Способ получения метаболита "а 27 106 Советский патент 1976 года по МПК C12D13/00 C12D9/14 

Изобретение относится к способам получения биологически активных веществ путем микробиологического синтеза.

Известен способ получения биологически активных веш,еств, включающий культивирование микроорганизмов вида Streptomyces candidus в водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных веществ, при ее аэрации.

Целью изобретения является получение нового биологически активного вещест ва, обладающего пониженной токсичностью, эффективно действующего против кокцидий, а также повышающего усвояемость кор.ма жвачными животными.

Для этого в качестве культуры микроорганизма берут Streptomyces candidus NRRL 5449, а .в питательную среду вводят дополнительно глюкозу и монензин, продуцируемый микроорганизмом Streptomyces cinnamonensis. При этом в качестве источника монензина используют стерилизованную жидкую среду выращивания Streptomices cinnamoneusis. Питательную среду можно также подвергнуть контактированию либо с отделенным от клеток и лиофилизированным бульоном среды выращивания при получении культуры Streptomyces candidus NRRL 5449, либо с отделенным клеточным материалом этого микроорганизма, подвергнутым очистке посредством обработки ультразвуком, центрифугирования и диализа.

На прилагаемом чертеже показан инфракрасный спектр поглощения метаболита А 27106 в хлороформе.

Биологически активное вещество, получаемое предлагаемым способом в виде натриевой соли, обозначают как метаболит А 27106. Исходным материалом для получения вещества А 27106 является монензин, который получают нз культуральной лсидкости или из мицелия культуры Streptomyces cinnamonensis АТСС 15413. Вещество А 27106 получают из монензина в присутствии глюкозы под воздействием ферментов, выделяемых новым штаммом Streptomyces candidus, имеющимся в коллекции постоянных культур в Северном отделеннн исследовательских и опытных работ службы сельскохозяйственных исследований Министерства сельского хозяйства США под номером NRRL 5449.

