Способ получения ноурзеотрицина Советский патент 1989 года по МПК C12P1/06 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения стреп тотрицинового антибиотика ноурзеотри цина.

В случае биосинтеза микроорганизмом Streptomyces ШЕТ 1А 389U b стрептотрицинового антибиотика ноур- зеотрицина известно, что аминокислоты и аммонийные соли отрицательно влияют на этот биосинтез (Grafe, U., Stendal, А., Bocker, Н.и Thrum, Н. Z.Allg. Mikrobiol. 20, 185-194, 1980

Недостатком технического применения является то, что нитрат аммония является взрывчатым веществом и использование его допускается только в сочетании с мерами безопасности. Кроме того, обнаружено в фильтрате культуры в конце лабораторной ферментации не более 3000 мкг ноурзео- трицина на 1 мл только при прибавлении относительно дорогих и вредных рпя окружающей среды ингибиторов дыхания и переноса аминокислот, например о-аминобензойной кислоты (ОАВА) (Grafe, и., Bocker, Н., Reinhardt, G и Thrum, Н. Z. Allg. Mikrobiol 14, 659-673, 1974.

Известно, что избыточный фосфат отрицательно влияет на биосинтез ряда вторичных метаболитов (Martin, J.F., Adv. Biochem. Eng. 6, 105-127, 1977. Поэтому некоторые технические процессы микробиологической ферментации для получения антибиотиков проводят при концентрациях фосфата, субоптимальных для роста микробиологического продуцента. В технических фер- ментациях для получения вторичных метаболитов, как правило, используют такие компоненты среды растительного и животного происхождения, как крахмал, соевый шрот, кукурузный экстракт, меласса, мясной экстракт и др. Общее содержание фосфата и биологическая доступность (растворимость) комплексного субстрата различное в зависимости от его происхождения и обработки.

Таким образом, общий фосфат различного содержания, переносимый через комплексные субстраты в среду глу- . бинного культивирования, присутству- ет в начале ферментации в виде растворенного немедленно доступного фосфата.

o

S

0

5

0

5

0

5

0

Цель изобретения - повышение концентрации целевого продукта в культу- ральной жидкости.

При ферментациях дпя получения ноурзеотрицина после понижения начальной концентрации фосфата ниже считав шегося ранее оптимальным значения и последующего прибавления соответствующего или более высокого количества фосфата в процессе культивирования, добавляемого по определенному режиму времени, получаются значительно более высокие выходы ноурзеотрицина.

Кроме того найдено, что в CaCOj- содержащей питательной среде при замене источника азота нитрата аммония на сульфатсодержащий сульфат аммония в соотношении, стехиометрическом в отношении содержания азота, начальная концентрация фосфата снижается от 15 мг/л фосфатного фосфора (Р) до 1-3 мг/л в собственно неизменной среде после стерилизации водяным паром под давлением.

Начальную концентрацию растворимого биологически немедленно доступного фосфата в простерилиэованной среде можно снизить соответствующим согласованием режима стерилизации и содержания сульфатных ионов и неор- анических солей или ионов металлов, дающих вместе с фосфатными или сульфатными ионами трудно растворимые осадки.

Причиной снижения такой начал ь- ной концентрации в случае присутствия достаточного количества сульфатных ионов является сдвиг кислотности слабокислой питательной среды в сторону щелочных значений рН в процессе стерилизации, вызываемый осаждением CaS04 и связанный удалением из среды физиологически кислых сульфатных ионов. Соответственно начальная концентрация растворимого или биологически доступного фосфата, снижается также вследствие установки щелочного значения рН перед стерилизацией. Увеличение значения рН обеспечивает создание благоприятных условий дпя осаждения фосфата с определенными присутствующими в питательной среде ионами металлов. Осаждению фосфатсо- держащих осадков способствует направленное прибавление таких ионов металлов, как, например, железо (III),

алюминий (III), магний (II), кальций (II), цинк (II), и другие.

Особенно благоприятное влияние на осаждение фосфата оказывает применяемый в большинстве технических ферментации метод стерилизации непосредственно воздействующим водяньм паром под давлением, а также присутствие СаСО,, который используется в качестве буфера для регулирования рН в процессе ферментации.

Содержание фосфата можно снизить также уменьшением доли фосфатсодер- жащих комплексных субстратов. Так, например, используемый в ферментации ноурзеотрицина зкстракт соевого шрот содержит около 8 г фосфатного фосфора на 1 г шрота.

