в указанном продукте. Затем продукт подвергают взаимодействию с безводной триф- торуксусной кислотой в течение 45 мин при комнатной температуре. TFA удаляют упа- риванием и после порошкования получен- ного осадка простым эфиром получают 143 мг названного продукта.

Масс-спект.роскопия (FAB) для СаэРчзМеОтВ:

Вычислено+Н: 599,34. Найдено: 599,35.

П р и м е р 19. Бензолсульфонат Bz-Pro- Phe-бороАгд-СюН 16.

Bz-Pro-Phe-OH (т.пл. 200-20ГС) получают по методике, описанной в примере 2, используемой для синтеза дипептидов.

Элементный анализ для С21Н22№04, %:

Вычислено: С 68,82, Н 6,06. N 7,65.

Найдено: С 68.91, Н 6,09, N 7,47.

Bz-Pro-Phe-4 H-CH(CH2)3Br B02-CioHi6 получают сопряженной реакцией Bz-Pro- Phe-OH с указанным амином по общему методу, описанному в примере 2, за исключением того, что хроматографическое разделение не осуществляют. При ТСХ в смеси растворителей метанол:хлороформ (1:9) наблюдается обширное пятно при Rf 0,72 и следы при Rf 0,86.

Mace-спектроскопия (FAB) для СзбН бМзОбВВг:

Вычислено+Н: 678,27.

Найдено: 677,95.

Полученный алкилгалогенид превращают в азид и бороорнитиновый пептид по методике, описанной в примерах 3 и 4.

Mace-спектроскопия (FAB) для (Bz-Pro- Phe-6opoOrn-CioHi6)-C35H47N405B:

Вычислено+Н: 615,37,

Найдено: 615,42.

Целевой бензолсульфонат Bz-Pro-Phe- 6opoArg-CioHi6 получают по методике, описанной в примере 5.

Mace-спектроскопия (FAB) для CseH gNeOsSB:

Вычислено+Н: 657,39.

.Найдено: 657,13.

Элементный анализ для C42H55N60sSB, %:

Вычислено: С 61,90, Н 6,82, N 10,31, В 1 33

Найдено: С 60,16, Н 7.27, N 9,79. В 1,44.

П р и м е р 20. Хлорид Bz-Pro-Phe-бо- poArg-OH.

Бензолсульфонат Bz-Pro-Phe-бо- poArg-CioHi6 (соединение примера 19, 0,64 г, 0,79 ммоль) растворяют в 4 мл хлори- стого метилена и охлаждают до -78°С. Реак- ционную смесь сливают в. колбу, содержащую 4 мл 0,50 н. трихлорида бора, полученного путем разбавления 1 н. трихлорида бора (Aldrlch Chemical Co., Milwankee, Wl) до 50% сухим хлористым метиленом, и помещенную на баню с сухим льдом. Раствор перемешивают при -178°С в течение 5 мин, затем колбу помещают на баню с льдом (0°С), где раствор перемешивают в течение 15 мин. В реакционный раствор медленно прибавляют (5 мл) холодной воды с последующим разбавлением его до 120 мл 20%-ой уксусной кислотой. Органическую фазу отделяют и извлекают продукт. Водную фазу наносят на колонку объемом 20 мл на SP-Ce- фадексе™, уравновешенную 20%-ой уксусной кислотой. Колонку промывают примерно 150 мл раствора 20%-ой уксусной кислоы с последующим установлением инейного градиента концентраций от 200 л 20%-ой уксусной кислоты до 200 мл 20%- й уксусной кислоты, содержащей 0,30 н. НС. Продукт элгаируют при концентрации HCI в интервале 0,08-0,15н. После упарива- ния растворителя, высушивания в вакууме и порошкования простым эфиром получают ребуемый продукт (0,19 г).

Масс-спектросколия (FAB) для СзбНзбМбОзВ:

Вычислено+Н: 523,29.

Найдено: 579,34 (не идентифицирован).

Элементныйанализ для С2бНзбМб05С1В, %: .

Вычислено: С 53,29, Н 6.55, N 14,34, В 1.84.

Найдено: С 53,27, Н 6,58, N 13,25, В 1,89.

При этерификации названного продукта пинандиолом по методике, описанной в примере 8,а, получают продукт, свойства которого при ЯМР и МС совпадают с исходным сложным эфиром примера 19.

Mace-спектроскопия (FAB) для СзбН/шМбОбВ:

Вычислено +Н: 657,40.

Найдено: 657,39.

Приме р 21. Хлористоводородная соль Bz-Pro-Phe-6opoArg-F.

Bz-Pro-Phe-NH-CH(CH2)3NH-C(NH)NH2 BF2 HCI.

Bz-Pro-Phe-6opoArg-F.

Свободную боронЪвую кислоту (соединение примера 20, 0,100 г. 0,179 ммоль) растворяют в 2 мл воды. К полученному раствору прибавляют 0,040 мл 48%-ой фтористоводородной кислоты при комнатной температуре. Почти сразу же образуется смолистообразный преципитат. Реакционную смесь перемешивают в течение 10 мин, затем замораживают и в вакууме удаляют избыток фтористоводородной кислоты и воду. Остаток растворяют в метаноле, концентрируют и порошкуют простым эфиром. Выход составляет 0,093 г требуемого продукта.

Mace-спектроскопия (FAB) для С2бНззМбОзВР2:

Вычислено+Н: 527,29,

Найдено: 527,31 и дополнительные значения масс, характерных для свободной бо- роновой кислоты.