Новый штамм Streptomyces candidus NRRL 5449 был изолирован из образца почвы на горе Арарат в Турции. Стрептомицеты NRRL 5449 характеризуются наличием спорофор. имеющих форму от прямолинейной до волниугой; споры имеют гладкую поверхность и форму от овальной до слабоцилиндрической размер спор составляет в среднем 1,165Х Х0,57 мкм, размер цепочек епор колеблется от 10 до 50 мкм. Воздушный мицелий обычно белого цвета, при 26°С наблюдается лишь вегетативный рост, цри 45°С роста не происходит, а максимальный рост и споруляция имеют место при 30-37°С. Характеристики среды культивирования: ICP 1. Удовлетворительный рост; светложелтый обратимый цвет (1IC1); отсутствие воздуншого мицелия или епор; растворимый пигмепт отсутствует. ICP 2. Обильный рост; светло-желтый обратимый цвет (1013); обильный воздушный мицелий и споры; (W) белый а; растворимый пигмент отсутствует. ICP 3. Хороший рост; светло-желтый, обратимый зеленый цвет (10С1); хороший воздушный мицелий и споры; (W) белый а; растворимый пигмент отсутствует. ICP 4. Рост хороший до обильного; обратимый умеренный желтый цвет (10Н4); хороший до обильного мицелий и споры; (W) белый коричневый раст1воримый пигмент. ICP 5. Обильный роет; обратимый умеренный ораижево-желтый цвет (1016); обильный воздушный мицелий и еиоры, (Y) светло-желтый 2db; слабо-коричневый растворимый пигмент. ICP 7. Хороший рост; обратимый светложелтый, зеленый цвет (10В1); хороший воздушный мицелий и споры; (W) белый а; растворимый пигмеит отсутствует. Глицерпп-глицин. Обильный роет; средней интенсивности коричневый обратимый цвет (1114); обильное формирование спор и воздушного мицелия, (W) белый а и (Y) светло-желтый 2 db; слабый, светло-коричневый растворимый пигмент. Среда Эмерсона. Обильный рост; сероватожелтый обратимый цвет (12НЗ); воздушный мицелий и споры отсутствуют; растворимый пигмент отсутствует. Среда Беннетте. Хороший рост; светло-желтый обратимый цвет (1112); скудный воздушный мицелий и споры; (W) белый растворимый пигмент отсутствует. Среда Чацека. Хороший рост; умеренный оранл ево-желтый цвет (1117); обильный воздушный мицелий и споры; (W) белый а; раствориимый пигмент отсутствует. Глюкоза-аспарагин. Рост удовлетворительный до хорошего; светло-желтый, обрати мый 6 зеленый цвет (10Н1); воздушный мицелий и споры отсутствуют; растворимый пигмент отсутствует. Кальциевая соль яблочной кислоты. Обильный рост; обратимый серовато-желтый цвет (11Е4),обильный воздушный мицелий и опоры; (Y) светло-желтый 2 Ьа; слабо-коричневый растворимый пигмент. Питательный агар. Хороший рост; обратимый светло-желтый, зеленый цвет (10 С1); отсутствие воздушного -мицелия или спор; растворимый пигмент отсутствует. При исследовании физиологических свойств Streptomyces eandidus NRRL 5449 в соответствии со стандартными методиками было обнаружено следуюш,ее. Действие на снятое молоко. Просветление; створаживание через 14 дней. Восстановление нитрата. Положительное. Образование меланина из дрожжевого экстракта бульона триптона. Пезначительное. Агар-тирозин. Отсутствие. Желатины ожиженные. Отсутствие на 21 день. Требования в отношении температуры. 26°С - лишь вегетативный рост; 36-37°С - хороший вегетативный роет, хороший воздушный мицелий и споры; при 43-53°С рост отсутствует. Результаты испытаний на утилизацию угерода с помош,ью Streptomyces eandidus RRL 5449 приведены ниже. Символы, исользованные для индикации реакци роста, ледующие: -f утилизация - хороший рост; -f- : вероятная утилизация - плохоймеренный рост; - сомнительная утилизация - слабый ост или отсутствие его; - утилизации нет - отсутствие роста. Источник углерода Раффиноза+ D-Фруктоза + Целлобиоза-(L-Арабиноза-|/)-Маннитол+ Рамноза-}Пеллюлоза-Декстроза + до - Д-Ксилоза 4- Инозитол-Jс (отсутствие углевода - до + Среда для вырагцивания Streptomyces eandis NRRL 5449 может быть любой подходяей для этого микроорганизма. Однако предчтительными источниками углеводов при оведении ферментации в большом объеме огут быть инвертный сахар или кукурузный рон, но можно использовать глюкозу, фрукзу, мальтозу, крахмал, инозитол и подобные . Если предполагается использовать культуS. eandidus NRRL 5449 для получения биогически активного вещества А 27106, то еда должна содержать источник глюкозы

для обеспечения эффективной конверсии. Если S. candidus NRRL 5449 выращивают с целью получения свойственной ей энзимной системы для последующего применения ее для получения вещества А 27106, то наличие глюкозы во время ферментации является произвольным.

Предпочтительными источниками азота служат пептоны, соевая мука, смеси аминокислот и другие подобные им вещества.

В качестве минеральных солей можно ввести в состав среды обычные растворимые соли, содержащие ноны железа, натрия, калия, аммония, кальция фосфата, хлорида, карбоната и др. Среда также должна содержать необходимое количество микроэлементов.

Начальное значение рН среды для культивирования можно варьировать, но желательно выбирать и поддерживать рН среды при культивировании в пределах 5,7-7,5.