В перечисленных условиях начальна концентрация растворенного или доступного фосфата настолько низкая, что специфические для ноурзеотрицино продуцирующих микроорганизмов верхние предельно допустимые значения фосфата остаются ниже этого предела. Таким образом, такие небольшие концентрации фосфата позволяют путем прибавления определенного количества фосфата после стерилизации получить среду, в значительной степени стандартизованную по фосфату. Кроме того режим подачи фосфата позволяет управлять фосфатным обменом микроорганизмов таким образом, чтобы можно было получить продукт с высоким выходом. Фосфат может подаваться в виде раствора или твердого вещества или суспензии. Фосфат может присутствовать либо в форме свободных фосфатных ионов, либо в виде химически или фи- зически связанного фосфата. Подачу фосфата или фосфатсодержащих веществ осуществляют в зависимости от режима подачи после стерилизации или во время ферментации способом разового и/или многоразового и/или непрерывного прибавления. Непрерывное прибавление фосфата может осуществляться с различной скоростью подачи во время ферментации.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Лиофилизированные на почве консервированные споры се- лектанта NG 13-14 ноурзеотрицинообразующего штамма Streptomyces noursei i IMET lA 3890 b йысевают на подходящую агаровую среду, например, агар

,с 5 0 5 0

0

Эмерсона. Примерно через 7-дневный период инкубирования при З0 с вырезают участки мицелиального газона размером около 2 см, а ими засевают культуру предварительного выращивания. Среда предварительного выращивания содержит на 1 л водопроводной воды следующие вещества, г: гйюкоза 40, обезмасляная соевая мука 15, 0,3, NaCl 5 и СаСО, 3. Кислотность среды устанавливают перед стерилизацией на значение рН 6,5. Эту среду заливают в закрываемые ватной пробкой широкогорлые бутылки емкостью 500 мл каждая в количествах по 50 мл. Стерилизацию осуществляют 35-минутным нагревом до 121°С в автоклаве.

Засеянные культуры предварительного выращивания инкубируют в тече- н.ие 48 ч при 29°С на качалке. При помощи 150 мл полученного таким образом посевного материала засевают 2500 мл основной культуры в лабораторном ферментаторе.

Для основной культуры используют среду, содержащую в 1 л следующие питательные вещества, г: картофель- ный крахмал 32, глюкоза 29, обезмас- леная соевая мука 11, (NH4)iS04 11, MgSO xyHjO 2, NaCl 1, СаСО 6 и 0,5. На 2500 мл питательной среды прибавляют 1 мл антафрона в качестве пеногасителя на силиконовой основе. Кислотность перед стерилизацией имеет значение рН 6,0. После стерилизации заполненного 250 мл культуральной жидкости ферментатора при в автоклаве и последующего охлаждения до ЗО с стартовую кислотность устанавливают от рН 8,4 до рН 6,8, прибавляя асептическую добавку 10%-ной стерильной серной кислоты. Засеянные ферментационные среды инкубируют в течение 468 ч при и скорости аэрации 2500 мл воздуха в 1 мин при перемешивании с числом оборотов 800 об/мин. Лпустя 1,5 ч после засева основной культуры, при помощи перистальтического насоса-дозатора непрерьтно прибавляют раствор 4 г KHjPO на 1 л дистиллированной воды в течение 5 ч со скоростью подачи 1,8 мл/ч; вслед за этим раствор прибавляют в течение 21 ч со скоростью дозирования 3,5 мл/ч. Во время ферментации в асептических условиях периодически

514511656

берут пробы культуральной жидкости(180 об/мин). Используя 12UU мл nojiyи в них методом диффузии в агар сченной таким образом культуральной

использованием микроорганизма Bacil-жидкости первой предварительной кульlus subtilis АТСС 6633 в качестветуры, на второй стадии предварительтест-микроорганизма определяютного культивирования засевают 150 л

содержание ноурзеотрицин-основания,термостерилизованной среды (в тече-.

