(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНА
двухвалентной меди, при котором селективно расщепляются межкепочечиые дисульфидные связи, соединяющие две тяжелые полипептидные цепи (Н-неПи) и две легкие полипептидные цепи (Ьцепн) в имму1юглобулш1е, или, кроме указанных межцепочечных днсульфидных связей, расщепляется часть внутрицепочечных дисульфидных связей, а подвергнутые расщеплению дисульфидные группы подвергаются дальше сульфитолизу. Полученные таким способом производные иммуноглобулина имеют пониженную антикомплементар|гут& активность и сохраняют высокую антителькую активность в организме животных в течение длительного периода.
Способ получения указанных препаратов заключается в том, что иативный иммуноглобулин вводят во взаимоденстане в водной .среде с соединеш1ем (а), способным давать тетратионат-анионы, и соединением (б), способным давать сульфитшшоны, чтобы подвертуть расщепле}гию от 3 до 5 межцепочечлых днсульфшщых связей, или меж- и внутрицепочечных днсульфидных связей нативного иммуноглобулина с последующим S - сульфонированисм (-З-ЗОзИ) образушихихся тиольных остатков.
В качестве соединения (а), которое допускает образование тетрагаонат-иона, предпочтительным является тетрапюновая кислота, ее соли щелочных металлов, такие, как тетратеонат натрия, тетратионат калия, и т.д., и ее водорастворимые соли, например тетратионат аммония. Но могут быть использованы любые другае соединения, которые образуют тетрапюнат-ион в воде.
Примерам соедине шн (б), которые могут образовывать сульфит-анион в воде являются сернистая кислота, сульфит натрия шш калия, бисульфит натрия, но мoжef быть использовано любое другое соединение, способное образовьшать сульфит-ион в воде.
Соединение (а), которое допускает образование тетратпонат-иона в воде, действует как окислитель. Соеданение (б), которое образует Сульфит-ион в воде действует как восстановитель и агент S-сульфош1роваю1я. ;
Молярные количества сульфит-иона и тетратипнат-иона, каждые по отдельности, должны не менее, чем в два раза, превьпиать количество подвергаемых расщеплению дисульфидных связей. Концентрация этих ионов может в 100 и более раз превыщать количество подвергаемых расщеплению связей.
Предпочтительно, соединения (а) и (6), в в особенности (б), растворялись в воде или в буферном растворе перед добавлением itx в реакционную смесь.
Способ согласно изобретению осуществляют предло1гштельно при температурах, не превышаюидах 50° С, в частности при 10-50° С, хотя можно проводить, процесс и при более низких температурах. Время реакции зависит от таких факторов,
как тип иммуноглобулина, концентрация реагентов, температура реакции и наличие денатурирующих агентов, таких как мочевина и т.д- Величина рН реакционной смеси может колебаться в пределах от 3,5 до 10, предпочтительно от 6 до 9. Порядок прибавления реагентов в реакционную систему несущественен. После реакции смесь подвергают последовательному диализу против воды и подходящего буферного раствора, например 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,4) и 2,5% глицина. Кроме того, HOBbie производные иммуноглобулина согласно настоящему изобретению могут быть разделены иаН-цепн и L-цепи с помощью колоночной хроматографии, например с помощью колонки с Сефадексом д-75 в 1 М растворе пропионовой кислоты.
Применяемые в способе в качестве исходных веществ препараты являются продажными продуктами или могут быть получены известными из литературы способами.
Целевые продукты вьщеляют из реакционной среды известными методами.
Пример. Соотношения условий реакции с
числом расщеш1е1п ых дисульфидных связей. Условие 1.
К 51 мг человеческого, иммуноглобулина П, 36мг NajSOa, меченного 35S, к 22мг NajSAO прибавляют водный раствор 0,1 М трис - HCI (рН
8,2), чтобы довести обьем образца до 5 мл, который нагревают до 45° С, и реакцию проводят при указанной температуре. Немедленно после начала реакция, а затем через 30 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 7, 4 ч, и 24 ч от начала реакции производят отбор по 0,5 мл
смеси. Каждый из образцов смешивают с 10мл 50%-ного насыщенного раствора сульфата аммония при 0°С, выдерживают в течение 15 мин при 0°С. Осадок отделяют центрифугированием. После промьшания дополнительным количеством 50%-ного
насыщенного раствора сульфата аммония бьша измерена радиоактивность осадка с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика и на основании полученного результата было .вычислено число -S -ЗОзН-групп, содержащихся в осадке.