Элементныйанализ для С2бНз4МбОзВР2СГН20, %:

Вычислено: С 53.47. Н 6.25, N 14.47. В 1,86, F6.54.

Найдено: С 54.00. Н 6.40. N 13,48. В 1,95, F 7,06.

.

П р и м е р 22. Boc-Ala-Phe(D,L)6o- polys-CeHtz-HC.

Boc-Ala-Phe-N H-CH( H BCfc-CsH 12 хбензолсульфокислота.

5Продукт Boc-Ala-Phe-NH- CH(CH2)4Br B02-CeHi2 превращают в алки- лазид по методике, описанной в примере 3, за исключением того, что для очистки пол- .ученного продукта не требуется хроматог- 10 рафии на колонке с LH-20. Полученный азид гидрируют по методике примера 4 за исключением того, что берут 2 эквивалента бензо- лсульфокислоты, а гидрирование проводят в течение 2 ч. Получают конечный продукт при 15 40% выходе (т.пл. 154-160°С, разложение). Mace-спектроскопия (FAB) для С2вН4бМ40бВ:

Вычислено: +Н: 547,38. Найдено: 547,43.

20 П р и м е р 23. Трифторацетат-бензо- лсульфонат H-Ala-Phe-(D,L)6opol ysСбН12.

Бензолсульфонат Boc-Ala-Phe-(D,L)6o- poLys-C6Hi2 подвергают взаимодействию с 25 трифторуксусной кислотой в течение 1 ч при комнатной температуре. После упаривания растворителя и порошкования осадка простым эфиром получают требуемый продукт в виде твердого вещества. 30 Mace-спектроскопия (FAB) для

С2зНзэМ4СМВ: Вычислено Н: 447,31.

Найдено: 447,31.- Элементный анализ для 35 C31H46N409SF3B-2H20. %:

Вычислено: С 49,34, Н 6,68, N 7,42, В 1.43.

Найдено: С 49,26, Н 5,94, N 7,12, В 1,34. Пример 24. Бензолсульфонат Вос- 40 (D)Val-Leu-6opoLys-C6Hi2.

Boc-(D)Val-Leu-OH получают по методике, описанной а примере 2. Сложный бен- зиловый эфир получен с 76% выходом.

Mace-спектроскопия (FAB) для 45 С2зНзбМ2С 5:

Вычислено+Н: 421,27, Найдено: 421,38.

После гидрирования получают свободную борную кислоту с 100% выходом в виде 50 кристаллического твердого вещества белого цвета.

Элементный анализ для Ci6H29N205, %: Вычислено: С 59,34, Н 8,87, N 8,50, Найдено: С 59,34. Н 8,87, N 8,50. 55 Boc-(D)Val-Leu-OH связывают с амином, полученным в примере 1,в, используемой для пептидного связывания Boc-Ala-Phe-OH с выходом Boc-(D)Val- Leu-NH-CH(CH2)4Br B02-C6Hi2 с выходом 97%.

Масс-спектроскопия (FAB) для .С27Н51МзОбВВг:

Вычислено+Н: 604.31.

Найдено; 604,31.

Полученный алкилбромид превращают в соответствующий азид при 85% выходе по методике, описанной в примере 3, с последующим его гидрированием.Конечный продукт получают в виде белого твердого вещества с 62% выходом.

бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором хлористого натрия. Органический слой высушивают над безводным сульфатом натрия и после фильтрования и

упаривания получают кристаллический продукт. После выделения и промывания этила- цетатом получают 3,26 г соединения, т.пл. 176-177°С.

Элементный анализ для CiyHasNOaBrB,

%:

Масс-спектроскопия (FAB) для C27H53N40eB:

Вычислено+Н: 541,41.

Найдено: 541,46.15

Элементныйанализ для СззН59М4р95В-1,5Н20. %:

Вычислено: С 54,62, Н 8,61, N 7,73, В 1,49.

Найдено: С 54,58, Н 8,59, N 7,92, В 1,98. 20

П р и м е р 25. Бензолсульфонзт Ac-Phe- BopoLys-CeHia.

Продукт примера 25 получают по метоике, описанной в примере 22.

Ac-Phe-NH-CH(CH2)4Br B02-C6Hi2 25 олучен с 72% выходом.

Масс-спектроскопия (FAB) для С22Нз4№04ВВп :. .

Вычислено+Н: 481,00.

Найдено: 481,21.30

Азид получен с 57% выходом. Конечный продукт получают при 50% его выходе.

Масс-спектроскопия (FAB) для. С22Нз №04В:

Вычислено+Н: 418.29.35

Найдено: 418,31.

Элементныйанализ для С29Н42№073В-Н20, %:

Вычислено: С 56,66, Н 7,47, N 7,08, В 40

1,82.

Найдено: С 56,88, Н 7,47, N 7,22, В1.53. Пример 26. Bz-(D.L)borolrg-C6Hi2X

XHBr.

Bz-(D,L)NH-CH(CH2)3Br B02-C6Hi2 получают путем взаимодействия амина, полученного в примере 1,в (5 г, 15,9 ммоль), с эквивалентным количеством бикарбоната натрия в смеси, состоящей из 4 мл диоксана и 4 мл воды при 0°С, После первоначального перемешивания реагентов реакционную смесь разбавляют 6 мл раствора из 50% диоксана с водой и нагревают до комнатной температуры. Реакционную смесь переме- шиаают в течение 30 мин при комнатной температуре с последующим экстрагированием ее ъ этилацетате и промыванием водой, 0,2 н. HCI, 5%-ым еодным раствором

15

0

5

0

5

0

5

0 5

Вычислено: С 53,44, Н 6,59, N 3,67, В 2,83.