глюкозы, аммонийного азота и твердыхние 60 мин при ) такого же сое-веществ. Параметры РО, рН и содер-тава, как на первой стадии предварижание COj в отходящих из аппарата IQтельного культивирования, содержащейгазах контролируют в ходе/ процессася в ферментаторе из специальной выметодом измерения с регистрацией.сококачественной стали (общий объем

Снижение значения кислотности куль-250 л) , оснащенном устройствами для

туральной жидкости ниже значенияподачи стерильного воздуха и перемерН 5,8 предотвращают прибавлением 5шивающим устройством. Культивирование

стерильного 5%-ного раствора едкогопроводят при 27-29 С, скорости работы

натра.перемешивающего устройства 240 об/мин

При снижении концентрации глюкозыи скорости подачи воздуха 1 л на 1 л до 5 г/л или. аммонийного азота докультуральной жидкости в 1 мин. 0,5 г/л, что отражается на увеличе- . 2о Для основной культуры используют НИИ измеренных значений рН и РО аферментаторы из специальной высоко- также на снргжении содержания СО качественной стали (общий объем - в отходящих газах, прибавляют перио-710 л), оснащенные устройствами для дически 25 г глюкозы или 10 г подачи стерильного воздуха и располо- (NN4)4804 в виде концентрированных 25женным в центре аппарата перемешиваю- стерильных растворов.щим устройством, которые заполнены

Дальнейшую ферментацию проводят500 л питательной среды каждый (ребез прибавления , глюкозы ицептуру см. пример 1). В качестве

(NH4)iS04 в аналогичных условиях. По-пеногасителя прибавляют, 0,5 г/л ансле прекращения ферментации в культу- JQтафрона. Кислотность устанавливают

ральной жидкости присутствуют четкоперед стерилизацией на значение в

обнаруживаемые .количества глюкозыпределах рН 6,7-7,0. Стерилизацию

и аммония. Концентрации ноурзеотри-питательной среды (без компонента

цин-основания, определенные в фильт-глюкозы) проводят на месте предвариратах культур обоих различных фермен-тельным подогревом паром рубашки притационных процессов, приведены в .мерно до 70 с и последующим нагревом

табл. 1.острым паром до 121°С в течение

П р и м е р 2. Лиофилизированный15 мин. После охлаждения до темперана глюкозо-желатине консервированныйтуры около 30°С прибавляют в асептимицёлий (вес брутто консервированного ческих условиях глюкозу в виде 50%-

содержимого - около 300 мг) названно-,ного водного раствора, раздельно прого в примере 1 ноурзеотрицинообразую-стерилизованного 30-минутным нагревом

щего щтамма стрептомицетов суспенди-до 121 C. Перед посевом при помощи

руют с 3 мл 0,9%-ного раствора хло-стерильной 10%-ной серной кислоты ристого натрия, 0,5 мл этой суспензии снижают стартовую кислотность рН

служит в качестве инокулюма для 400мл-8,6 до значения в пределах рН 6,9-7,1. среды предварительного культивирова- Ферментационные среды основной

ния первой стадии.культуры, засеянные каждая 5% иноку-.

Среда предварительной культурылюма второй стадии предварительного

имеет тот же состав и кислотность,культивирования, культивируют в течто в примере 1. Среду заливают в за-чение 120 ч при температуре в предекрываемые ватной пробкой широкогорлыелах 28-30°С и со скоростью подачи

бутылки емкостью 2500 мл в количествахвоздуха 500 л в 1 мин (давление

по 400 мл. Стерилизацию проводят0,14-0,16 МПа) при перемешивании

35-минутным нагревом до 121 С в авто-(320 об/мин), клаве. К одной из двух культур ферментаОхлажденные до комнатной темпера- тора, начиная со 2-го ч и кончая 32-м

туры и засеянные культуры инкубируютч после засева, прибавляют при помов течение 48 ч при на качалкещи перистальтического насоса-доздто7

pa с постоянной скоростью водный раствор, содержащий 87 мг/л КН2Р04, так что в течение 30 ч на 1 л культуры прибавляют 40 мг фосфатного Р.

Во время ферментации в асептичес- ких условиях периодически берут пробы культуральной жидкости и в них методом диффузии в агар с использованием микроорганизма Bacillus subtili ATGC 6633 в качестве тест-микроорганизма- определяют концентрацию ноур- зеЬтрицин-основания и содержание глюкозы, аммонийного азота и твердых веществ. Параметры рН и содержание СО в отходящих газах контролируют в ходе процесса измерением с регистрацией.

При падении концентрации глюкозы ниже 5 г/л или аммонийного азота ни- же 0,5 г/л, что видно по нарастанию значений рН и снижению содержания СО в отходящих газах, периодически прибавляют 5000 г глюкозы или 1800 г сульфата аммония в виде концентриро- ванного стерильного водного раствора

В другую культуру ферментатора фосфата глюкозу или сульфата аммония не добавляют. Регулирование значения рН не осуществляется; непрерывно из- меряемые значения кислотности лежат в пределах рН 6,4-7,2. В момент прекращения ферментации в культуральной жидкости содержится более 5 г/л глюкозы и 0,5 г/л аммонийного азота.

