Способ получения -триптофана и его производных Советский патент 1977 года по МПК C12D13/06 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРИПТОФАНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ

ных ycnoMtax Ьри непрерьюном добавлении питательного субстрата с отдельным непрерьшным вне«сжнием в систему соответствующего ивдольного производного.

Применяемый штамм характеризуется высокой интенсивностью превращения индола в L триптофан. Штамм можно выращивать на среде определенного состава, причем для его роста, помимо углево-. дов и тиамина (витамин Biг), не требзтотся какиелибо другие органические вещества.

Используемый штамм Candicfa humicola имеет частично действующий путь метаболизма триптофана, включающий его разложение, катализуемое триптофан-пирролазой.

Однако, изменяя условия культивирования и состав питательной среды, можно подавлять процесс разложе шя триптофана. Для того, чтобы стимулировать образование мутантов, неспособных разлагать триптофан, в среду можно добавлять ниацин в концентращш 0,05 - 0,5 г/л.

Подаваемый в необходимом количестве в KjTibтуральную среду индол проникает через клеточную стенку и превращается внутриклеточным: i ферментами системами в триптофан, который в значительной части снова выводится из клетки в культуральную жидкость. Сравнительно эдзкие концентрации свободного индола могут понижать скорость роста клеток.

Однако превращение индола в триптофан происходит очень быстро и добавление, например, 0,5 % (вес/объем) индола по отнощению к весу субстрата в ферментационную систему будет приводить лишь к незначительному содержанию свободного индола в ферментационной среде.

Очень важно в этой связи определять содержание индола в ферментере в расчете на субстрат, содержащий клетки микроорганизма, поскольку очень большое количество свободного индола находится внутри клеток.

Особенностью предлагаемого способа, которая, по-видимому, оказьтает наибольщее влияние на скорость превращения индола в триптофан и на деградацию триптофана через кинуренин, является наличие в культуральной жидкости определенной концентрации биологически усвояемого железа, например, в виде двухвалентного лимо1шокислого железа.

Концентрация железа ( Fe) в культуральной жидкости должна быть ниже такого количества железа, которое вызьшает разложение триптофана, но выше количества, при котором рост культуры нарушается и непрерьшное культивирование становится, таким образом, невозможным.

На скорость разложения триптофана влияет количество растворе шого кислорода в ферментационной среде, поскольку триптофан - пирролаза является ферментом, содержащим гемовую группу, и разложение триптофага является, таким образом, окислительным процессом.

При низком уровне аэрации в культуральной

жидкости можно поддерживать относительно высокую концентрацию , при высоком уровне аэрации содержание железа должно быть низким. Эти наблюдения справедливы для штамма Candida

humicola дикого типа.

Однако в процессе непрерьтной ферментации в течение длительного времени могут возникать мутанты, у которых отсутствует разложение триптофана. Этому способствуют условия культивирова0 ния: состав среды (особенно наличие ниацина в среде), непрерьшная подача индола и т.д. В зтом CJQ4ae концентрация железа в среде не будет иметь решающего значения для разложения триптофана и ее можно поддерживать на значительно более высоком уровне.. Благодаря зтому в качестве источника углерода можно применять мелассы, имеюаз{е обычно высокое содержание железа.

Для того, чтобы в среде не создавалось высокой концентрации остаточного индола, подавляющей

рост штамма, необходимо периодически проводить анализ.

Уровень кислородом ферментационной среды значительно возрастает при повышении в среде концентрации остаточного индола в результа, те-того, что в зтих условиях культура перестраивается с аэробного на анаэробный тип метаболизма. Этот параметр можно использовать для контролирования скорости поступления лимоннокислого железа или степени аэрации.

QКоличество клеток также служит критерием, по

которому можно судить о протекании процесса, ощшко изменения в зтом случае происходят настолько медленно, что их практически невозможно использовать для контроля за процессом фермен5 хации.

Остаточный индол определяют методом газовой хроматографии в пробах, содержащих клетки (определение индола в ферментационной жидкости, освобожденной от клеток, не дает правильных

Q результатов, так как индол быстро поглощается клетками).

Слишком высокое содержание остаточного индола можно использовать как сигнал для уменьшения скорости подачи индола в систему и/или увеличения поступления железа, и/или для увеличения азрации.

Выход триптофащ контролируют путем непрерьшного анализа на колонке с сефадексом с применением Увикорда и последующим анализом триптофановых фракций в ультрафиолете. Этим методом можно определить некоторые метаболиты триптофана и, главным образом, кинуренинов)то кислоту. Способно.сть используемого штамма синтезировать триптофан не лимитируется ингибированием

j по типу обратной связи. Культура Candida humicola выдерживает до 15 г/л триптофана в среде без какого-либо изменения скорости его синтеза.