Найдено: С 54,50, Н 6,76, N 3,68, В 2,84.

Полученный алкилгалогенид (1 г, 2,62 ммоль) превращают в соответствующую соль изотиорония. Требуемый продукт 0,84 г получен в виде твердого вещества белого цвета.

Масс-спектроскопия (FAB) для С1вН28МзОзЗВ: , .

Вычислено+Н: 378,20.

Найдено: 378.21.

Элементныйанализ для С18Н29МзОзЗВВг, %: .

Вычислено: С 47,18, Н 6,38, N 9,17, В 2,36. .

Найдено: С 46,11, Н 6,71. N8,97, В 2,22.

Пример 27. Ьензолсульфонат Bz(D,L)6opoArg-CeHi2.

Алкилгалогенид (полученный в примере 26, 2 г, 5,25 ммоль) превращают в азид (0,97 г, т.пл. 138-139°С) по методике, описанной в примере 3. Полученный азид превращают бензолсульфонат Bz-6opoOrn-C6Hi2 по методике примера 4 при почти количественном выходе.

Масс-спектроскопия (FAB) для С1вН27М20зВ: . Вычислено+Н: 319,22.

Найдено: 319,26.

Бензолсульфонат Bz-6opoOrn-C6Hi2. (0,90 г, 1,84 ммоль) подвергают взаимодействию с цианамидом по методике, описанной в примере 5, с выходом 0,65 г кристаллического продукта, т.пл. 242- 244°С.

Масс-спектроскопия (FAB) для CisH29N403B:.

Вычислено+Н: 361,24.

Найдено: 361,24.

Элементный анализ для С24Нз5М40бЗВ,

Вычислено: С 55,59, Н 6,82, N 10,81, В

2,08.

Найдено: С 54,60, Н 6,70, N 11,24, В

1,87.

П р и м е р 28. Бензолсульфонат Ac-Leu- Thr(OBu)-6opoArg-CioHi6.

Ac-Leu-Thr(OBu)-OH получают путем связывания Ac-Leu-OSu с H-Thr(OBu)-OH по методике, описанной в примере 12, для дипептидного синтеза за исключением того, что конечный продукт получают в виде белого аморфного твердого вещества после хроматографии на колонке с LH-20. Ac-Leu-Thr(OBu)-OH (3,29 г, 9,90 ммоль) подвергают сопряженному взаимодействию с амином (пример 1,а) по методике получения смешанного ангидрида, описанной в примере 2, за исключением того, что не нужно проводить хромэтографию на колонке с LH-20.

Ac-Leu-Thr(OBu)-NH-CH(CH2) CioHie получают в виде аморфного твердого вещества белого цвета с выходом 5,39 г. Полученный элкилгалогенид превращают в соответствующий азид с 82% выходом по методике примера 3 за исключением того, что для последующей очистки нет необходимости в проведении хроматографии. Полученный азид (3,88 г, 6.42 ммоль) гидрируют по методике, описанной в примере 4. Бензолсульфонат Ac-Leu-Thr-(OBu)-6opoOrn- CioHie получают 74% выходом после хроматографии на колонке с LH-20 и порош- кования простым эфиром.

Mace-спектроскопия (FAB) для CaoHssN-iOeB:

Вычислено Н: 579, 43.

Найдено: 579,48.

Бороорнитиновый пептид превращают в конечный продукт с выходом его 86% по методике примера 5.

Mace-спектроскопия (FAB) для СзтНбтМбОбВ:

Вычислено Н: 621,45.

Найдено: 621,50.

Элементныйанализ для СзтНюМвЗОэВ. %:

Вычислено: С 57,05. Н 8,17. N 10.79, В 1 39

Найдено: С 56,47. Н 8,01. N 10,93, В 1,34.

П р и м е р 29. Бензолсульфонат Ac-Leu- Thr-бороАгд-СюН ie.

Бензолсульфонэт Ac-Leu-Thr-(0Ви)- 6opoArg-CioHie (пример 28. 0,200 г, 0,257 ммоль) растворяют в смеси, состоящей из 2 мл хлористого метилена и 2 мл 4 н. оксан, затем полученную реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Растворитель упаривают в вакууме, а полученный осадок сушат в высоком вакууме. Требуемый продукт получают в виде белого твердого вещества с 97% выходом после порошкоаания простым эфиром.

Mace-спектроскопия (FAB) для C27H49Ne06B:

Вычислено+Н: 565,39.

Найдено: 565,48.

Пример 30. Бензолсульфонат Ас- Lys(Boc)-Pro-6opoArg-CioH ie.

Дипептид (Вос)-Рго-ОН получают по методике, описанной в примере 13. После кристаллизации из этилацетата пол- учают указанный продукт в виде белого твердого вещества (т.пл. 160-161.5°С). Указанный дипептид Ac-Lys(Boc)-Pro-OH (3,15 г. 8,18 ммоль) подвергают сопряженной реакции с амином (пример 1,а) по мето- Дике, описанной в примере 2, Полученный продукт (5,8 г) используют без дополнительной очистки. Полученное соединение превращают в азид по методике примера 3 с выходом его 73% после хроматографии на колонке с LH-20. После гидрирования по методике примера 4, хроматографиу) на колонке с LH-20 и порошкования простым эфиром получают бензолсульфонат Ас- Lys(Boc)-Pro-6opoOrn-CioHi6 с выходом 81%.

