Способ подсчета лейкоцитов Советский патент 1978 года по МПК G01N1/30 A61B5/145 

1

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в диагностической практике для определения содержания лейкоцитов в крови.

Известен способ подсчета лейкоцитов путем фиксации, ферментативного окрашивания и гемолиза 1 .

Однако известный способ не обеспечивает дифференциального подсчета лейко1штов от других форменных элементов крови.

Целью изобретения является дифференциальный подсчет лейкоцитов от других форменных злементов крови, например, с помощью фотометрии.

Эта цель достигается тем, что фиксацию цельной крови проводят моноальдегидом с последующим гемолизом и окрашиванием цитохимическим субстратом, смешанным с хромогенным сопрягающим реагентом, который не образует внеклеточных макрочастиц, добавлением буферной смеси для регулирования рН и подогревом полученной смеси от 20 до 55°С в течение 1-10 мин.

Кроме того, при окраишвании нейтрофилов и ЭОЗИНОФИ.ИОВ, в качестве цитохимического окрашивающего субстрата используют перекись, а хромогенного сопрягающего реагента - 4-хлор-1-нафтал, а для окрашивания моноцитов в качестве цитохимического окрашивающего субстрата используют альфа-нафтилбутират, а хромогенного сопрягающего р .агента - гексазоний - парарозанилин.

Способ осуществляют следующим образом.

Добавляют отологический фиксирующий реактив к раствору, содержащему белые кровяные клетки (например, цельную кровь) для умерщвления содержащихся там кровяных клеток и иммобилизации содержащихся з клетках каталитических знзимов. Предпочтительными являются пробы жидкости организма, такие, как цельная кровь и спинномозговая жидкость. После добавки фиксирующего реактива раствор обрабатьшают особым цитохимическим веществом, хромогенными осаждающим копулирующим реактивом и буфером.

Цитологический фиксирующий раствор) представляет собой преимущественно 0,2-40%-ный водный раствор моноальдегида, такого как формальдегид, бутиральдегид, пропиональдегид и ацетальдегид. Диальдегиды непригодны, так как обуслоливают сетчатую структуру и вызывают внеклеточ ные осаждения.

Концентрация моноальдегида Должна быть достаточно высока для умерщвления клеток, однако, без нарушения активности энзим.

Низкие концентрации при 1шзких температурах требуют дополнительного времени. Так, например, при концентрации формальдегида в растворе равной 2%, при 4°С требуется 12 ч, а при 4%-ной концентрации при 50°С требуется 2 мин.

Так как обычно смецювают равные объемы жидкости организма и раствора моноальдегида, крепость альдегадного раствора является двойной по сравнению с концентрацией во время фиксашш альдегида в растворе.

Предпочтительным является 37%-ный раствор формальдегида.

Когда жидкость организма, содержаидая лейкоциты, представляет собой цельную кровь, то необходимо осуществить гемолиз лейкоцитов, так как существует опасность, что совпадающее прохождение двух или большего количества красных клеток через фотометрическую счетную стандаю ошибочно может быть принято как окрашенные лейкоциты или ненормальные клетки. Для этого осуиюствляют гемолиз красных кровяных клеток путем добавления реагента к суспензии клеток, чтобы обусловить разрьш только красных клеток и вьоделение их содержимого (например, гемоглобина) в .раствор.

Гемолиризующие реагенты не должны сверть1вать взвешенные клетки и не должны мешать протеканию Л1юбых последующих гистохимических реакций путем, например, взаимодействия с какими-либо соединениями; используемыми для окрашивания клеток на послещшх этапах.

Гемолиз проводят либо до, либо после окрашивания. Если гемолиз проводят после окрашивания, то это не должно сушественио изменять окраску или изменять окрашенные или неокрашенны лейкоциты.

Гемолиз проводят введением в раствор, содержащий красные и белые кровяные клетки, водного раствора алифатической кислоты с величиной рН |3,0-5,5. Удовлетворительные результаты дает применение уксусной, пропионовой, масляной и молочной кислот в концентрации 1-10%.

Предпочтительным является раствор уксусной кислоты концентрации около 7%. Раствор может быть нагрет до температур, начиная от 40 (в течение 8 мин) до 55°С (в течение 1 мин), чем достигается инактивация энзима катализы, снижение псевдопероксидазной активности гемоглобина и ускорение гемолиза. При более низких температурах для реак1ии требуется больше времени. Использование еще более высоких температур инактивирует энзимы пероксидазы и ускоряет свертывание после введения гемолизирующего реагента.

Окрашивание клеток требует тщательного выбора реактивов. Используют большое ко;шчество

известных цитохимических субстратов. Так для окрашивания клеток, содержащих пероксидазу, таких как эозинофилы или нейтрофилы, применяют смес§ неорганической или органической перекиси и 4-хпоро-1-нафтала. Перекись и 4-хлоро.1-нафтал служат в качестве энзимных субстратов, а 4-хлоро-1нафтал служит также в качестве копулирующего реагента. 4-Хлрро-1-нафтал производит темно-синее окрашивание внутри содержащей пероксидазу клетки без введения отдельного хромогенного осаждающего копулирующего реактива. Можно также использовать смесь (7-толидина и 4-хлоро-Ьнафтала для получения пурпурно-красного красителя, если используемый на ступени фиксирования формальресид инактивирован.

Для избирательного окрашивания контролируют рН раствора. Если рН раствора ниже 3,0, то тяжелые осадки красителя образуются только в зозинофилах. Если рН раствора находится в пределах 3,0-5,0, то тяжелые осадки красителя образуются только в нейтрофилах. Если рН находится в пределах 5,0-7,0, то тяжелые осадки красителя образуются только в эозинофилах и нейтрофилах.

ЕСЛИ окрашивают липазосодержащие клетки,

т.е. моноциты, то используют комбинации сложного эфира, нафтола, такого как 1-нафтилацетата или 1-нафтилбутирата и диамониевой соли, например, гексазоний - парарозанилии, который является хромогенным осаждающим копулирующим реагентом; рН для этой реакции окрашивания 5,56,5, предпочтительно около 6,0, при такой рН тяжелые осадки красителей образуются только в моноцитах.

С целью адекватного цветного окрацшвания

в моноцитах за короткий отрезок времени, например за 5 мин концентрация субстрата должна превышать примерно 0,5 мг/мл в окончательном инкуба1шонном растворе. Сложные зфиры нафтал-AS и их производные и 1-нафтилбутират менее растворимы, чем 0,5 мг/мл, поэтому в них вводят 2,2-оксидиэтанол (диэтиленгликоль) или другие водные спирты или эфиры, например этиленгликоль, пропиленгликоль, диметиловый эфир этиленгликоля

к диэтилкарбитоля.

После этого 1-нафтилбутират и 1-нафтилацетат могут быть растворены в концентрациях до 1 мг/мл. Могут быть растворены также и другие

субстраты, такие как нафтилхлорацетат, сложные индоксильные эфиры, такие как сложные эфиры индоксилацетата, индоксилпропионата и индоксилбутирата, сложные эфиры 8-оксихино;тина, такие как 8-оксихинолинацетат, 7-оксихииолиниропиоиат

и 8-оксихинолинбутарат. При тех же условиях будет растворено только около 0,1 мг/мл нафтал-AS-ацетата, что приводит к значительно более слабому выявлению цветного окрашива1шя. Другие сложные зфиры производных иафтал-AS растворяются даже в меньшей степени.