Условие 2.
Реакцию начинают как описано в условии 1, но без отбора проб по мере протекания реакции. Через 4 ч от начала реакции к реакционной смеси прибавляют водный 10М раствор мочевины, чтобы довести концентрацию мочевины в системе до 4М. Спустя 5 и 6 ч после начала реакции (т.е. через 1 и 2 ч после прибавления мочевины) отбирают по 0,5 мл реакционной смеси и обрабатьшают подобно пробам в условии 1.
Условие 3.
Повторяют реакцию и обработку проб по уело-. ВИЮ 1, но реакцию проводят при температуре ОС. Условие 4. Повторяют реакцию и обработку проб по услоВИЮ 1, но реакцию проводят при температуре 25°С. Условие 5. Повторяют реакцию и обработку проб по условию 1, но NajS4O6 2HjО не используют. Результаты реакций при вышеупомянутых условиях 1,2,3, 4 и 5 представлены в табл. 1. Число расщепленных дисульфидных связей соотвёгствует половине числа -S-SOjH-групп. Из результатов, представленных в табл. 1, можно сделать следуюишй вьшод. Если предлагаемый способ осуществляется в присутствии тетратионата и сульфита натрия при 45°С при условии 1, то через 0,5 ч расщепляются приблизительно 3 дисульфидных связи. Число расщепленных связей достигает в среднем примерно 4,5 в ходе реакции от 1 до 7 ч и примерно 5,2 через 24 ч от начала реакции. Если реакцию проводят при условии 4, то число расщепленных дисульфидных связей уменьшается и достигает в средаем примерно 4,3,после 24 ч реакции. Есля реакцию проводят при условии 3, то среднее число расщепленных дисульфидных связей еще более уменьшается. В отсутствие тетратионата натрия (условие 5) расщепление д 1сульфидных связей не ускоряется. Если в реакционную смесь добавляют мочевину (условие 2), то среднее число расщепленных дисульфидных связей после прибавления мочевины быстро увеличивается. П р и м е р 2. Сравнение качества и физических свойств препаратов при использовании в качестве окислителя N828406 или Условие I. К 2,0 г выщеуказаиного человеческого иммуноглобулина Q, 1,42 г NajSOa и 0,8ъ г N828406 2HjO прибавляют водный 0,1 М раствор трис-НС (рН8,2), чтобы довести объем смеси до 200мл. Реакцию проводят при температуре 45° С. Немедленно после 1«ачала реакции и далее через 30 мин, 1 ч, 2 ч и 4 ч отбирают каждый раз по 15 мл реакционной смеси. .Клсле пятого отбора пробы немедленно к остатку цегакционной смеси прибавляют 10 М раствор мочевины,, чтобы довести концентрацию мочевины в смеси до 4 М, и продолжают проведенне реакции. Через 5 и 6 ч после начала реакции. (т.е. через 1 и 2 ч после прибавления мочевины) отбирают по 22,5 мл реакционной смеси, к пробам прибавляют 22,5 мл охлажденного льдом насыщенного раствора )ата аммония, после чего вьшержввают в тече1ше 30 мин при 0°С. Осадок отделяют Есентрифугированием, промьшают 509 ным раствором сульфата аммония и подвергают диализу в тече1ше 24 ч прошв буферного солевого раствора прн рН 7,4. После диализа каждого из образцов отбирают требуемое для проведения аналнза количество, разбавляют буферным солевым раствором при рН 7,4, содержащим 2,5% глицина, а затем анализнруют. Услюие 2. Повторяют реакцию я обработку проб по условию 1, за исключением того, что N328406 2HiO заменяют на 50 мг CuSO4 и реакцию завершают к концу четвертого часа. Полученные таким образом растворы tipoH-iBojuiiii.x нммуиоикЛу.