Mace-спектроскопия (FAB) для

C32H55N50.7B:

Вычислено +Н: 634,43. Найдено: 634,46.

Бороорнитиновый пептид (2,0 г. 2,53 ммоль) подвергают взаимодействию с цианамидом по методике примера 5 с выходом 1,8 г требуемого продукта в виде твердого вещества белого цвета.

Mace-спектроскопия (FAB) для СззН57М707В: ... у Вычислено Н: 676,46. Найдено: 676,41.

Элементныйанализ для СзэНбзМтОюВЗ. %: .

Вычислено: С 56,23, Н 7,64, N 11,77, В1,30.

Найдено: С56.06. Н 7,48, N 11,75, В 1.22. Пример 31. Ac-Lys-Prp-6opoArg- CioHi6-2HCI.

Бензолсульфонат Ac-Lys(Boc)-Pro-6o- poArg-CioHi6 (пример 30, 0,30 г. 0,360 ммоль) подвергают взаимодействию со смесью, состоящей из ледяной уксусной кислоты с 4 н, HCI и диоксана в соотношении 50:50 (%), в течение 15 мин при комнатной температуре. Растворитель упаривают, а остаток сушат в вакууме. Полученный осадок растворяют в воде и пропускают через 5 мл колонку на (С1-формэ). Полученную пробу упаривают и после порошкования остатка простым эфиром получают требуемый продукт в виде твердого вещества белого цвета (230 мг).

Масс-спектроскопия (FAB) для

C28H49N 03B:

Вычислено+Н: 576,40.

Найдено: 576,45.

П р и м е р 32. Бензолсульфонат Glu(OBu)-6opoArg-CioHi6.

Ac-Ala-Glu(OBu)-OH получают путем связывания Ас-Ala-OSu с H-Glu(OBu)-OH по методике примера 13. Продукт выкристаллизовывают из смеси этилацетат:гексан (т.пл. 147,5-148° С).

Элементный анализ для С-нН24№Об, %:

Вычислено: С 53,14, Н 7,66, N 8,85.

Найдено: С 53,28, Н 7,53. N 9,08.

Ac-Ala-Glu(OBu)-NH-CH(CH2) СюНчб получают по методике примера 2 за исключением того, что вместо этилацетата используют хлороформ для отделения органического слоя на начальной стадии реакции и не проводят хроматографии на колонке с LH-20. После упаривания органического слоя получают 87% выхода требуемого продукта в виде частично кристаллического твердого вещества. Ал- килбромид превращают в азид по методике,. описанной в примере 3. Целевой продукт (т.пл. 165-166°С) получен с 50% выходом после кристаллизации неочищенного продукта из хлороформа.

Элементный анализ для С28Н47МбО В,

%:

Вычислено: С 53,51, Н 7,55, N 6,69, В 1.73.

Найдено: С 55,51. Н 7,50, N 6.50, В 1,66.

Бороорнитиновый пептид получают по методике примера 4 с 79% выходом требуемого продукта,

Масс-спектроскопия (FAB) для C28H49N407B:

Вычислено +Н: 565,38.

Найдено: 565.51.

Конечный продукт получают в виде твердого аморфного вещества белого цвета с выходом 70% по методике примера 5.

Масс-спектроскопия для C29H5iN60 B:

Вычислено+Н: 607.40.

Найдено: 607,41.

Элементныйанализ для Сз5Н57МбСНбВ5, %:

Вычислено: С 54,96; Н 7.53. N 10.99. В 1,41.

Найдено: С 54,36. Н 7,71, N 11.27, В 1.21.

П р и м е р 33. Бензолсульфонат Ac-Ala- Glu-бороАгд-СюН 15.

Бензолсульфонат Ac Ala-Glu(Bu)-6o- poArg-СюН 16 (пример 32. 0.10 г. 0.131 ммоль) растворяют в 10 мл уксусной кислоты, через полученный раствор в течение 20 мин пропускают хлороводород. Затем раствор перемешивают в течение 1,5 ч при комнатной температуре и после упаривания растворителя получают масло. Требуемый продукт 5 получают в виде твердого белого вещества (82 мг) после просушивания в вакууме и по- рошкования простым эфиром.

Масс-спектроскопия (FAB) для C25H43N60 B:

0 Вычислено+Н: 551,34. Найдено: 551,41.

Используя аналогичные методы, которые описаны в примерах 22 и 23, получены дополнительно соединения (см. табл. 16).

5 Проведены биологические испытания соединений, полученных описываемым способом.

Показано, что все эти соединения могут быть отнесены к категории малотоксичных

0 веществ.

Ингибиция калликреина плазмы человеческой крови

Каллекреин плазмы человека получают из протогена АГ (AG), поставляемого из

5 Швейцарии. Специфическая активность, как описывает поставщик, составляет 15 единиц на мг. 1 единица определена как количество фермента, необходимого для гидролиза 1 мкмоль субстрата, H-(D)Pro-Phe-Arg-napa0 нитроанилина, (Kabi S2302), за минуту при концентрации субстрата 0,50 мМ при 25°С в 50 мМ калий-фосфатном буфере, рН 8.

