Способ получения ферментационной жидкости, содержащей витамин в Советский патент 1977 года по МПК C12D5/06 

меной ее кокцешрнровашюй питательной средой, содержащей необходимые питательные вещества, предпочтагельно десятикратной ковдентращг-, я меушюлом в количестве 0,5-1,5 об.%,

на второй стадак, пренмуп ственно через 24 ч, ферментадаонную жидкость не отбирают, а добавляют только лишь Лйтанол в количестве о, 5-1,5 об.%,

на третьей стадаш - в последующие 5-10дней вновь осуществляют отбсф5-15% ферментацнон. кой жидагосш с добавлением 0,5-1,5 об.% метанола и соогветствуювдго отобранному количеству жидкости объема питательной среды,

При этом концентрированную яигателеную сред целесообразно вводить при рН среды, пргнмущественно равном 5,5-5,8.

Благодаря тшсой посгкдозательностн в постадайной. подкормке обеспечив ается. постепеш1ое сянхронкзирование цикла размножеш1я всех 6akreрнальных популяций, в результате чего постепенно нарастает концентрация бактерий и соотаетственно этоА у также концетграцня виталшна Bj в фер ентяционной жидкости.

Высокая концентрация бактерий в ферментацно шой жидкости мохжт быть достигнута также за счет того, гто из другой ферментапяошюй жидкоста, получаемой благодаря осуществляемой известьш методом ферькнтацш, отделяют живые 6aKiepiffl, например,це трифупфованием и готовят концентрат бактериалыгых клеток примерно с

80(ЮО- 9{ЮОО мкг/л вйгаьшяа Bj j. Псагучаемый кони нтрат добавляют в ферментационную жидкость, являющункя исходной средой, с таким расчетом, чтобы концентрацяя витамина Bt а в срецц достигала требуемого значения, например 30000 мкг/л. После этого можно сразу же перейти на полуиепре{й 1вную постадийную ферментацию.

Важную роль в предяагаемом способе играет дозировка метанола, вводимото как в подготовительных фазах способа, так и во время продолжаюЩ5ЙСЯ согласно изобретению полунепрерывной ферментащш в ферментационную жидкость. Продела{щые опыты подтвердили, что имеется однозначная я линейная взаимосвязь и«жду количествами ежедневно вводимого метанола и выделяемого так называемого биогаза, по объему которого в единицу врел5етш можно однозначно судить о количестве метинола, потребляемого бактериями. Поэтому целесообразновводить метанол порциями, которые необходимы только для замены потребляемого колитества, поскольку избыточная дозировка может привести к скоплению метанола в фермешгадаонной ядадкости, а избыток метанола мозиет оказьтать токсичное воздействие на популяцию бактерий. Табл. I показьшает эту взаимосвязь в пересчете на 1л ферментационной жидкости. С йомощью этой таблвды можно, исходя н объема газа, получаемого в 1 л ферментационной жидкости за 1 ч, определить количество метанола, которое необходимо ВВОДИТЬ ежедневно в ферментационную жидкость. Таблица 1

Таким образом, из таблищ) видно, что необходимое количество MstsMom для ежедневной добавки в пересчете на весь обмм ферментащюпной жидкости составляет 0,4-1,5 об.%, .

Предлагаемый способ имеет преимущества шред известгомт: позволяет получить высокие концентращте витамина BI в ферментационной жидсости порядка 30 000-40 000 мкт/п, позволяет применять смешаняью бактериальные популящш в промышленных 4крментад онных процессах.

Пример 1. Для проведения процесса фертлентшдт берут ферментаторы с пояезньш объемом Шл к:а5кдын, снабже шые трубкалга для отвода

газа, к заполшкзт соответственно Юл фе|лиентациогаюй жидкости, получаемой лзвестньпи способом путем полунепрерывной ферментащш со CMSпйнной мезофильной метанпроизводящей популя1щей и содержащей 9940мкг/л витамина. Ни. Согласно изобретегшю в исходную среду вводят добавку (при одновременном отборе такого же количества ферментационной жидкости) питательной среды Следующего химического состава: Концентрат кукурузного жидкого экстракта, г/л5