Иша подвергают следующим испытаниям и иимерсииим. а)Сопоставление времени реакции и числа -S-ЗОзН-групп, Число -S -БОзНтрупп в образцах, окисленных тетратионатом 2HjО), представлено на фиг. 1, совместно с подобными данными, полученными при условиях и 2 примера J. Данные ;UIH образцов, которые были подвергнуты реакции и обработаны при идентичных условиях 1 примера I, но при замене N828406 2HjO на 50мг CuS04 5Н2О, также представлены на фиг. 1. б)Сопоставление времени реакщ(Н и антикомплементной активности по выщеукаяанному методу, приведены на фиг. 2. На фиг. 2 представлены также ангикомплементныеактивностнооразцов, окисленных ионами DJ по условию 2. Из фиг. 2 можно заключить, что антикомплементные активности всех образцов уменьшены приблизительно до 30% после 30 мин от начала реакции. в)Сопоставление времени реакции и титра противодафтерийной композиции. Образец, использованный выше в пункте (б, был подвергнут трехкратному анализу для определения его тигра против дифтерингс помощью указанного выше метода. Усредненные значения представлены на фиг. 3. Из графика можно сделать заключенне, что образцы, окисленные ионами Си показывают титр не более, чем 0,3 м.е. уже поел 30 мин от начала реакции. г)Сопоставление времени реакции н величкны оптического вращения. На фиг. 4 представлены результаты измерения оптической активности тех же образцов, которые быть использованы выше в пункте (б) для измерения антикомплементной активности (концентрация белка 2,5%). Из представленных результатов можно сделать заключение, что присутствие иона двувалентной меди в реакшюнной смеси вызывает постепенную денатурацию по мере протекания реакции и что присутствие мочевины содействует денатурации, о чем свидетельствует заметное изменение оптической активности. В данном случае оптическое врашенне измерено при 25°С в 1 см кювете. д)Сопоставление времени реакции и мутности после термообработки. Те же образцы, которые использованы для измерения антикомплементной актнвностн в пункте (б), были подвергнуты термообработке на воздухе в теченне 4ч прн 50°С, при концентрации 2,5%. Результаты представлены на фиг. 5. Как видно из фиг. 5, присутствие даже очень незначительного количества ионов двувалентной меди вызывает ухудшение термостабильности и содействует тен денцин к агрегации. е)Сопоставление времени реакции и содержа ния меди.. На фиг. 6 представлены результаты определения содержання ионов двувалентной мсди с помощью
томно-адсорбционною анализа в тех же образцах, которые были использованы в пункте (б) для измерения антикомплементной активности. Из приведенных результатов можнЪ сделать заключение, что когда применяют ионы двувалентной меди, то промьшаиие и диализ образца не приводят к удалению ионов двувалентной меди. .
ж) Разделе1ше Н-цепей и L-цепей.
Тот же самый образец вместе с образцом, отобранным после двухчасовой реакции в условии 1 примера 2, подвергают диализу в течение 24 ч против 1 н. раствора пропионовой кислоты, содержащего 6 М мочевину, и подвергают колоночной хроматографии (Сефадекс G 200, колонка диаметром 1,5см и д;шной 80см), уравновешенной укаэшным Bbujie водным раствором. Результаты представлены на фиг. 7.
Первый пик слева одной и той же кривой соответствует Н Lj-целям, которьш не подверглись разделению, второй пик соответствует Н-цепям, а третий пик - L-цепям. Диаграмма элюцни свидетельствует о том, что образец может быть разделен на Н-цепи и L-цеди.
Резюмируя результаты , представленные на фиг. 1-7, можно сделать следующие вьшодь.
I) Из (тезультатоо опыта по условию 1 в примере 1 следует, что, когда предлагаемый способ осуществляют в присутствии тетратионат- и сульфитионов, то при любой продолжительности времени реакции в пределах от I до 4 ч среднее число расШепленных дисульфидных связей составляет примерно 4, 5, а образующиеся атомы среды подвергаются S-сульфонированию (среднее число S-сульфонатных групп составляет примерно 9) с образованием S-сульфонированного иммуноглобулина (фиг. 1), который можно разделить на Н-цепи и L-иепи с помощью, например, хроматографии на колонке с Сефадексом G 200 (фиг. 7). Такое производное имеет, в основном, одинаковую с нативнь1м иммуноглобулином оптическую активность (фиг, 4).