Как и другие виды Streptomyces, S. candidus NRRL 5449 требует аэробных условий для выращивания. Инокулирование водной среды можно производить с помощью суспензии, содержащей споры, или вегетативным прививочным материалом. Температуру выращивания выбирают в интервале 26-40°С, однако максимальный рост и спорообразование происходят при 32-37°С. Подачу стерильного воздуха в среду культивирования для обеспечения эффективного роста микробной культуры и получения достаточно высокого выхода вещества А 27106 осуществляют со скоростью не менее 0,1 объема воздуха в 1 мин на единицу объема среды для культивирования, но предпочтительнее, если объем воздуха составляет от 1/3 до 1/2 объема воздуха в 1 мин на объем среды для культивирования.

Наличие подходящего источника глюкозы является необходимым условием для конверсии монензина или фактора А антибиотического комплекса А 3823 в биологически активное вещество А 27106.

При наличии в среде глюкозы в необходимом количестве, а монензина в количестве 0,1 -1,0 г/л среды культивирование в основном заверщается приблизительно за 36- 72 час. Оптимальная степень конверсии достигается, когда монензин присутствует в количестве 0,5-0,7 г/л, а глюкоза 2-2,5 вес. % на количество среды.

Если содержание глюкозы в среде меньще 2%, то ее необходимо добавлять, поддерлсивая концентрацию на оптимальном уровне.

Если для получения биологически активного вещества А 27106 используют ферментную систему S. candidus NRRL 5449, то необходимо, чтобы ферментный препарат имел повыщенную степень очистки. Активная ферментная система S. candidus NRRL 5449 присутствует в отфильтрованном бульоне, полученном пои ферментации, и в клеточном материале. Например, отфильтрованный бульон можно лиофилизировать и хранить в течение не менее двух недель до повторного растворения

буферным раствором в количестве 1/6 объема первоначального бульона. Эффективная конверсия достигается примерно через 72 час, когда берут 2,5 г такого лиофилизированного препарата и 25 мг монензина.

Ферментный препарат из клеточного материала S. candidus NRRL 5449, отделенного от бульона после ферментации, можно получить следующим образом.

Клеточный материал можно заморозить и хранить не менее трех месяцев. После оттаивания клетки суспендируют в буферном растворе, дополнительно очищают посредством обработки ультразвуком и центрифугирования, отделенные остатки клеточного материала суспендируют в буферном растворе и диализируют. Из 200 г клеточного материала получают количество диализата, достаточное для превращения глюкозы и 25 мг монензина

в биологически активное вещество А 27106.

Вещество А 27106 содержится и в культуральном бульоне в мицелии Streptomyces candidus NRRL 5449.

В соответствии с этим технические приемы

для выделения его выбирают с расчетом наибольщего извлечения продукта из одного или обоих источников. Так, например, ферментационную среду фильтруют, после чего фильтрат и плотную массу мицелия, полученную

после фильтрования, экстрагируют с -применением подходящих растворителей для получения вещества А 27106. Продукт извлекают из растворителей с помощью обычных приемов в данной отрасли промышленности.

Однако выделение вещества А 27106 можно производить из культуральной среды и мицелия, не подвергая экстрагированию, но предпочтительно удалив воду из них. Например, среду для культивирования можно высушить

лиофилизацией, после чего смешать с материалом, поступающим на переработку. Кроме того, из твердых веществ можно не полностью удалить воду и приготовить суспензию, пригодную для добавления к влажной массе затора (суслу) или к аналогичному исходному сырью.

Одним из удовлетворительных способов выделения вещества А 27106 может быть следующий. Среду, в которой производилось

культивирование микроорганизма, фильтруют, я плотную массу, отжатую на фильтре, экстрагируют полят)ным растворителем, например метанолом. Метанольный экстракт концентрируют, а затем добавляют к фильтрату. Объегтиненный раствор экстрагируют дважды добавлением половинного объема хлороформа. Хлороформенные экстракты упаривают в вавакууме, образуется маслообразный продукт темно-янтарного цвета, который обесцвечивают, пропуская над активированным углем в колонке с применением хлороформа.