Концентрация ноурзеотрицин-основа- ния, определенные в фильтратах культур обеих различных ферментации, приведены в табл. 2.

П р и м е р 3. Лиофилизированный на глюкозо-желатине консервированный -мицелий (вес брутто консервированного содержимого около 300 мг) селектанта ноурзеотрицинообразующего штамма 1МЕТ IA 3890 b обрабатывают в отноше- НИИ предварительного культивирования, как описано в примере 2.

Для основной культуры используют лабораторный ферментатор общим объемом 7 л, оснащенный устройствами для подачи стерильного воздуха и расположенным в центре перемешивающим устройством, который заполняют 4,5 л питательной среды.

Культивирование проводят в модифи- цированной среде (по примеру 1), содержащей 60 г/л глюкозы. В качестве пеногасителя прибавляют 0,5 г анта165

Q 5

JQ 25

Q

5

5

фрона Ш-40 на 1 л культуральной жидкости.

Для моделирования технических условий стерилизацию проводят в ферментаторе из специальной высококачественной стали, заполненном 2500 л питательной среды без глюкозного компонента. Кислотность устанавливают перед стерилизацией на рН 7,4. Стерилизацию проводят на месте предварительным Подогревом паром рубашки до и последующим нагревом острым паром до в течение 15 мин. После охлаждения до прибавляют в асептических условиях глюкозу, раздельно про- стерилизованную в виде 50%-ного раст- в.ора 30-минутным нагревом до 120°С. Перед засевом понижают стартовую кислотность от значения рН 8,1 серной кислотой таким образом, чтобы стартовое значение рН составляло после засева 7,4. Ферментационную культуру засевают 4% инокулюма второй стадии предварительного культивирования. Для проведения опыта из ферментатора переводят 4,5 л среды в лабораторный ферментатор, который стерилизуют раздельно в незаполненном состоянии в автоклаве.

Основную культуру выращивают в течение 146 ч При 29 с и скорости аэрации 4,5 л воздуха в 1 мин. Начальное число оборотов перемешивающего устройства 800 об/мин увеличивают для улучшения снабжения культуры кислородом; начиная с 28-го ч число оборотов мешалки составляет 1000 об/ /мин. Между 2-м и 40-м ч после засева при помощи перистальтического насоса прибавляют 784 мг в виде водного раствора с разной скоростью подачи в пределах 1,25-1,75 мг фосфатного Р в 1 ч и на 1 л культуральной жидкости. Автоматической подачей 25%-ного водного раствора аммиака обеспечивают поддержание регулируемого значения на уровне не менее рН 6,2 и тем самым достаточное снабжение культуры аммонийным азотом. Глюкозу прибавляют периодически в виде концентрированного водного раствора тогда,:когда результаты анализов, проводимых по ходу ферментации, показывают падение концентрации глюкозы ниже 10 г/л. Во время ферментации в асептических условиях периодически берут пробы культуральной жидкости и в фильтратах культуры определяют концентрацию ноурэеотрицин-основания мтодом диффузии в агар (табл. 3).

Пример4. В процессе фермен тации, проводимом аналогично примеру 3, долю сульфата цинка среды основной культуры заменяют на 0,2 г/л Fe,j,(SO)j- , Концентрация, ноурзе трицина в фильтрате культуры составляет после 120-часовой ферментации 8200 мкг/мл (табл. 4).

Пример5, В процессе ферментации, проводимом аналогично примеру 3, долю сульфата цинка заменяют

на 0,13 г/л Al(S04) 5 tSHjO. Концен рация ноурзеотрицина в фильтрате культуры составляет после 120-часовой ферментации 8400 мкг/мл (табл.4

Примерб. В дальнейшей ферментации, проводимой аналогично примеру 5, количество содержащегося в питательной среде обезмасляного соевого шрота снижают от 11 до 4 г/л Лалёе значение рН среды устанавливают перед стерилизацией разбавленным водным раствором едкого натра на рН 8,1. После стерилизации паром под давлением значение рН устанавливают концентрированной серной кислотой таким образом, чтобы оно сосг тавляло рН 7,2 после засева. Фосфат прибавляют между 2-м и 72-м часами при помощи водного раствора KHjPO, который прибавляют с постоянной скоростью таким образом, чтобы бьшо обеспечено снабжение фосфатом в количестве 1,4 мг фосфатного Р в 1 ч и на 1л культуральной жидкости. В процессе ферментации глюкозу пе

риодически прибавляют таким образом,, чтобы концентрация глюкозы не снизилась ниже 1 г/л. Значение рН поддерживают титрованием 25%-ным раствором гидроокиси аммония на уровне рН 6,0.Получаемые концентрации ноурзео- трицина приведены в табл. 5.