Гидро1шзат пивных дрожжей, мл/л1

Меласса, г/л2 Отработаннь(й сульфатный орпок, г/л1,6 Экстрактпеченн, , г/л1 П дроокись аммония, 24%-ная, мл/л 1,1 аммониевый гщфогенфосфат, т 1л 2 : Гвдрокарбонат аммония, г/л3 сульфат аммония, г/л1,5 ; Гидросульфит нат1жя, г/л0,02 Хлсфид магния, г/л0,1 Хлорид кобальта, г/л0,01 Ангидрид янтарной кислоты, г/л0,006 Глиции, г/л 0,006 5,6 - Димегилбензимидазол, г/л0,003 Наряду с этой питательной qJeдoй, называемой ферментационную жидаость (рабочую среду) ежедневно вводят 0,6 об.% метанола. Ферментеры А и В заполняют соответственно каждый 10л ферментационной жидкости, выдерживают при 32-34 С и в течение трех дней вводят в них ежедневно лишь 50мл метанола. На четвертые сутки отбирают 1 л ферментационной жидкости и вводят такой же объем концентрированной питательной среды следующего состава (N8 j о): Концентрат кукурузного жидкого экстракта, г50 Гидролизат пивных дрожжей, 20%-ный, мл10 Меласса, г20 Отработанный сульфитный шрлок, г10 Экстракт печени, 10%-ный, мл10 Гидроокись аммония, 24%-ная, мл11 Диаммониевый гидрогенфосфат (двухзамещекный фосфорнокислый аммоний), г20 Гидрокарбонат аммония, г30 Сульфат аммония, г15 Гидросульфат натрия, г1,0 Хлорид магния, г1,0 Хлорид кобальта, г0,1 Ангидрид янтарной кислоты, г0,06 Глицин, г0,06 5,6 - Диметилбензомидазол0,03 Вода,мЛДо 10 Предварительно замеряется объем газа, вькодящего через газоотводную трубку,и, поскольку количество газа, образуемого за час, в пересчете на 1 л ферме11та шонной жидкости составляет примерно 160 мл,то одновременно с питательной ередои NBio вводят так же и 70 мл (0,7 об.%) метанола. В поспедующие 5 дней, т.е. на 5, 6, 7, 8 и 9-е сутки опыта вводят только добавку метанола без отбора жидкости, а именно в количествах, соответствующих скорости вьщеления газа согласно табл. 1. На десятый день снова отбирают 1 л ферментационной жидкости, добавляют 1 л питательной среды NBjo и соответствующее количество метанола. То же самое повторяют и на 17-ый и 25-ый день, причем в промежутках - в 11, 12, 13-ый дан и далее в J8, 20, 21, 22, 23 и 24-ый дни гаова вводят без отбора ферментационной жидкосга лишь соответствуюгоде количества метанола. С 25 дня начинают осуществлять аолунепрерывную ферментацию. На 26-ой день добавляют только лтетанол без отбора жидкости, затем с-27 по 32 день отбирают ежедневно 1 л ферментационной жидкости, добавляют 1 л питательней ереды N8j и необходимое количество метанола, на 33-ий день поспе отбора л ферментационной жидкости снова вводят 1 л питательной среды NBjo- Далее цикл повторяется. В течение времени, а иьенно с 25 по 75 день, определяют содержание витамина Bj j в обобранной ферментационной жидкости. При этом имеет IWBCTO лишь незначительное расхождеше концекграцяя витамина Bj j в ферментационных жидкостях, средние значения составляют, мкг/л: для фермеетера А43268 для ферментера В43543 П р и м е р 2. Способ осуц ствляют согласно примеру 1, но с той лишь разницей, что на 4-ый день осуи ствляют полунепрерывную ферментавию, как в 25-ый день, по примеру 1. В зтом случав концентрация витамина В( в ферментаадошюй жидкости, получаемой известным способом и используемой в качестве исходной рабочей среды, составляет 10 600 мкг/л. Наряду с период} чески чередуюидейся добавкой Ш1тательной среды NBio и соответственно NBj ежедневно вводят следующие количества метанола: День ся1ьгтаМетанол, мл 3-9.80 10-12100 13-14120 15130 17-150 Ежедневно вводимые в процессе опыта количества метанола выбирают по табл. 1. В этом опыте непрерывно стределяют содержание витамина BI j в ферментационной жкдкоста. В табл. 2 показано постепенное повышение концентращш вплоть до 50-го дня опьгга. Т а б л е t 2

Продрлжение таблицы 2.