Из выщепрнведенных результатов можно с уверенностью предположить, что новое производное иммуноглобулина образуется главным образом путем расщепления только межцепочечных дисульфидных связей нативного иммуноглобулина с последующим S-сульфонированнем образующихся тиольных групп, учитьгаая тот факт, что число межцепочечных дисульфидных связей в нативном иммуноглобулине составляет в среднем 4,5.
Такое производное иммуноглобулина имеет антикомплементную активность, пониженную приблизительно до 10% по сравнению с натнвным иммуноглобулином (фиг. 2), но проявляет тнтр против дифтерии не Меньщий, чем нативный иммуноглобулин, как это следует из приблизительно равной антиген-связывающей активности. Как показано на фиг. 3, при концентрации 10 вес.% производное иммуноглобулина сохраняет -по крайней мере 1,0 м.е./мл антиген-связывающей активности.
2)Те 5-сульфоиирован1(ые произвоушые иммуноглобулина, которые образуются расщеплением менее или более, чем 4,5 дисульфидных связей нативного иммуноглобулина, имеют до некоторой степени меньшее понижение их антикомплементарной активности и имеют худ1аую антиген-связывающую активность по сравне1шю с таковыми предпочтительного производного иммуноглобулина, onMcaiffloro выше в пункте (1) (фиг. 2 и 3).
3)Если тетратионат ион в качестве окис/штеля
0 заменяется на ион двувалентной меди, то получающиеся производные иммуноглобулина содержат ионы двувалентной меди, концентрация которых имеет тенденцию к увеличению по мере увелн юния времени реакции (фиг. 6). Кроме того, с увеличе5нием времени реакции увеличивается число расщепленных дисульфидных связей нативного иммуноглобулина (фиг. 1) и поэтому трудно получить целевое стабильное производное иммуноглобулина с количеством расщепленных дисульфидных связей
9 равных приблизительно 4,5.
Кроме того, производные иммуноглобулина, получе}шые с использованием ионов двувалентной меди, имеют пониженную антикомплементарную активность (фиг. 2), но ошювременно заметно
25 уменьшается их противодифтерийный титр по сравнению с титром нативного иммуноглобулина. Таким образом, сильно уменьшается их аитиген-связьюающая активность (фиг. 3), С другой стороны, такие производные иммуноглобулина проявляют
30 отличную от нативного иммуноглобулина оптическую активность, что свидетельствует о наличии стрзтст рных изменений белка.
4)Подобные изменения оптического вращения
Э5 наблюдаются также у производных иммуноглобулина, полученных согласно предлагаемому способу, когда в ходе проведения реакции в реакционную смесь добавляют мочевину. По зтой причине рекомендуется, чтобы в реакционной среде отсутствова0ли мочевина, гуанидин и подобные им соединения.
П р и м е р 3, Селективное расщепление межцепочных дисульфидных связей.
2 мл водного раствора, содержащего 20 мг человеческого иммуноглобулина 1,80мг S 5 -N82 5Оз (8,22 10 имп/мин на 1 моль) и 40 мг NaiS4Oe 2Н2О, доводят до рН 7,2 с помощью уксусной кислоты и проводят реакцию при 39°С в течение 2 ч. .Цалее реакционную смесь подвергают диализу против 5 л воды в течение 24 ч. Затем
0 медленно прибавляют в систему мочевину и прошюиовую кислоту до конечной концентрации 4 М и 1 к. соответственно. Отбирают для хроматографического разделения 0,1 мл раствора. Диаграмма злюции представлена на фиг. 8. Остаток реакцион5ной смеси подвергают хроматографии, используя колонку с Сефадексом G 200 (диаметром 1,5 см и длиной 100см), уравновешенной 1н раствором прописновой кислоты, содержащим 4 М мочевюш. (диоактивность образцов определена с помощью жидкого сюштилляционвого счепика и яэмерением оптической плотности при 280км (ООцо) каждой фракции. Результаты представлены на фиг. 8.