Фактором, ограничивающим выход триптофана по описанному способу, является способность микQ роорганизма синтезировать сарин. Потребление индола штаммом резко возрастает при добавле ши в ферментакионную среду серина.

Поскольку серии дорогое вещество, бьщо изучено влияние на вь1ход триптофана добавок Глицина. Глицин оказьшает такое же влияние на выход триптофана, что и серии, но этот эффект проявляется не сразу, а через несколько часов после добавления глицина в среду..

При внесении глицина в количестве 1-10 г/л скорость введения индола в ферментацион1 ю среду может быть значительно увеличена.

Для выделения и очистки получешого триптофана из культуральной жидкости, освобожденной от клеток, применяют метод ионного обмена. После пропускания культуральной жидкости черЬз колонку со смолой смолу промьшают дистиллированной водой. Элюирование триптофана осуществляют раствором, содержащим 50 % этанола и 50 % 1 М раствора аммиака, с использованием противотрчного метода.

Полученный раствор триптофана нейтрализуют соляной кислотой, и получают кристаллический триптофан, выход которого около 95 %. Продукт имеет 100 %-ную биологическун} активность согласно стандартному тесту с S. fecal is.

Предложенный способ иллюстрируется примерами, которые не ограничивают его.

Пример. Низкая скорость дабавления индола и высокое содержание железа.

Ферментер. Аппарат типа Химап (Chemap 3F 0014) с механическим пеногасителем, число оборютов 2 000 об/мин, скорость добавления cy6cTpaiTa 200 Nm/час, объем 4,8л, скорость разведения : 4,1 %. Температура 26°С. Субстрат. Индол, г

п - Аминобензойная кислота (ПАБК), г 01 Дрожжевой экстракт, г25

Раствор А, мл Раствор В, мл Раствор С, мл Глюкоза (стерилизована отдельно), кг

До 10

Дистиллированная вода, л рН 5,5

Раствор А : 3 % СаСЬ 2Н2О. Раствор В ; 10% KHjРО4.

Раствор С : 5 % MgSO4 2Н20, 0,125 % железо лимоннокислое, 0,02% ZnSO4 7HjO и 10% NaCI.

Аэрация 80 л/час л среды.

Ферментер засевают 50 мл односуточной культуры Candida humicola, выращенной на качалке. рН в процессе культивирования поддерживают около 6,5 аммиаком.

Культуру выращивают в течение 24 ч, после

Чего до 1ляют с} страт и индол. Скорость подачи шздола устанавливают на уровне 0,14% (вес/объем) .по отнощению к скорости подачи субстрата.

При содержании железа лимоннокислого 24 мг/л скорость потребления индола высокая, причем не наблюдается остаточного индола. Однако в этих условиях триптофан практически не получают, вероятно, в результате того, что образовавщийся триптофан сразу же разлагается до кинурениновой кислоты и других метаболитов.

П р и м е р 2. Низкое содержание индола и низкое содержание железа.

Условия те же, что в примере. Отличие в составе питательной среды;

NH4CI, г50

0,5

Ниадин, г

J10

Железо лимоннокислое, мг

50 Тиамин, мг

10

Растор К, мл

100

Раствор А, мл

200 Раствор В1, мл

200 Раствор Вг, мл

200 Раствор С, мл

Сахароза, кг1

Дистиллированная вода, лДо 10

Раствор А : 0,75 % CaCl2 -21120

PactBOp BI : 8 % KHj Р04,2,56 % К2 HPO4

ftcTBOp В2 : 10% KH2PO4

Раствор С..: 7,88% MgSO4 7Н2О, 0,11% MnSO4 НзО, 0,02% ZnS04 7Н20 и 10% NaCI.

Раствор К: 0,068 г аммония молибденовокислого, 0,34 г CuSO4. Засев, рН и культивирование те же, что и в примере 1. Скорость добавления индола

0,265 % по отношению к скорости введения субст- . рата. Выход триптофана в процессе ферментащ1И 3,6 г/л сутки (эффективность превращения индола в триптофан 78%). Разложения триптофана не наблюдается.

П р и м е р 3. Высокое содержание индола

и периодическое добавление железа лимоннокцслого.

Условия ферментации те же, что и в примере 1. Питательная среда, как в примере 2. Засев, рН и

культивирование такие же, как в примере 1. Скорость добавления индола в ферментационную среду составляет 0,53% (вес/объем) от скорости введения субстрата. Выход триптофана в процессе ферментации в среднем составляет 6,8 г/л сутки (эффективность процесса 74 %). Железо лимоннокис