Таким образом, использование предлагаемого изобретения позволяет повысить концентрацию антибиотика в культуральной жидкости.

зобретения

Ф о р м у si а и

Способ получения ноурзеотрицина путем ферментации штамма Streptomyces noursei lA 3890 в стерильной питательной среде при аэрации, перемешивании и регулировании величины рН, концентрации глюкозы и аммонийного азота с последующим выделением целевого продукта, отличающийс я тем, что, с целью повышения концентрации целевого продукта в культуральной жидкости, начало ферментации ведут при лимитировании фосфата, при этом снижение начальной

концентрации фосфата в питательной среде осуществляют в процессе стерилизации в присутствии фосфатосаж- дающих ионов металлов и карбоната кальция с одновременным повышением величины рН среды и концентрации ионов сульфата, а через 1,5-2 ч от начала ферментации осуществляют дробиую подачу фосфата в культуральную жидкость.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано при производстве антибиотиков. Цель изобретения - повышение концентрации целевого продукта, в культуральной жидкости. Сущность предложения сводится к тому, что питательную среду для выращивания продуцента Streptcmyces noursei lA 3890 подвергают стерилизации, при этом в среду дополнительно вводят фосфат- осаждающие ионы металлов и карбонат кальция, концентрацию ионов сульфата увеличивают и подщелачивают среду для снижения концентрации фосфатов. --, В процессе ферментации, осуществляемой в условиях аэрации и перемешивания, регулируют величину рН, кок- центрацию глюкозы и аммонийного азота, а начиная с 1,5-2 ч от начала ферментации дробно подают в культу- ральную жидкость фосфаты. После завершения ферментации выделяют целевой продукт. 5 табл. i (Л

. Т а б л и ц а

.Содержание ноурзеотрицина в культурах штамма Streptomyces noursei IMET lA 3890 b-ll NG 13-14 с добавками KHj,P04 , глюкозы и (NH4),jS04 и без добавок в лабораторном ферментаторе в зависимости от времени

ферментации

1035

2980 5412

8311 8800

249

165 294

213 195

140,

9230

213

100

100 100

100 100

4005

100

145116512

Таблица2

Содержание ноурэеотрицина в культурах штамма Streptomyces noursei IMET lA 3890 b-II NG 13-14 с добавками , глюкозы и (NH4)2S04 и без добавок в ферментаторе емкостью 500 л в зависимости от времени

ферментации

Время фермента- С добавкамиБез добавок (контроль)

ции, ч 1 1

мкг/мл %мкг/мл I %

MITL Iiniirj B«B «B«B«BaiB -. ш1л л,,тт,лт - - - - - --,- - , , |,

20 225216t04 100

i i1600228702100

6848582991627 100

924903208, 2362100

11668621913585100

14477812002885100

ТаблицаЗ

Содержание ноурзеотрицина в культуре селектанта штамма Streptomyces noursei IMET lA 3890 b с добавками , глюкозы и (NN4)4 S04 в ферментаторе емкостью 4,5 л в зависимости от времени ферментации

Время ферментации, ч Концентрация ноурзеотри1 ина, мкг/мл

20320

442330

92 116 146

8010 11040 14070

1314511

Т а б л и ц а 4

Содержание ноурзеотрицина проведенной ферментации в соответствии с примером 4 с ионами железа (ill) и ферментации в соответствии с примером 5 с ионами алюминия (ill) в зависимости от времени ферментации

Время ферментации,

Концентрация ноурзеотрицина, мкг/ /мл, по примеру

530

800

2500 3200 5400 6300 7250 7400

8200

8400

651

ТаблицаЗ

Содержание ноурзеотрицина в куль- туральной жидкости лабораторного ферментатора с добавками , глюкозы и гидроокиси аммония, содержащей ионы алюминия (III), в зависимости от времени ферментации

Время ферментации, ч

Концентрация ноурзеотрицина, мкг/мл

24 48 72 96

J.20

800

2000

5660

8900

11000