П р и м е р4. Фракционирование тяжелых и легких цепей.
К водаому раствору, содержащему 100 мг человеческого 7 глобулина1, прибавляют 0,4 г NajSOs и 0,2 г Naj 84 Oft 2Н20 и рН системы доводят до 9,0 с помощью 1 н HCI. после чего подвергают реакции при комнатной температуре в течение 48 ч. После реакции незначитетиное количество нерастворимого вещества, образующегося в системе, удаляют центрифугированием. Затем реакционную смесь подвергают даализу против 2,5л воды при в течение 15ч и далее против 2,5л водного раствора I н. пропионовой кислоты при 5° С в течение 28ч. Диализат подвергают хроматографии, используя колонку с Сефадексом G 75 (диаметром 3,5 см и длиной 111 см), уравновешенной 1 н. раствором пропионовой кислоты. Диаграмма элюции представлена на фиг. 9. На кривой наблюдается три пика, которые, как подтверждается порядком уьеличиваняцегося молекулярного веса, соответствуют нерасфракционированному S- сульфоннрованному иммуиоглобу;шну, S-сульфонированным Н-цепям и S-сульфонированным L-цепям. Идентификацию осуществляют иммунологическими методами, такими, как метод Оухтерлони н иммуно-электрофорез, а также химическими методами, такими как аминокислотный анализ, определение содержания гекозы и т.д.
Из результатов, предстаьленных на и9, можно сделять следующие выводы.
1)Так как первый пик на фиг. 9 соответствует иерасфрак1шонированному S-сульфонированному иммуноглобулину, второй пик соответствует S-сульфонированиым Н-цепям, а третий пик - S сульфонированным L-цепям, согласно иммунологическим н химическим методам анализа, то логично сделать вьюод, что подобным образом три пика на фиг. 8 (слева направо) могут быть отиесены к нерасфракционированному В-сульфонированному
иммуноглобулину, S-сульфонированным Н-цепям и Б-сульфонированным L-цепям соответственно. Различия между хроматограммами обусловлены Л жсутствием мочевиаы в системе первого исследованного образца.
2)Из количества белка в L-4enH x, образующих третий .пик (фиг. 8), вычислена шлярная концентрация, а иэ мояярйой концентрации и величин рцдиоактивности найдено, что Ьцепн, образующие ipemfi пик, содержит 1,0 группу. Таким же образом было вычислено чясяо S-SOjH rpjrai в Н-цепях BTOfWFo пяка, которое составляло /, 4. S нер сфракожмшрованном S-сульфонированном иммуноглобулине их чясж равно 8,8, а в смеси до фракциояярования на зфоматографической колсиь КС - 8,6. Н-цепь и и-цвль связаны одной дисульфиднс свяэыо, тогда как мижру дбумя Н-цепямк cyiliecT&yeT среднем 2,5 дисульфиднь х свяэеб.
Следовательно, адловеческий иммуноглобулин содержнт в среднем 4,5 дисульфидных связей (межцепочечных).
3) Согласно хроматограмме представленной на фиг. 8 большая часть S-сульфонированного иммуноглобулина, содержащего в средаем 8,6 S-SOs Н групп, разделяются на Н-цепи и L-цепи. Позтому можно предположить, что расщеплению подвергаются в основном межцепочечные д}1сульфщц1ые связи, тогда как внутрицепочечныё дисульфидные связи остаются, в основном, неизменными.
П р и м е р 5. 133 мл человеческого у-глобулиня1 растворяют в 1667 мл фосфатного буфера (рН 8,2), содержащего 2,5% глицина. К раствору прибавляют 7,0 г Naj 80з, растворенного в 100 мл того же буфера, и 4,4 г Nsa 84 О 2Н2 О, растворенного В 100 мл того же буфера, и проводят реакщ1ю при 45° С в течение 3 ч. Реакционную смесь подвергают диализу в течение 6 ч против 20 л буферного солевого раствора, состоящего из натриевой соли, используя химический стакан фирмы Dow Chemicals и ультрафильтр типа в/HFV-l. Добавляемую извне жидкость для диализа заменяют через кажда1е ч. Диализат концентрируют до объема 180 мл с помощью того же фильтра и затем к Диализату прибавляют 50 г ошцина.