Маточный раствор фермента 1 ед/мл приготавливают в 50%-глицерин - 0,1 М на5 трийфосфатном буфере, рН 7,5, содержащем 0,20 М хлористого натрия и 0.1% полиэтиленгликоля 6000 (PEG). В стандартных испытаниях 10 мкл основного раствора калликреина прибавляют к 990 мкл раство0 ра, содержащего 0,20 мМ (H-(D)Pro-Phe- Arg-пара-нитроанилида S2302 в 0,10 мМ натрийфосфатного буфера. рН 7,5, в состав которого входит 0,20 М хлорида натрия и 0,1 % PEG. при 25°С. Действие ингибиторов

5 оценивают при регистрации ферментативной активности, определяемой при измере-. нииповышения интенсивности поглощения при 405 нм по времени как в присутствии, так и в отсутствии ингибиторов. В табл. 1

0 приведены уровни ингибиторов и активность, замеренные в интервале 10-20 мин после стимуляции активности. Активность контрольных ингибиторов составляет 0,0092 ±0,0095 .

5В табл. 1 показана биологическая активность ингибиторов калликреина плазмы крови человека.

Из табл. 1 следует, что указанные ингибиторы имеют значения Ki 0.7 мкм. Наиболее эффективным синтетическим

обратимодействующим ингибитором является 6-амидино-2-(4-эмидинофенил)-бен- зо//3/тиофен, имеющий значение Ki 0,7 мкм.

Таким образом, приведенные в табл. 1 соединения являются более активными ин- гибиторами каллекреина, чем известное производное бензо// /тиофена.

Кроме участия в коагуляции крови кал- ликреин высвобождает брадикинин из белковых субстратов. Брадикинин повышает васкулярную проницаемость, оказывает хе- мотактическое действие на лейкоциты и вызывает боль. Первые два вида активности связаны с воспалением. Поэтому предполагается, что ингибирование калликреина имеетпротивовоспалительный и обезболивающий эффект.

Соединения по изобретению были испытаны также в отношении ингибирования тромбина.

Ингибиция тромбина (эстеразная активность).

Тромбин человека (специфическая активность 2345 NIH ед/мг) получают из R, Q, P. Laboratories, South Bend, IN (Lot HT 102). Маточный раствор тромбина готовят в 0,01 М PIPES-буфере, рН 6. содержащем 0,75 М хлорида натрия. Анализ тромбина проводят в натрий-фосфатном буфере, рН 7,5, содержащем 0,20 М натрийхлорида и 0,1% PEG- 6000. Исходная концентрация субстрата составляет 0,10 мМ, а концентрация тромбина составляет 1,0 кМ в расчете на массу.

В табл. 2 приведены уровни ингибиторов и активность, измеренная в интервале 10-20 мин после стимуляции реакции. Активность тромбина для контрольной группы составляет 0,0076-0,0005 .

Результаты приведены в табл. 2.

Биологические данные, представленные в табл. 2, подтверждают превосходство соединений в соответствии с описываемым изобретением над известным соединением М-альфа-{2-нафтил-сульфонил-глицил)-4-ам идинофенилаланинпиперидин. Хотя и дан- ные втабл, 2 не выражены в виде значений Ki, но все-таки возможно определить значения К на основе данных, представленных в табл. 2. Значение KI определяется как концентрация ингибитора, требуемая для 50% ингибирования фермента в отсутствии субстрата. Присутствие субстрата, например тромбина, имеет защитный эффект на фермент. Из данных, представленных в табл. 2, следует, что все испытанные соединения имеют значение Ki ниже 6 нМ.

Для следующих соединений значения Ki были определены методом Лайнуивера и

Брука после установления равновесия фермента и ингибитора при рН 7,5.

.5

0

0 5 50

5

55

Эти соединения, включающие Ас-А1а- G u-boroArg-CioHi6, которое обладает значением Ki (конечной концентрации) 10 нМ, т.е. значением, которое считается примерно равным К| 6, превосходят сравнительное соединение еще по той причине, что их можно вводить без применения органического рас- творителя-солюбилизатора.

В случае пептидов - производных боро- новой кислоты, растворимость которых 1- 50мг/мл. органического растворителя-солюбилизатора не требуется.

Ингибиция Свертываемости крови, проявляемая при определении АРТТ и РТ.

Эффект ингибиторов протеазы на свертываемость крови in virto определяют путем измерения их действия по двум разным клиническим параметрам, времени частичного активированного тромбопластина (АРТТ) и времени протромбина (РТ). Реагенты для каждого из указанных анализов поставляет General Piagnostics, Jessup MD. Маточные растворы ингибиторов готовят в 25 мМ НЕ- PES-буферё, рН 7,5, содержащем 0,10 М хлорида натрия. Для АРТТ-анализз, раствор ингибитора (0,100 мл) инкубируют обычной человеческой плазмой крови (0,100 мл) и спонтанным реагентом АРТТ (0,100 мл). После инкубирования в течение 5 мин при 37°С к указанному раствору прибавляют хлорид кальция (0,100 мл) и время.свертываемости, измеренное в секундах, определяют на фиб- роскопе. В табл. 3 приведены данные влияния различных концентраций ингибитора на время свертываемости крови по сравнению с временем свертывания крови контроль- ных групп, установленным при отсутствии ингибитора.

Для РТ-анализа растворы ингибитора (0,100 мл) инкубируют обычно плазмой крови человека (0,100 мл) в течение 2 мин при 37°С. Затем к инкубированному раствору прибавляют симпластиновый реагент (0,200 мл) и определяют время свертываемости крови, приведенные в табл. 4.

