Изобретение относится к способам получения оптически активных аминокислот, широко применяемых в качестве пищевых и кормовых добавок, в медицинской промышленности и сельском хозяйстве. Известны различные способы получения оптически активных аминокислот пут асимметрического гидролиза рацемически Н -ациламинокислот с помощью ацилааы иммобилизованной на различных органических и/ш неорганических носителях засчет адсорбции или ковалентного связывания, или включением в полимерные материалы. Известен способ получения оптически активных аминокислот с использованием ацилазы, иммобилизованной на анирнообменной смоле l|. Недостатками этого способа являются низкая скорость процесса, относительно низкий выход L -аминокислот, исключительная сложность получения иммобилизованной ацилазы и др. Известен также способ получения оптически активных аминокислот асимметрическим гидролизом рацемических N ациламинокислот с помощью ацилазы, иммобилизованной в полупроницаемом полимере - полиакриламиде 2. Согласно этому способу в ЗОО мл колбе смешивают 1 мп раствора ацилазы (7 мг/мл), 2 мл раствора крахмала и 2 мл раствора мономеров акриламнда и N , М -метиленбисакриламида. Смесь замораживают слоем на стенках колбы при ее вращении при -80 Сив замороженном состоянии облучают радиоактивным кобальтом, после чего лиофилтаируют. Полученный слой иммобилизованной ацилазы размельчают, помещают в разбавленный раствор рацемической Н ашшаминокислоты (О,1 М адетилметионина) и при осуществляют асимметрический гидролиз последней при встряхивании смеси. Скорость гидролиза, т.е. активность иммобилизованной ацилазы достигает 39,2-46,7% скорости, обеспечиваемой исходной ацилазой. Недостатками этого способа являются сложность процесса, обусловленная сравнительной продолжительностью и сложностью получения иммобилизованной аци- лазы; пониженная скорость гидролиза ввиду низкой активности иммобилизованной ацилазы; ограниченный срок службы дефицитного полимерн:ого материала всле ствие невозможности замены фиксированных в массе полиакриламида деактивированных молекул ацилазы на активные; трудность осуществления в увеличенном масштабе ввиду лимитирующей стадии радиополимеризации. Цель изобретения - упрощение и интенсификация процесса. Поставле1шая цель достигается тем, что в известном способе получения оптически активных аминокислот путем асимметрического гидролиза рацемических N -ациламинокислот с Помощью иммобилизованной полупроницаемым полимером ацилазы, используют ацилазу, ограничен- ную от субстрата в полости из полупроницаемой мембраны,, например из целло.фана, со средней величиной пор не более 35-40 А. Способ получения оптически активных аминокислот заключается в следующем. Изделие из полупроницаемой мембраны обычно используют трубку или мешок из целлофана, со средней величиной пор не более 40, А заполняют водной суспензией или раствором сырого или очищенного ацилазного препарата. Заполненное изделие, находящееся в покое или используемое для механического перемешивания, выдерживают в покоящемся или перемет ваемом растворе Н -ациламинокислоты при постоянной температуре не выше SO преимущественно при . Этот процес продолжают до тех пор, пока концентрац возникающей свободной аминокислоты не достигает половины концентрации исходной рацемической Н -ациламинокислоты и далее не воараст&ет. Из прореагировавшей реакционной сме си целевые продукты выделяют известны ми приемами, а изделие с раствором или суспензией ацилазного препарата используют таким же образом еще нескол ко раз (не менее 2) для осзпществле ния асимметрического гидролиза новых порций рацемической N -ациламинокис. лоты. Изделие из полупроницаемой мембраны, наполненное 1 раз раствором или суспензией ацилааного препарата, можно использовать не менее месяца. Средний размер пор полупроницаемой полимерной мембраны должен быть таким, чтобы сквозь них легко проходили молекулы М -ацетиламинокислоты и аминокислот, средняя длина которых около 10 А, но не проходили молекулы ацилаы (со средним молекулярным весом 10, т.е. с .