Способ иммобилизации клеток микроорганизмов с @ -тирозиназной активностью Советский патент 1982 года по МПК C12N11/04 

(54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ С |)-ТИРОЗИНАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

I

Изобретение относится к органической химии, а именно к способам получения иммобилизованных клеток микроорганиз-; мов с fb -тирозиназной (КФ 4.1.99.2) активностью.

Использование иммобилизованных клеток микроорганизмов для получения различных веществ в последнее время очень расширяется. Иммобилизация клеток позволяет более эффективно использовать каталитические свойства микроорганизмов, так как исключаются затраты на выделение и очистку ферментов. Иммобилизованные клетки с 1 -тирозиназной активностью могут быть использованы для ферментного синтеза ,Li -тирозина, аминокислоты, получение которой другими способами является сложным и дорогим.

Известен лишь один способ иммобилизации клеток микроорганизмов с | -тирозиназной активностью путем включения в гель.

По этому способу иммобилизацию клеток Erwimq Vierb uOBc| штамм АТСС 21434 проводят включением в гель, образуюишйся путем смешивания водорастворимых полимеров поливинилового спирта, желатина, карбоксиметшщеллюлозы и тетраалкоксисйлана с добавлением кислоты. Гель сушат в замороженном состоянии в течениенескольких суток. Все операции хфоводят при температуре ниtoже 5 С. Удельная активность полученного препарата составляет

моль

л

7-10

. Далее

с.мг белка клеток по стабильности препарата в описании изобретения отсутствуют Cl.

Недостатками способа являются недостаточно высокая jb -тирозиназная удельная активность препарата, сложность и длительность процесса иммобиXлизации из-за осуществления всех операций при низкой температуре, применение дефицитных и дорогостоящих полимеров, в том числе пищевого сырья. Цель изобретения - повышение удрпь нойактивности препарата, упрощение и удешевление процесса. Указанная цель достигается тем, что согласно способу иммобилизации клеток микроорганизмов с (Ь -тирозиназной активностью путем включения их в гель, иммобилизацию приводят в присутствии стйбипизатора- ацетата аммония- или пирувата натрия или I, тирозина при этом в качестве геля используют полиакриламидный гель, а из микроорганизмов используют штамм Citrobcioter reund N 62. Иммобилизацию клеток проводят в фосфатном буфере рН 7-8 с добавлением ацетата аммония, либо в ацетатном буфере при рН 8. В буфере смешивают сус пеНзию клеток, растворы акрипамида и мегиленбисакриламица, N , Ы , N4 N тетраметилендиймина и персульфата аммония. Реакционный сосуд погружают в баню со льдом. Полимеризация заканчивается через минуту. Блок полученного полиакриламидного геля с включенными клетками протирают через полиэтиленовое сито с размером пор мм и от мывают от свободных клеток, В гель включается 89% клеток. При иммобилизации сохраняется 65% первоначальной активности. Удельная каталитическая ак тивность иммобилизованных клеток составляет (в зависимости от партии) 3-Oj4-10 моль/с «мг белка. Препарат хранят в буфере при рН 8 и +4 , через месяц хранения иммобилизованные клетки сохраняют 6О% активности от исходн в то время как натйвные клетки за этот срок полностью теряют /Ь -тиразиназную активность. Иммобилизованные клетки можно неоднократно использовать для . синтеза тирозина. При этом после перво го использования сохраняется 95% акти ности, после второго - 80%, после трет его - 50%. П р и м е р 1. К О,4 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,0 добавляют 1 м М ацетета аммония (доведенного концентрированным расйзором аммиака до рН 8) 0,2 мл суспензии клеток Citr batter freoncliV 62, содержащей 53 мг белка с удельной (Js -тирозиназной каталйтичеснэй активностью, определенной стандартным методом по синтезу тирози на 4,6 «Ю моль/с-мг белка, 1 мл 5р%-ного раствора акрил амида с добавл нием метиленбисакриламида в соотношении 19:lj 0,3 мл 109&-НОГО раствора , N , N, N-тетраметилэтилендиамина и 0,3 мл 10%-ного раствора персульфата аммония. Все растворы готовят на 0,01 М фосфатном буфере рН 7,0. Смесь быстро перемешивают в чашке Петри, помешенной в лед. Полимеризация начинается через 30 с и заканчивается через 1 мин, .блок полиакриламидного геля с включенными в него клетками протирают через полиэтиленовое сито с размером пор 1x1 мм . Частицы геля отмывают от свободйых клеток 0,05 М аммоний-ацетатным буфером рН 8,0. В гель включается количество клеток, соответствующее 47,7 мг белка, т.е. 90%. Удельная каталитическая активность по синтезу ,{i тирозина иммобилизованных клеток равна 3 моль/с, мг белка, что составляет 65% от исходной. Препарат хранят в буфере при рН 8 и +4°С, Через месяц хранения активность иммобилизованных клеток составляет 6О% от первоначальной. При проведении иммобилизации без ацетата аммония, сохраняется лишь 20% Р -тирозиназной активности. П р и м е р 2. Способ осуществляют , согласно примеру 1, но все растворы готовят в 0,05 М аммоний-ацетатном буфере рН 8,0. Результаты аналогичны полученным в примере 1. П р и м е р 3. Способ осуществляют согласно примеру 1. Используют другую партию клеток с исходной удельной JS тирозиназной активностью, равной 1,2510 моль/с, мг белка. К смеси для полимеризации акрильных мономеров добавляют вместо Ъ,5 М ацетата аммо- . ния 0,5 М пирувата натрия до конечной концентрации 0,2 М. Получают иммобилизованные клетки C.ire.UT(3ii 62 с удельной активностью 0,74-10 моль/смг белка, т.е. с Сохранением 59% активности свободных клеток и 9О%-ным включением клеток в полиакриламидный П р и м е р 4. Способ осуществляют согласно пршлеру 1. Используют ту же партию клеток . 4геипс1м , что и в при- . мере 3. К смеси для полимеризации акрильных мономеров добавляют 2,.25 мг 1Ь -тирозина и доводят фосфатным буфером до общего объема 5 мл. Получают иммобилизованные включением в полиакрш1амид1аый гель клетки С. reur(3ii 62 с удельной Ь -тирозиназной активностью, равной 0,5 10 моль/с« MI белка,т.е, равной 40% от первоначальной в 93%-ным включением клеток в потиакриламидный гель.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет осуществить иммобилизацию клеток микроорганизмов с сохранени и высокой удельной Q - ирозиназной активностью. При этом повышается стабильность фермента. Достоинствами спо:соба являются также йростота и исполь(зование в качестве носителя доступного ,и недорогого полиакриламидного геля. Формула изобретения Способ иммобилизации клеток микроорганизмов с (Ь -тирозиназной акти&ностью путем включения их в гель, отличающийся то, что, с целью .повышения удельной активЁости препарать. упрощения и удеиевпения процесса, иммобилизацию проводят в присутствии стабилизатора-ацетата аммоний нпи пирувата натрия или I, -тирозина, при этом в качестве геля используют попиеисрнламидный гель, а из микроорганизмов испоп зуют штамм СНгоЪ«С.вг {РвоовЦ 62.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США № 4148689, кл. 195-65, опублик. 1979.