Полученный после вымывания адсорбента экстракт снова концентрируют в вакууме, что обеспечивает получение масла от светло-желтого цвета до бесцветного. Это масло растворяют в минимальном количестве хлороформа и подвергают хроматотрафированию в колонке, заполненной силикагелем с использованием этилацетата в качестве растворителя. Элюирование желательно производить методом тонкослойной хроматографии. Загрязнения отмывают от адсорбента этилацетатом, а от.мывание адсорбента смесью этилацетата с метанолом позволяет выделить биологически активное вещество А 27106.

Биологически активное вещество А 27106 (натриевая соль) представляет собой белое твердое кристаллическое вещество, плавящееся при температуре около 170-175°С. Оно проявляет тенденцию к легкому образованию гидрата и других сольватов, при этом его температура плавления изменяется (обычно на несколько градусов ниже указанной).

Элементарный состав вещества А 27106 следующий (%): С 58,78, Н 8,51, О 27,85 и Na 3,63, что соответствует эмпирической формуле C42H7iO,6Na.

Вещество А 27106 практически не проявляет никакого ультрафиолетового поглощения в области выше, чем 235 мкм.

Инфракрасный спектр поглощения его в хлороформе показан на прилагаемом чертеже. Достижимые максимумы поглощения у спектра таковы: 3.1; 3,36; 3,69; 6,82; 7,1; 7,25; 7,9 (плато); 8,1; 8,3; 8,67; 8,8 (плато); 9.04; 9,22; 9,51; 9,66; 10,03; 10,26; 10,66; 11,23; 11,47; И,83 и 12,15.

Масс-спектр вещества А 27106 показывает наличие молекулярно-ионного пика при гп/е S54.44630 и характеристических пиков при m/e836.44I29, 779.44690, 761.44740

Эти полученные дапные совпадают с эмпирической формулой и значением молекулярного веса, равным 854 для натриевой соли вещества А 27106.

Обычно вещество А 27106 легко растворимо 3 растворителях высокой степени полярности, нерастворимо в неполярных растворителях и ямеет различную степень растворимости в эастворителях промежуточной полярности. Например, вещество А 27106 растворимо в низших алифатических спиртах, частично в |)еноле, диэтиловом эфире и ацетоне и срав1ительно нерастворимо в жидких низщих .

Электрометрическое титрование вещества 27106 в кислотной форме при начальном значении рН 8 показало наличие группировки, :пособной титроваться лри рКа 7,2.

Описанная монопатриевая соль является естественной формой вещества А 27106. Исхо1я из натриевой соли, легко получают кисло у; из кислоты получают аммонийную и друие соли, образованные щелочным металлом литием, каяием, рубидием, цезием). Все они )бладают биологической активностью.

Точная структура вещества А 27106 неизве:тна. Известно, что ппи конверсии монензина О вещества А 27106 необходимо наличие люКозы, которая расходуется даже при отсутст1вии подвергающихся метаболизму клеток S. candidus. Молекулярный вес вещества А 27106 соответствует молекулярному весу глюкозила монензипа.

Вещество А 27106 менее токсичпо, чем монензин. Например, при введении монензина группам мышей по 6 голов в каждой внутрибрюшинно в дозировке 50 мг/кг одна из шести погибла, при дозировке 100 мг/кг три из

шести погибли. В то же время мопепзин при аналогичных условиях эксперимента при дозировке 10 мг/кг приводил к смерти одпу из шести мышей, а при дозировке 20 мг/кг трех из шести мыщей.

Пример 1. S. candidus NRRL 5449 выращивали на скощенном агаре на среде, приготовленной по Беннетту, до получения хорощо выраженных колоний. Выросшую культуру удаляли и готовили из

нее суспензию на стерильной деиовизпрованной воде (10 мл). Эту суспензию разливали в четыре стеклянных сосуда для встряхивания, в которых содержалось 100 мл вегетативной среды следующего состава (г на 1,1 л): растворимые продукты, получаемые из зерна после винокурения («Надризол, National Distillers Products Company), 25,0; лактоза 10,0; мальтоза 10,0, FeSO4-7H2O 0,01; MgSO4-7H2O 2,0; KH2P04 2,0; СаСОз 2,0; деионизированная

вода. Инкубирование проводили при 30°С на встряхивающем аппарате вращательного действия при 250 об/мин в течение 24 час.