размерами 50-60 А и более). Слишком малый р 1змер пор затрудняет иффузию субстрата через мембрану к ферменту, слишком большой средний размер пор приводит к проскоку молекул ацилазы через увеличенное число слуайных больших пор, уже пропускающих молекулы ацилазы.. Поэтому средний размер пор полимерной мембраны не должен существенно превышать 40 А. Пример, 21,4 мг ацетонового порошка почек свиньи споласкивают дистиллированной водой (5 мл) и помещают внутрь целлофановой трубки длиной 40 см и диаметром 2,5 см. Среднюю часть трубки, содержащую суспензию апетонрвого порошка, зигзагообразно помещают в сплющенном состоянии на дно эксикатора диаметром 12 см, почти полностью при- крывая дно. Расстояние между поверх-ностями сплющенной целлофановой трубки, между которыми находится суспензия ацетонового порошка, 1-4 мм. На дно эксикатора с целлофановой трубкой заливают 17,2 мл 0,5 М рацемического N-ацетил метионита с 3, ацетата кобальта, который образует слой жидкости высотой около 3 мм. Эксикатор термостатируют при 36-4О с, прослеживая концентрацию метионина с помощью нингидрида, до завершения реакции (0,25 М метионина). Раствор прореагировавшей реакционной смеси собирают, на целлофановую трубку с ацилазной суспензией вновь наливают такой же объем субстрата и процесс втечение месяца повторяют еще 2 раза с 17,2 мл 0,5 М рацемического ацетилметионина, а за-Гем еще 5 раз с 34,4 мл.Cкqpocть реакции соответствует примерно 50%-ной активности исходной ацилазы. 200 мл собранных реакционных смесей обрабатывают активным углем, фильтруют и упаривают в вакууме. К остатку приливают примерно ЗО мл абсолютного спирта. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают спиртом, эфиром и сушат. Выход 5 г L. -метионина (60%), -ь22,9С ( 5 н.нсе). Пример 2. 5 мл раствора ащ1 лазы почек свиньи ОЗХР (с дбщей. ак-.. тивностью на 1 мл раствора 47 50 мкмоль/ Ь -метионина при использовании рацема та ацетилметионина в качестве субстрат помещают в цаалофановый мешочек, сплю щенная рабочая часть которого- 5x5 см и общая рабочая поверхность 50 см. Мещочек укрепляют на изогнутом конце стеклянной палочки шириной 4 мм, испол зуемой в качестве мешалки. Отношение общей поверхности заполненной раствором ацитазы нижней части мешочка к объему раствора аципазы в нем 8:1 ( В. стакан на 250 мл наливают 50 мл раствора 0,5 М раствора рацемического ацетилаланина с рН 7,2 с 3, ацетата кобальта, термоста тируют стакан при 37°С в термостате, вводят в раствор ацетилаланина мешалку с ацилазным мешочком, которую приводя в движение. Процесс при размешивании со скоростью около 40 об/мин продолжают при до завершения реакции (примерно 3,5 ч, при 0,25 М концентра ции аланина, оцениваемой с помощью нингидрина). Опыт со свежей порцией 0,5 М ацетилаланина повторяют еще раз с тем же результатом. Иммобилизованная ацилаза функционирует с, сохра- нением 86% активности исходной, так ка в смеси 1 мл того же раствора аципазы с 10 мл 0,5 М ацетилаланина реакция при 37 С завершается за 3 ч. П р и М е р 3. Хранившиеся в замороженном состоянии, почки свиньи 0,5 кг гомогениз1фуют в течение 5 мин в размельчителе тканей. Такой же, как в примере 2, мешочек с 1 г полученной размельченной биомассы св:янных почек с общей ацилазной активностью 7200 мкмоль/ч Ь -метионина прогревают в погруженном состоянии с 25 мл такого же, как в примере 2, рацемического 0,5 М ацетилаланина 2О ч при . Реакцию завершают. Опыт с новой порци ей ацетиаланина с тем же результатом повторяют еще раз. К объединешшгм двум порциям прореа гировавшего раствора ацетилаланина 5О мл приливают объединенный раствор прореагировавшего алетштапанина, получе ный в примере 2. Полученный общий рас твор прореагировавшего ацетилаланина {ЗОО мл) ртаривают в вакууме при 45 С до сиропообразного состояния. После охлаждения до комнатной темпера туры добавляют 30 мл этилового спирта и смесь оставляют на 16 ч при +4°С для кристаллизации. Кристаллы I. -аланина отфильтровывают, промывают спиртом и сушат при 50 С до постоянного веса. Выход L -аланина 5,4 г (81%),о +14, ( 5 н.