В табл. 5 приведены суммарные данные результатов, представленных в табл. 3 и 4, показывающие расчетные концентрации ингибитора, необходимого для увеличения времени частично активированного тром- боплатина (2хАРТТ) и времени протромбина (2хРТ) в два раза.

Соединение, Название ингибитора обозначенное в табл. 3-5,7-10

ABoc-(D)Phe-Pro-boroArg-CioHi6 В H-(D)Phe-Pro-boroArg-CioHi6 С )Phe-Phe-boroArg-CioHi6 D . Ac-Phe-boroArg-CioHi6 Ингибиция свертываемости крови, установленная при определении (ТТ) (времени тромбина).

Действие ингибитора протеазы Ac-(D)- Phe-Pro-6opoArg-OH на свертывание кро- ви in virto определяют путем измерения его влияния на тромбиновое время (ТТ). Смесь, состоящую из 0,2 мл обычной кроличьей плазмы и 0,05 мл буфера, содержащего ингибитор в 6-кратном количестве требуемой конечной концентрации, нагревают до 37°С. Свертываемость .крови стимулируют путем введения тромбина (0,05 мл в 6-кратном количестве конечной концентрации). Используемый тромбин закупают от Sigma Chemical Сотр. (NT-6634, активность 1190 NIH ед/на мг белка) и готовят в буфере. Используемый как для ингибитора, так и тромбина буфер представляет собой 0,1 М трис-буфер(12,10 г/л), содержащий 0,154 М NaCt (8,84 г/л) и 2,5 мг/мл сывороточного бычьего альбумина. рН 7,4. Тромбиновое время, измеряемое в секундах, определяют на фиброскопе. В табл. 6 представлены данные влияния ингибитора на время свертыва- ния крови по сравнению с временем свертываемости контрольной группы без ис- пдльзования ингибиторов. Показатели эффекта представляют усредненное значение как минимум трех замеров. Если реакция свертываемости не происходит в течение 300 с, то ее прекращают.

Стабильность ингибиторов в человеческой плазме, определенная при АРТТ. .

Стабильность ингибиторов в плазме оценивают по их способности ингибировать свертываемость крови. В первую очередь, основные растворы (1 мкМ) ингибиторов, подлежащих испытанию, которые приготов- лены в 25 мл HEPES-буфера, рН 7,5, содержащем 0,10 М хлорида натрия, разбавляют до 50% обычной плазмой крови человека. Смеси готовят при 0°С, затем аликвоты (0,200 мл) отбирают и инкубируют в течение

2 мин при 37°С. Прибавляют одинаковый обьем спонтанно-приготовленного реагента АРТТ и замеряют время свертывания крови, как описано в примерах на с. 49. Конечная концентрация ингибитора в течение анализа свертывания крови составляет 250 нМ, Инкубационное время, приведенное в часах, и время свертывания, замеряемое в секундах, для каждого ингибитора приведены в табл. 7. Показатели стабильности для соединений Е и F определены одновременно с контрольной группой. Показатели для соединений А, В получены на другой день.

Стабильность ингибиторов в буферном растворе.

Ингибиторы, каждый при концентрации 1 мкМ, инкубируют при комнатной температуре в 0,20 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,5, содержащем 0,20 М хлорида натрия и 0,10% PEG. Затем отбирают, аликвоты (4 мкл) и анализируют на тромбиновую пробу.

8 табл. 8 приведены данные тромбиновой активности, (в %), сохраняющейся после инкубации, и продолжительность нахождения в натрий-фосфатном буфере испытуемых ингибиторов. В случае использования ингибитора А имеется незначительная потеря ингибиторной активности. Ингибитор В теряет свою биологическую активность в течение часа.........

Ингибирование свертывания крови после перорального приема ингибиторов In vivo.. .

Самки крыс (Sprague Dawley CDRats, весом 130-140 г, предоставленные Charles River Labs, Ins, Wilmington MA) анестезируют пентобарбиталом натрия (50 мг/кг, внут- рибрюшинно). На вентральной поверхности шеи выполняют срединный надрез и в одну из каротидных артерий вводят полиэтиленовый катетер с выведением его у тыльной части шеи. После выведения крысы из состояния наркоза контрольные пробы крови берут из введенного в каротидную артерию катетера, производят антикоагуляцию цитратом натрия и центрифугируют (2000 х об/м, 10 мин.). Плазму переносят в пластиковые пробирки и выдерживают на льду до их анализа. Тромбиновое время определяют в фиброскопе.

Крысы получают протеазный ингибитор Ac-(D)Phe-Pro-6opoArg-OH в носителе либо только носитель через желудочный зонд в объеме менее 4 мл, В качестве носителя используют 5% диметилсульфоксид в физиологическом растворе. Пробы крови берут в разное время после орального приема, которые анализируют как описано выше. В табл.

9 приведены полученные данные времени

свертывания крови в секундах, В случае, когда время свертывания крови превышает

300 с, в таблице указано как 300. Остальные данные показывают среднее время, необходимое для коагуляции,

, измеренное в секундах, + означает стандартное отклонение от нормы.

Ингибиция In vivo коагулирования крови после перорального приема ингибитора.