Количество витамина В i j

День опыта в ферментационлсй жидкое.и, мкг/л

26400

31 27700 32 35 36 37 38 39 43 44 45 46 49 50 25944 26600 32800 32200 33270 28152 30400 32200 27200 30500 31600 П р и м е р 3. Ферментатор с полезным объемом 10 л, снабженный трубкой для отвода газа, заполняют 4500мл ферментационной жидкоста, получаемой известным способом посредством полунепрерывной ферментации со смешанной мезофнльной метанпроизводящей бактериальной популяцией при использовании упомянутой в примере 1 питательной среды NB,, содержащей 9940 мкг на 1 л витамина BI 2- Затем вводят при 32° С добавку в ввде 500мл бактериального концентрата, содержащего 88000 мкг/л витамина BI г, Нри зтом этот концентрат берут из другого ферментатора. К 5{Ю мл рабочей среды, содержащей теперь 18500 мкг/л витамина В, j, добавляют 500 мл питательной среды NBio и 75 мл метанола питательной среды N8,0 и 75 мл метанола. На второй и третий день ферментации жидкость не отбирают и осу ществляют ежедневную добавку лиил 75 мл метанола. С 4-го по 10-ый день отби|)ают соответственно по 500 мл ферментационной жидкости и заменяют тем жь объемом питательной среды NO) и 75 мл метанола. В 11-ый день при тсж ЖЕ порции отбираемой жидкости добавляют снова концентрированной питательной средыМВю и обычное количество метанола. Далее цикл повторяется, как в примере 2. В табл. 3 показан один из вариантов постепенного нараста1шя йонцентрашш витамина В j в ежедневно отбираемых порциях ферментациошюй жидкости. Таблица 3 День опыта Содержавде витамина BI j в ферментационной жидкости,

8

Продолжение таблицы 3.

10

15 П р и м е р 4. Промышлеша 1й ферментатор с 50 м полезного объема заполнен 50 м ферментационной жидкости, служащей исходной средой, получаемой аналогично первым примерам и содержащей 9936 мкг/л витамина Bj первые три дм согласио изобретению добавляют по 25 л метанола (для облегчения перемешивания метанола и устранения локальной избыточной дозировки целесообразно разбавлять метанол добавкой двух-трехкратного количества воды, в этом случае, однако, следует отбирать соответствующий объем ферментационной жидкости с тем, чтобы избежать превышения всего объема). На четвертый день отбирают 5 м ферментационной жидкости, добавляют равный объем питательной среды NBio и 400л метанола. Затем на 10-ый, 14, 21 и 27-ой дни отбирают снова 5 м ферментационной жидкости (добавляя обычное количество метанола), а на 5-9-ый, ,11- 13-ый, 15-20-ый и 22-26-ой дни добавляют только метанол в указанной последовательности. С 27 дня начинается обычнь й периодический цикл, т.е. на 27, 33, 42, 46, 50, 59, 65 и 75 дш добавляют без отбора жидкости лищь метанол, а в остальные дни ферментационного процесса, проводимого вплоть до 77 дня, отбирают по 5 м ферментационной жидкости и это количество заменяют равньпм объемом питательной среды NBj. Количество ежедневно вводимого метанола составляет максимально 750л, при зтом соответствующие количества определяют по табл. 1. Содержание витамина BI j в ферметационной жидкости составляет примерно 30 000 мкг/л. С дня до конца опыта было получено среднее небольшим отклоненнзначение (лиив ем) 32750 мкг/л. Формула изобретения 1. Способ попучеюш ферментационной жидкостя, содержащей витамин Bj 2 путем гнаэробной ферментации смеиганной культу|ш анаэробных метанов1 1х бактерий на питательней cpepf в присутствии метанола, отличаюшийся тем, что, с 1|елью увеличения конкентрацки бакте Я{й в ферментационной жидкости и соответственно,повышения выхода витамина В, 2, ферментацию осуществляют постадийно: на первой стадии проводят отбор ферментационной жидкости в количестве 5-15% с заменой ее концентрированной питательной средой, содержащей жобходамые питательные вещества, преимушестве1шо десятикратной ко центрации, и метанолом в кошпестве 0,5-1,5 об.%, на второй, преимущественно через 24 ч - без отбора жидкости с введением метанола 0,5-1,5 о6.%, на третьей стадии - в последующие 5-10 дней вновь осуществляют отбор 5-15% ферментационной жидкости с добавлением 0,5-1,5 об.% метанола и соответствующего отобранному количеству жидкости объема питательной среды. 2. Способ по п. I, отличающийся тем, что концентрированную питательную среду вводят при значениях рН среды преимущественно равном 5,5-5,8. Источники информации, принятьк во внима1ше при экспертизе: 1.Патент Австрии № 266311, кл. 30 F 9, опублик. 1969. 2.Авторское свидегельсгво V 338114, кл. С 12 О 5/06, заявл. 1969,