НСе). П р и М е р 4. Один конец влажной целлофановой трубки длиной около 30 см, ширина которой в сплющенном состоянии 5,5 см, завязывают в узел, который не пропускает воду. В целлофановую трубку помещают кусок 5К17 см сетки примерно с 10О ячейками на 1 см, образованными капроновыми нитями толщиной около О,2 мм. Затем наливают в целлофановую трубку Ю мл водного раствора ацилазы почек свиньи ОЗХР (4 мг/мл) с общей ацилазной активностью 16000мкмоль L -метионина/ч, удаляют по возможности пузыри воздуха из пространства целлофановой трубки с сеткой, куда налит раствор ацилазы, и завязывают на узел второй конец целлофановой трубки. В стеклянную хроматографическую камеру с пришлифованной крышкой с плоским ровным дном 8,5X18,5 см и высотой 2О см помещают на дно кусок-7,5 17,5см такой же капроновой сетки, напивают 100 мл 0,5 М рацемического ацетил- валина с ,2, установленным с помощью НаОН, и помешают на дно подготовленную целлофановую трубку с раствором ацилазы. Камеру выдерживают в термо- статируемом сушильном шкафу при 37- 39 С, прослеживая ход реакции по увеличивающейся концентр щии валина. Через 22,5 ч такого прогревания реакционную смесь упаривают в вакууме. К остатку приливают примерно 2О мл спирта и оставляют на 16 ч при 4 С для кристаллизации. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают спиртом и высушива ют. Выход L -валина 2,24 г (76,4%),d +25, (,72; 5н.НСе). Пример 5. В такой же -хроматографической камере с такой же завязанной целлофановой трубкой с капроновой сеткой, с 1О мл такого же раствора адилазы, как в примере 4, при 37-39 С прогревают 1ОО мл 0,5 М рацемического ацетилсерина с рН 7,2 в течение 15 ч. Затем реакционную смесь упаривают в вакууме при 5О-6О С до сиропообразного состояния; Добавляют примерно 2О мл этилового спирта. Для полной кристаллизации L -серина смесь оставляют при температуре 4 С на 10-15 ч. Осадок отфильтровывают, промывают 10-15 мл
холодного этилового спирта,, сушат при температуре 60-7ОЧ1;. Выход 1,89 г (72%),fl4,6°C ( н. НС).
При осушествлении предлагаемого способа значительно упрощается процесс получения иммоёидизованной ацилазы, который сводится к заполнению изделий из полупроницаемой мембраны раствором или суспензией ацилазного препарата инет потребностив дефицитных реактивах иаппа-, ратуре; значитепьно ускоряется процесс, так как скорость гидролиза в присутствии иммобилизованной ацилазы т.е. ее активность достигает 80-86% скорости, обеспечиваемой исходной ацилазой. Кроме того, при снижении ацилазной активности ацилазы, заключенной в ограничивающей полости, например в трубке или мещке, первоначальную активность восстанавливают добавлением свежей порции фермент Это значительно увеличивает срок службы соответствующего изделия из полупроницаемой мембраны.
Формула изобретения
Способ получения оптически активных аминокислот путем ассиметрического идролиза рацемических N -ациламинокислот с помощью иммобилизованной полупроницаемым полимером ацилазы, о т - личающийся тем, что, с целью
упрощения и интенсификации процесса, используют ацилазу ограниченную от субстрата в полости из полупроницаемой мем- браны, например из целлофана, со средней величиной пор не более 35-4О А.
15Источники информации,
принятые во внимание при экспертизе
. 1. Патент Японии № 74-125585, кл. 36(2), опублик. 05.12.74. 20 2. KQxvQshimo К., ипглееЧо К,, Tmmobie.i2.QtVon ot enxvmQS bv rod poCymer zatton of Qcrv/tomide. BiotechnoC.and Bioet. 16, № 5, 6O9, 1974. (прототип).
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
Способ получения -аминокислот | 1976 |
|
SU591458A1 |
Способ получения -аминокислот | 1973 |
|
SU523892A1 |
Способ получения иммобилизованной аминоацилазы | 1976 |
|
SU575352A1 |
Способ получения -аминокислот | 1978 |
|
SU706402A1 |
Способ получения иммобилизованной аминоацилазы | 1982 |
|
SU1060676A1 |
Способ получения ацилазы 1 | 1975 |
|
SU572495A1 |
Способ получения -аминокислот | 1976 |
|
SU573479A1 |
Способ определения активности аминоацилазы | 1980 |
|
SU968070A1 |
Способ получения оптически активных аминокислот из рацемических смесей N-ацетил- @ -аминокислот | 1980 |
|
SU910603A1 |
Способ получения @ -яблочной кислоты | 1984 |
|
SU1254004A1 |
Авторы
Даты
1980-04-30—Публикация
1976-01-04—Подача