Раствор отфилыровьшают в стерильных условиях через мембрану с дааметром пор 0,25 мк, сливают в бутылочки объемом 10мл по 5мл в каждую и лиофилизуют. Антикомплементная активность CHso стерильного раствора при 50%-ной концентрации составляет 4,3%.
П р и м е р 6. Сравнение активности антител по отношению к антигенам в опытах с использованием Naa 84 Oj или Cuj в качестве окислителя. Условие 1.
К 67 мл человеческого у-гпобу)тн&1, 7,1 г N32 ЗОэ и 0,43 г N62 S4 О« 2Hj О прибавляют 0,1 М трис-НС1 буферный растворJсодержащий 2,5% глицина, чтобы довести общий объем смеси до 1,0л. После трехчасовой реакщ1и при 45° С реакционную жидкость подвергают диализу, используя химический стакан фирмы Dow Chemical н ультрафильтр типа B/HFV-1, и диализат концентрируют до объема 200 мл, отфильтровывают в стерильных условиях через 0,25 мк -фильтр Seitz, лиофилнзуют, добавляют 2,5 г глицина и разбавляют водой до 5,0%-ного раствора.
Условие 2..
Повторяют реакцию и обработку по условию 1, :ИО изменяют те1Ш1ературу (25° С) и время реакции (24ч).
Условие 3.
Повторяют реакцию и обработку по условию., ГВй Ма ЗдОс Н О заменяют на 0,16 г СиЗОд
StifO.
Растворы производных иммуноглобулина, пояучвшюе йо условиям 1-3, были испытаны иа
проявление ими антктелыюй активности к раэличI ным штигенам. Результаты представлены в табл. 2
Из данных, представленных в таблш1е 2, можно сделать следующие выводы;
1)Если используют тегратионат (условие ),то дифтерийный титр S-сульфонированного иммуноглобулина эквивалентен титру нативного иммуногжЛулина, но если используют нон двувалентной меди (условие 3), то пронзвОдное иммуноглобулина почти не проявляет активности.
2)Ои1исительно титра кори S-сульфонированный иммуноглобулин, который был окислен тетратнонатом (условия 1 и 2), сохраняет более чем 60% титра нативного иммуноглобулина. Производное иммуноглобулина, окисленное ионом двухвалентной меди (условие 3). имеет значительно более низкую активность (менее чем 30%). Из этих данных следует, что понижение антительной активности при использовании иона двyiвaлeнтнoй меди более значительно, чем при использовании тетратионата.
Пример. Испытание S -сульфонированного глобулина в животном организме на а}гтиком 1лементарную активность.
Человеческий S -сульфонированнын иммуноглобулин также, как и в условии 1 примера 6.
3 мл 5%-ного буферного солевого раствора, содержащего 2,5% гяи1шиа (рН 7,4), 3 мл буферного солевого раствора без добавок (для контроля) и I мл 15%-ного необработанного человеческого иммуноглобулина в буферном солевом растворе, содержащем 2,5% глицина, также для контроля, вводят внутривенно самкам морских свинок с живым весом 200-300 г и реакцию организма на уровень сыворотопгаго комплемента определяют с помощью сывороток по 1,0 мл каждая, извлеченных пункцией сердца при определенных интервалах. Результаты представлены на фиг. 10, откуда следует, что наблюдается резкое понижение уровня сывороточного комплемента после внутривенной ИН1ЛКЦНИ необработанного человеческого иммуноглобулина, которое отсутствует при подобном введении человеческого S -сульфонированного иммуноглобулина. У морских свинок досле инъекции необработанного иммуноглобул 1на время от времени наблюдается также дгюжь, которая отсутcieyeT у живЬтных, которым вводи.ли внутривенно S -сульфонированный иммуноглобулин.
Примере. Стойкость кроличьего SсуЛьфойнрованного иммуноглобулина в живом организме и повторное образование дисульфидных связей.
