Способ получения иммобилизованной амилазы Советский патент 1977 года по МПК C07G7/02 

Изобретение относится к способу получения иммобилизованных ферментов, которые могут найти применение в химическом и фармацевтическом производстве, а также в пищевой промышленности. В числе ферментов, представляющих особый интерес для получения в иммобилизованном состоянии, следует назвать а-амилазу, которая находит широкое применение в пищевой промышленности для гидролиза крахмала до Сахаров. К настоящему времени известен целый ряд препаратов иммобилизованной сс-амилазы, полученных как ковалентным связыванием фермента с полимерным носителем, например модифицированной целлюлозой, так и включением в полиакриламидный гель. В частности, известен способ ковалентного связывания а-амилазы с эфирами целлюлозы. В этом случае иммобилизацию фермента проводят на предварительно обработанном для введения реакционноспособных групп носителе, например, диазосочетанием фермента с диазотированными 3-(«-аминофенокси)-2оксииропиловым и 2-окси-3-(л-изотиоциаиатофенокси)-пропиловым эфирами целлюлозы. Для иммобилизации раствор фермента в водном буфере при соответствующем значении рН перемешивают с нерастворимым носителем, причем иммобилизацию ведут при иониженных температурах в течение длительного времени, получая в результате препарат иммобилизованного фермента, обладающий в зависимости от условий процесса различным содержанием активного фермента, не превышающим, однако, во всех случаях 15 мг активного фермента на 1 г полимерного носителя. Однако такой способ, как и другие, известные к настоящему времени и имеющие лишь незначительные отличия, имеет ряд недостатков, к которым относятся; сложность получения активированных полимерных носителей, использование токсичных препаратов, низкая контролируемость процесса иммобилизации, малая технологичность получаемых продуктов (а в случае включения фермента в гель - заметное вымывание активного фермента в процессе работы), а также невысокое качество получаемых препаратов, определяемое количеством связанного активного фермента на единицу веса носителя. Термическая стойкость получаемых продуктов невысока-при выдерживании в течение 7 дней при 45° С они сохраняют лишь 20% исходной активности. Целью изобретения является упрощение процесса иммобилизации фермента сс-амилазы, а также повышение качества продукта. Это достигается за счет того, что а-амилазу вводят в водную или спиртовую среду вместе с карбодиимидом, а в качестве полимерного носителя используют карбоксилсодержащий материал.

Предлагаемый способ заключается в том, что а-амилазу вводят в водную или спирто- 5 вую среду вместе с сочетающим агентом - карбодиимидом, иснользуя в качестве носителя карбоксилсодержащий материал, например полипропиленовую ткань с привитыми группами акриловой кислоты, частично гидролизо- 10 ванный полиэтилеитерефталат и т. д., в форме тканей, пленок, гранул, волокон и т. и.

При этом в случае проведения иммобилизации в водной среде при значениях рН порядка 5 в соответствующем буфере, когда 15 фермент полностью растворим, в качестве сочетающего агента применяют водорастворимые карбодиимиды, например 1-циклогексил3-(2-морфолиноэтил) - карбодиимид-;и-д-толуолсульфоиат и т. д.20

Учитывая, что водорастворимые карбодиимиды представляют собой дорогие и дефицитные реактивы и сложны в производстве, предлагаемый способ предусматривает возможность проведения иммооилизации а-ами- 25 лазы в этиловом спирте с использованием в качестве сочетающих агентов значительно более дещевых и менее дефицитных карбодиимидов, растворимых в органических растворителях, например дициклогексилкарбоди- ЗО имида. При этом а-амилаза образует в спирте не раствор, как в воде, а суспензию, и таким образом иммобилизация протекает в гетерогенных условиях.

Схему иммобилизации можно представить 35 следующим образом: фермент образует в спирте суспензию, очень небольщая часть фермента нереходит в раствор, где взаимодействует с носителем через сочетающий агент, вызывая таким образом переход в раствор еще 40 одной порции фермента, ее иммобилизацию и т. д.

Таким образом, настоящий способ предусматривает возможность иммобилизации фермента как из гомогенного раствора в во- 45 де, так и из суспензии в органическом растворителе- спирте. При этом количество иммобилизуемого фермента легко дается регулировать изменением его концентрации в исходной смеси, изменением концентрации со- 50 четающего агента и изменением времени реакции.

Применяемые в снособе в качестве исходных веществ соединения являются продажными препаратами или могут быть получены из- 55 вестными способами.

Пример 1. 1 г а-амилазы (препарат Амиоризин-ПЮх производства рассказовского химзавода с амилолнтической активностью 2000 ед/г) растворяют в 100 мл ацетатного 60 буфера с рН 5,0 и ионной силой 0,02. Раствор охлаждают до 4° С, помещают в него обраец полипропиленовой ткапи с 12 вес. % приитой акриловой кислоты размером 4X4 см и при перемещивании добавляют различные 65

количества растворенного в том же буфере водорастворимого карбодиимида с мол. весом 492. Реакцию сочетания ведут в течение 2- 48 ч. Затем ткань извлекают, промывают 500 мл того же ацетатного буфера, 250 мл 1М NaCl, 250 мл 0,001 н. НС1 и 500 мл воды, все промывки ведут порциями по 50 мл и вы.сущивают. Амилолитическую активность препарата иммобилизованной а-амилазы определяют фотокалориметрически по количеству расщепленного крахмала.

Количество активной иммобилизованной а-амилазы в мг/г носителя в зависимости от концентрации карбодиимида и времени реакции приведено в табл. 1.

Таблица I

Количество активной им.мобилизованной а-амилазы, мг/г, при

Время концентрации карбодиимида, мг

Пример 2. 1 г а-амилазы суспендируют в 100 мл 96%-ного этилового снирта, суспензию охлаждают до 4° С, помещают в нее такой же образец носителя, как в примере 1, и при перемещивании добавляют различные количества растворенного в спирте дициклогексилкарбодиимида. Время реакции и промывка ткани после иммобилизации такие же, как и в примере 1.

Количество активной иммобилизованной а-амнлазы, мг/г носителя, в зависимости от концентрации карбодиимида и времени реакции приведено в табл. 2.

Таблица 2

Количество активной им.чобилизо..

ванной а-амилазы, мг/г, при

Время концентрации карбодии.мида, мг

Пример 3. Суспензию а-амилазы готовят по примеру 2 и помещают в нее образец полиэтилентерефталатной пленки 4X4 см, нредварительно подвергнутый гидролизу 3 н. НС1 при 80° С в течение 48 ч. Все дальнейщне процедуры проводят, как в примере 2.

Количество активной иммобилизованной аамилазы в мг/г носителя в зависимости от концентрации карбодиимида и времени реакции нриведено в табл. 3.

Таблица 3

Количество активной иммобилизованной а-амилазы/, мг/г, при

Время концентрации карбодиимида, мг

Во всех трех случаях для каждого образца было ироведено ио 120 исиытаний его активности, которая оказывалась постоянной, к тому же все образцы сохраняли до 80% активности носле выдерживания в течение 7 дней ири 40° С.

Формула изобретения

1.Снособ получения иммобилизованной а-амилазы на полимерном носителе, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса иммобилизации и повыщения качества продукта, а-амилазу вводят в водную или спиртовую среду вместе с карбодиимидом, а

в качестве полимерного носителя используют карбоксилсодержащий материал.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в водной среде применяют водорастворимый карбодиимид.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в спиртовой среде применяют карбодиимид, растворимый в органических растворителях.