Эту культуральную среду применяли для инокулирования 15 стеклянных сосудов объемом 500 мл, содержащих по 100 мл стерильной ферментационной среды следующего состава (г в 1 л): мясной говяжий экстракт 5,0; панкреатический гидролизат казеина 5,0; хлористый натрий 5,0; глицерин 15,0; углекислый кальций 2,0; деионязированная вода до 1 л. рН среды 7,2. Инокулированнзю среду инкубировали в течение 72 час.

В ферментере объемом 40 л готовили 24 л производственной среды следующего состава,

г: средство против вспенивания в виде маслообразного полисилоксана 5,0, глицерин 375, декстроза 625, панкреатический гидролизат казеина 125, мясной экстракт 125, хлористый натрий 125, углекислый кальций 50; деионизированпая вода.

Начальное значение рН среды 7,0. Среду стерилизовали в автоклаве при 120°С в течение 30 мин под давлением 1,05-1,41 кг/см (15-20 ФУНТОВ на 1 кв. дюйм). После стерилизации рН среды 7,6.

К стерильной среде добавляли 25 г очищенного монензина, -оастворенного в 200 мл этанола и вводилИ 700 мл вегетативного прививочного материала, приготовленного, как описано.

Фепментапионную среду аэрировали, пропуская стерильный воздух со скоростью около I л (0,35 куб. фута), и перемешивали с помощью мешалки со скоростью 420 об/мин.

Инкубировали при 30°С в течение приблизи9

тельно 114,5 час. Процесс ферментации прослеживали с цомощью тонкослойной хроматографии на Силикагеле. Первоначально в ферментационной среде присутствовал лишь монензин. Постепенно появилось второе пятно, указывающее на присутствие вещества А 27106. В конце ферментации присутствовало лишь пятно, свидетельствующее о наличии вещества А 27106.

Пример 2. Культуру микроорганизма Streptomyces cinnamonensis АТСС 15413 выращивали в 55 мл среды, помещенной в кол-бу объемом 250 мл в течение 47 час. Этот вегетативный прививочный материал добавляли к 220 мл среды в л«тровой колбе и инкубировали при встряхивании в течение 21 час. -Подготовленный прививочный матер-иал применяли для посева в ферментер емкостью 40 л, содержащий 24 л стерильной среды следующего состава, г: .глюкоза 750,0; соевая мука 625,0; соевое масло 500,0; метилолеат 500; средство против вспенивания в виде маслообразного полисилоксана 5,0; хлористый калий 2,5; двузамещенный фосфорнокислый калий 2,5; хлористый марганец, тетрагидрат 15,0; сернокислое железо, гидратированное 7,5; углекислый кальций 25,0; вода деионизированная до объема 24 л. рН среды доводили до 8,0, добавляя 16 мл 10 н. раствора гидрата окиси калия.

Инокулированную среду инкубировали при 32°С в течение 234 час. Через 72 час после начала инкубирования увеличивали количество продуваемого воздуха от 0,01 до 0,023 . (от 0,55 до 0,8 куб. фута в 1 мин) и скорость перемешивания от 500 до 700 об/мин. Получение фактора А антибиотика А 3823 или монензина в основном заканчивалось через 210. час.

Через 234 час содержимое ферментера пастеризовалИ для дезактивации S. cinnamonensis, после чего е ферментер добавляли следующие количества питательных веществ, г: декстроза 750; соевая мука 625; хлористый марганец, тетрагидрат 155; углекислый кальций 12,5; сернокислое железо, гексагидрат 7,5 хлористый калий 2,5; двузамещенный фосфорнокислый кал-ий 2,5; метилолеат 250 мл; соевое масло 250 мл; вода деионизированная до объема 24 л.