а) Получение кроличьего анти БСА-ДНФ антиTerta:
Бьиий сьшороточный альбумин (БСА) реагирует с ди1ттрофторфенолом с образованием соединения, которое в дальнейщем будет обозначаться
сокращенно БСА-ЛПФ. БСА-ДНФ вводят кроликам (вид новозеландский белый, О ) через их подуилечки на ланке ног вместе с полным стимулятором Фрейнда. На 30-1 день после инъекции отбирают кровь у кроликов из коронарной артерии. Полученную антисьшоротку обрабатьшают по н вестному способу путем осаждения 45%-ным раствором сульфата аммония и получают кроличий анти БСА-ДНФ иммуноглобулин.
б) Получение образцов:
Условие 1.
Анти БСА-ДНФ иммуноглобулин гидролизуют при 37°С в течение 24 ч вместе с 1 вес.% пепсина по отношению к иммуноглобулину. Гидролизат подвергают хроматографии на колонке с Сефадексом G 50 и получают остаток О (ас )2. Условие 2.
250 мг анта БСА-ДНФ иммуноглобулина, 80мг NajSOs и 79 мг N828406 2HjO растворяют в 25 мл 0,1 М трис-НС(, содержащего 2,5% глицина (рН 8,2), и проводят реакцию при 37°С в течение 4 ч. Реакционную смесь подвергают диализу в течение 24 ч против буферного солевого раствора (рН7,4).
Получают кролнчнй S -сульфонированный иммуноглобулин.
Условие 3.
БСА-ДНФ иммуноглобулин используют без дальнейшей обработки.
в) Определение скорости удаления и стойкости.
Вышеуказанные образцы приготовлены (каждый в отдельности) в виде растворов 5%-ной концентрации.
Испытуемые растворы вводят внутривенно
кроликам (вид новозеландский белый, о , образец 1 вводят трем кроликам, образец 2 - трем кроликам иобразец3 - двум кроликам) дозой примерно 3 мл. У испытуемых животных при заранее определенных интервалах отбирают кровь -и
извлекают из нее плазму. Анти БСА-ДНФ активность в плазме определяют реакцией пассивной гемагглютннашш, при которой БСА-ДНФ фиксируется на овечьих красных кровяных клежах, с помощью глутарового альдегида и применяют метод микротитра. Результаты представлены на фиг. 11, откуда следует, что скорость удаления из организма фрагментов О (ас ) 2 весьма высока, (через указанные в табл. 3 интервалы извлекают по 0,5 мл плазмы). Радиоактивность плазмы опредет
ляют с помошью жидкостного сцкнтилляцнониого анализа. Результаты представлены в табл. 3.
На основании полученных результ1тов можно предположить, что-S-SOj И гр)ттпы в S-супьфонированном иммуноглобулине расщепляются в крови.
Т а б л и II а I
Формула яэобретевкя
Таблица 3
соединением, способным давать сульфит-ионы (6), для расщепления 3-4,5 межцрпочечмлх или 3-5 меж- и внутрицепочечных дисульфндных связей
иммуноглобулина и сульфоннрования образующихся 1НОЛЫ1ЫХ групп, причем ионы тетратисиата и суль4нпа присутствуют в реакционной сусле в мольном количестве, по крайней мере в {ша раза превышающем количество щссульфнаных спяэей.
которые должны быть подвергнуты расщеплению.
итиквнплвнвнтнав активность 100 Г(У,
О
Фиг.2
О 1/Z f
fff
/ff %Тг + Мочевина Раствор
Pui.3 ff 3 2, It facmtop ФисЛ б
QD6SO т 0.3
O.Z
U, О,
о оО
NaiSitOg
Си
2,f % /г Раствор
Фи1.5
-Си
Г.0
ftf
го 30 ito
Г(7
Fr.Me.
Фмг.7
cfpm
- sooo
2000
Гг. Wo.
yff
Fr.Ne.
фабЛ
0.5
3040
Zff
10
SOSO
Fr.Ne.
фиг.9
I
V. si
H
i .
f
V
:
о /ввИ
м
:J