Для дополнительной демонстрации способности данного соединения ингиби- ровать свертываемость крови in vivo, крыс анестезируют пентобарбиталом натрия (50 мг/кг, внутрибрюшинно), после чего в яремную вену вставляют катетер и отверстие закрывают. После выведения крыс из наркоза перорально вводят либо 5 мг/кг ингибитора протеазы. Ac-(D)Phe-Pro-6opoArg-OH, растворенный в воде, либо равный объем воды. Через 30-60 мин всем крысам влива ют 500 ед/кг тромбина в течение 1 мин. Все 14 крыс, получающие только воду, погибли в течение 10 мин после вливания тромбина. В противоположность этому только 8 из 17 крыс, получившие ингибиторсодержащую воду, погибли в течение 10 мин, а оставшиеся жили 1 ч и в это время их усыпили.

Ингибиция in vivo свертываемости крови после перорального местного и ректального приема.

Общая методика: самцы крыс Lewis весом 300-350 г анестезируют пентобарбито- лом натрия (50 мг/кг, 1внутрибрюшинно) и в яремную вену вставляют силастиковую канюлю, прикрепленную к полиэтиленовой .трубке 50. Указанную трубку выводят наружу у тыльной части шеи и прикрепляют к шприцу через стопорный вентиль. Пробы крови (0,5 мл) набирают в шприц, который промыт цитратным буфером до каждого забора крови перед и через разные промежутки времени после приема ингибитора протеазы Ac-{D)Phe-Pro-6opoArg-OH. За- тем пробы крови переносят в герметичные емкости, содержащие цитратный буфер. Кроме того, после каждого забора крови канюлю промывают физиологическим раствором. Затем пробы крови центрифугируют (2500 об/мин в течение 15 мин) и для измерения времени коагуляции используют 0,2 мл проб плазмы. Измерения времени свертываемости крови проводят на фибро- скопе, как описано ниже. Прежде всего, плазму (0,2 мл) помещают, в фибростакан и прибавляют трис-буфер (50 мкл), рН 7,4. Буферный раствор, содержащий плазму, инкубируют при 37°С в течение 1 мин, затем

добавляют 50 мкл 24 мк/мл тромбинового раствора в трис-буфере и замеряют время коагуляции в секундах. Если время коагулирования превышает 300 с, далее указывают,

как 300.

Пероральное введение: крыс с введен. ным в яремную вену катетером выводят из

состояния наркоза до перорального приема

ингибитора. Водный раствор ингибитора

0 протеазы Ac-(P)Phe-Pro-6opoArg-OH. содержащий 3 мг ингибитора на кг массы крысы (примерно, 1 мг на крысу), в 0,75 мл воды на кг массы крысы вводят через зонд. В табл. 10 приведены полученные данные.

5 Местное применение: в брюшной полости крыс с введением в яремную вену катетером выполняют 3-х см разрез, пока они все еще находятся в наркотизированном со- стоянии. Находят толстую кишку и разъеди0 няют ее восходящую и нисходящую часть. Водный раствор ингибитора протеазы Ас- (D)Prie-Pro-6opoArg OH, содержащий 3 мг ингибитора на кг массы крысы (примерно, 1 мг на крысу) в 1 мл воды на кг массы крысы,

5 инъецируют в восходящую часть полости толстой кишки. Разрез закрывают, используя скобки для наложения шва. В табл. 11 приведены полученные данные. .

Ректальное применение: в качестве ме0 тодики для ректального введения ингибитора крысам с вставленным в яремную вену катетером используют методику Kamija. Вкратце говоря, изготавливают приспособление, состоящее из 0,89 см и 0,71 см сили5 коновых прокладок, соединенных в длину на 2 см проволочкой. Указанное приспособление вставляют в ректальное отверстие крысы, причем сначала прокладку большего размера и затем приклеивают к анальному

0 проходу соответствующим клеем. Введение ингибитора осуществляют путем инекциро- вания через расположенную снаружи прокладку. Доза для ректального приема составляет 3 мг ингибитора протеазы Ас- 5 (D)Phe-Pro-6opoArg-OH на кг массы крысы (примерно, 1 мг на крысу), в 0,6 мл воды на кг веса крысы. В табл, 12 приведены полученные данные/

Ингибиция in vivo воспалительного про0 цесса, вызванного кротоновым маслом.

Получают два раствора: в первом содержится в 5%-е кротоновое масло, известное как агент, вызывающий воспаление, в ацетоновом носителе (кротоновый раствор), а

5 второй раствор содержит 5%-е кротоновое масло в ацетоновом носителе, к которому добавлено 10 мг/мл предлагаемого соединения (испытуемый раствор), Кротоновый раствор (10 мкл) или в альтернативном варианте испытуемый раствор наносят на правое ухо каждого животного (крысы Sprague Dawley CD, весом 130-140 г, представленные Charles River Labs, Inc, Wllmington, MA). Ацетоновый носитель в чистом виде (ацетоновый раствор, 10 мкл) наносят на левое ухо каждого животного. Через час после обработки животных усыпляют, их уши отрезают, штампуют на диски размеров 1/4 дюйма в диаметре и взвешивают, Разбухание измеряют как разницу в весе между кретоновым раствором, которым обработано правое ухо и ацетоновым раствором - левое ухо. Полученные данные сравнивают с индометаци- ном, который известен в качестве нестероидного противовоспалительного средства, приготовленного и наносимого аналогичным образом как и испытуемое соединение, В табл. 13 приведены усредненные значения для соединения F, Ac-Phe-6opoArg-CioHi6. Используемый /термин доза означает количество активного противовоспалительного ингредиента в мкг (соединения А, С, D, E, F или G, или индометацина) в растворе нанесенном на правое ухо, а п означает количество крыс, которое используют в каждом тесте. SE означает стандартную погрешность,

. В табл. 1.4 показана антивоспалительная активность соединений А, С, которые взяты при одних и тех же условиях (доза

199мкй: .; /- : ..; -.. ., v

Ингибирование плазмина брролизино- выми пепшдами..