Значение показателя рН доводили до 8,0 путем добавления 215мл 5 н. раствора гидрата окиси латрия,после чего среду стерилизовали. Cpe.Tv инокулировали вегетативной культурой. Streptomyces candidus NRRL 5449. Инкубипование проводили в течение 137 час при 30°С при аэрации со скоростью 0,01 (0,35 куб. фута iB 1 мин) перемешивая сначала при 120 об/мин, чепез 16 час при 420 об/мин; а через 40 час скорость перемешивания повыщали до 500 об/мин. Декстрозу (400 г) добавляли в следующие периоды инкубации, час: 44, 66,5, 89, 97, 113 и 127.

Углекислый кальций (175 г) добавляли к началу, на 72-й и 99-й час инкубации.

10

Контроль инкубации проводили, используя метод тонкослойной хроматографии. Через 137 час производство вещества А 27106 по существу закапчивалось.

Пример 3. Культуру микроорганизма S. candidus NRRL 5449 выращивали, как описано в примере 1. Клеточный материал отделяли от ферментационной среды фильтрованием под вакуумом и разделяли на равные части по 200 г, которые сохраняли в замороженном состоянии. Две из полученных частей оттаивали при комнатной температуре и суспендировали в 0,05 М фосфатном буфере (рН 5,8) до объема 600 мл. Эту клеточную суспензию обрабатывали ультразвуком е течении 30 мин, затем центрифугировали при 10000 об/мин 30 мин и остаток из «обломков клеточного материала суспендировали в 100 мл указанного буфера. Данную суспензию диализировали 18 час против указанного буфера. К 50 мл диализата добавляли 120 мг глюкозы и 25 мг монензина в 2 мл этанола. Реакционную смесь перемещивали 72 час при 30°С, затем фильтровали; фильтрат экстрагировали хлороформом (100 мл). Полученный хлороформенный экстракт концентрировали в вакууме, хроматографировали на колонке с силикагелем (10 г). Отмывание адсорбента этилацетатом указывало на наличие лишь следов фактора А антибиотика А 3823. При отмывании адсорбента смесью этилацетата с метанолом (19:1) выделялось вещество А 27106 (17 мг).

Полученный препарат А 27106 является эффективным средст1вом для лечения и профилактики кокцидиоза домашней птицы. Количество лекарственного препарата, вводимого в корм птице, должно составлять 0,005-0,05% от веса корма, предпочтительнее 0,01-0,04%.

Вещество А 27106 также улучшает утилизацию корма жвачными животными, преимущественно взрослыми. Вводить его жвачным животным можно iB дозе 0,5-2,5 мг/кг в -сутки. Наилучшие результаты получают при даче его животным в количестве 0,1 -1,5 мг/кг в сутки.

Формула изобретения

1.Способ получения метаболита А 27106, включающий культивирование микроорганизмов вида Streptomyces candidus при аэрации в водной питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральных веществ, отличающийся тем, что, с целью получения вещества, обладающего пониженной токсичностью, iB качестве микроорганизма берут Streptomvces candidus MRRL 5449, а в питательную среду дополнительно вводят глюкозу и монензин, продуцируемый Streptomyces cinnamonensis.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве источника монензина используют стерилизованную жидкую среду выращивания Streptomyces cinnamonensis.

3.Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем что питательную среду подвергают контактированию с отделенным от клеток и лиофилизпрованным культуральным бульоном среды предварительного выращивания Streptomyces Candidas NRRL 5449. 4. Способ по пи. 1 и 2, отличающийся тем, что питательную среду подвергают контактированию с отделенными от среды предварительного ;выращивания Streptomyces сапdidus NRRL 5449 клеточным материалом, очищенным посредством обработки ультразвуком, центрифугирОВания и диализа.