Плазмин плазмы человека получают от фирмы American Diagnostics, Greenwich, Ст. концентрация активных центров в препарате, определяют методом, аналогичным методу; описанному Coleman и др. Анализ ферментов осуществляют на спектрофото- метре Perkln-Elmer Lambda 4С с использо- .ваянием вычислительной машины типа Perkln-Etmer 7300. В качестве буфера используют 50 ммолей трис-буфера, рН 7,4, содержащего 110 ммоль хлорида натрия, 0;1% ПЭГ 6000 и 0,30 ммоль H-(D)Val-Leu- Lys napa-нитроанилида, К этой смеси прибавляют соответствующие количества ингибитора и затем плазмина. При 25°С измеряют повышение интенсивности погло- щения при 405 нм по времени. Поскольку Ингибиторы связываются медленно, скорость реакции определяется по касательной, проводимой к кривой реакции, по истечении 10 мин от начала реакции, В каждом случае осуществляют контрольное испытание без применения ингибитора. Во всех случаях концентрация плазмина составляет менее 10% концентраций ингибитора.

Результаты приведены в табл. 15.

Проведенные испытания показали, что соединения по изобретению малотоксичны, обладают высокой ингибирующей активностью с широким спектром действия, кроме того, все эти соединения могут быть введены в организм без применения растворите- ля-солюбилизатора.

Формула изобретения

Способ получения производных борсо- держащих пептидов общей формулы

R1-Z-NH-CH-BY-HW

;:... - -. R2. - : -.

RI - Н, Ac, Bz, Вое, Boc-Leu;

R2 - (CH)anNHC(NH)NH2, n 3,4;

Y - остаток пинаконового или пинанди- олового эфира;

HW-CeHsSOaH. HCI, НВг

Z D,L-Phe, DPhe-Pro, DPhe-Phe, Ala- Lys, Pro-Phe, Ala-Phe, Glu-Phe, Ala-Glu, Giu-Gly, Gly-Leu-Ala, пиро-Glu-Phe; Val- Val, (D)Val-Leu, Lys-Pro, Leu-Thr. ..i отличающийся тем, что амин формулы : HaN-CHBY HW -

(CH2)nWi, ; где n 3. 4, W и Wi Cl, Br;

Y - остаток пинаконового или пинанДи- рлового эфира, вводят во взаимодействие с аминокислотой или пептидом формулы

.. RI-Z-OH- . : ..... : .... j.:.; /

где значения RI и Z указаны выше, и полученный продукт формулы .

RI-Z-NHCH-BY-HW г

. - ;.....: (CH2)nWl . : .:. . где значения Ri, Z, Y, W, Wi, n указаны выше, . . - : . обрабатывают азидом щелочного металла с образованием соединения формулы

R1-Z-NH-CH-BY-HW

(СН2)пМз

где значения RI, Z, Y, n и W указаны выше, которое затем восстанавливают в присутствии органической или минеральной кислоты, предпочтительно бензолсульфокислоты, с образованием соединения

Ri-Z-NH-C4H-BY HW (CH2)nNH2

где значения Ri, Z, Y, W, n указаны выше, и последнее подвергают взаимодействию с цианамидом в низшем спирте при температуре 50-150°С.

Ингибирование кзлликреина плазмы человека

Ингибированиё тромбина

Таблица

Т а б л и ц а 2

Время активированного частичного тромбопластина, измеренное в секундах

Протромбиновое время, измеренное в сек.

Ингибирование свертывания крови

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

43

Тромбиновое время

В качестве ингибитора испытан Ac(D)Phe-Pro-boroArg-OH.

Среднее время, необходимое для свертывания, измеренное в секундах, ± стандартное отклонение.

Таблица

i

Устойчивость ингибиторов в плазме человека

Устойчивость ингибиторов в буфере

1807988

44 Таблица 6

Таблица 8

451807988 46

Таблиц а 9 Ингибирование свертывания крови вслед за пероральным дозированием In vivo

.: ND не определено.

Ингибирование In vivo свертывания крови вслед за пероральным введением (ингибитор Ac-(D)Phe-Pro-bproArg-OH)

Данные представляют собой среднее для 2 крыс.

Данные представляют собой среднее для 3 крыс.

.... .. ,.-.; -; л.- . :. - ,-;-.. .. . ;. : Та б л и ц а 11 . ..

Ингибирование In vivo свертывания крови после введения через ободочную ; v кишку (ингибитор Ac(D)Phe-Pro-boroArg-OH)

Таблица 10

471807988 48

Таблица 12

Ингибирование In vivo свертывания крови после ректального введения (ингибитор Ac-{D)Phe-Pro-boroArg-OH)

Данные от 1 крысы.

Средние данные для 3 крыс.

Ингибирование воспалительного процесса, вызванного кротоновым маслом

...- ;. . Таблица 14

.. : . .. .. . ., .;. , -..- . . .: ... .. .;...

Ингибирование воспаления, вызванного кротоновым маслом

Ингибирование плазмина

Таблица 13

Т а б л и ц а 15

BSA - Бензолсульфоновая кислота TFA - Трифторуксусная кислота

Продолжение табл.15

Таблица 16