РЕАКТИВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГЕМОГЛОБИНА И КОЛИЧЕСТВА ЛЕЙКОЦИТОВ В ПРОБЕ КРОВИ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/50 G01N33/72 

Изобретение относится к гематологическим анализам.

Изобретение относится, в частности, к реактиву для определения содержания гемоглобина и количества лейкоцитов в пробе крови.

Определение концентрации гемоглобина и количества лейкоцитов, в особенности некоторых лейкоцитарных субпопуляций, имеет первостепенное значение в диагностике некоторых патологий как в медицине человека, так и в ветеринарии.

Гемоглобин представляет собой хромопротеин, содержащийся в красных кровяных тельцах (или эритроцитах) крови.

Определение концентрации гемоглобина, следовательно, требует использования реактива для клеточного лизиса, способного осуществлять лизис эритроцитов или красных кровяных телец, чтобы высвобождать гемоглобин для определения его содержания.

Для этих целей известно использование реактивов, содержащих цианид-ионы, способные осуществлять лизис эритроцита и превращать гемоглобин в хромогенное стабильное соединение, чтобы можно было осуществлять его определение путем колориметрического измерения. Реактив этого типа описывается, в частности, в патенте США 3874852. Основным недостатком этого реактива является использование цианида. Кроме того, он не позволяет идентифицировать и определять количество лейкоцитарных субпопуляций, содержащихся в пробе анализируемой крови.

Действительно, определение лейкоцитарных субпопуляций, в особенности лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов и эозинофилов, оказывается имеющим первостепенное значение для идентификации некоторых патологий.

Различные реактивы, не содержащие цианида, уже были предложены в уровне техники для определения количества лейкоцитов в пробе крови.

Примеры таких реактивов описываются, например, в европейском патенте 0325710.

Если эти реактивы и обладают тем преимуществом, что в них не используют цианид, однако они имеют тот недостаток, что не позволяют идентифицировать и точно определять количество лейкоцитарных субпопуляций крови.

Так, реактив согласно европейскому патенту 0325710 позволяет, например, определять содержание эозинофилов, присутствующих в пробе крови, однако не позволяет точно идентифицировать каждую из других лейкоцитарных субпопуляций.

С другой стороны, в европейском патенте 0424871 описываются реактивы, позволяющие дифференцировать лейкоцитарные субпопуляции. Однако эти реактивы иногда испытывают затруднения в преодолении резистентности мембран, которая имеет место в патологии человека и биологии животного.

Целью изобретения является в частности преодоление вышеуказанных недостатков.

Изобретение относится, в частности, к получению реактива для гематологического анализа в целях определения содержания гемоглобина и количества лейкоцитов в пробе крови, который позволяет в частности осуществлять лизис эритроцитов или красных кровяных телец, а также проводить определение содержания гемоглобина без использования цианидов.

Изобретение также относится к получению такого реактива, который позволяет осуществлять определение количества всех лейкоцитов или белых кровяных телец, идентификацию по крайней мере одной лейкоцитарной субпопуляции и определение количества по крайней мере одной лейкоцитарной субпопуляции.

Оно также относится к получению такого реактива, который может быть использован как в медицине человека, так и в ветеринарии.

Кроме того, изобретение относится к получению такого реактива, который способен преодолеть затруднения при анализе, связанные с резистентностыо мембраны, с которыми сталкиваются в патологии человека, а также в биологии животного.

На этот предмет, согласно изобретению, предлагается реактив вышеуказанного типа, который включает:

- по крайней мере один детергент катионного типа;

- соединение гликозидного типа, в частности сапонин;

- по крайней мере одну неорганическую соль и/или осмотический агент, и/или лейкопротектор; и

- органический и/или неорганический буфер, подходящий для избирательного установления величины рН реактива, либо почти при нейтральном значении (рН составляет 5-8), либо при основном значении (рН составляет 8-12).

Таким образом, гематологический реактив согласно изобретению включает по крайней мере четыре основных компонента, которые позволяют достигать вышеуказанных целей.

Детергент катионного типа выполняет функцию лизиса красных кровяных телец, или эритроцитов, что позволяет высвобождать гемоглобин, который затем может быть определен путем измерения коэффициента поглощения.

Ионные (анионные и катионные) детергенты главным образом используют для разложения протеиновых комплексов и солюбилизации протеинов мембран. Они являются так называемыми денатураторами.

Кроме того, они оказывают быстрое и неспецифическое воздействие на популяции клеток крови (эритроциты и лейкоциты).

Соединение гликозидного типа, в частности сапонин, способствует лизису красных кровяных телец. Кроме того, оно выполняет стабилизирующую функцию в отношении гемоглобина, что позволяет его определять при определенной длине волны; в частности это соединение способствует разрушению резистентных мембран красных кровяных телец.

Сапонины, называемые еще сапонозидами, представляют собой гликозиды, обладающие способностью специфически вызывать лизис эритроцитов, однако, этот лизис является менее быстрым, чем достигаемый в присутствии ионных детергентов. Когда сапонины используют в сочетании с другими детергентами, они позволяют достигать более быстрого и более специфического лизиса эритроцитов, что ограничивает повреждение лейкоцитов.

Сверх того, химическая структура этого типа соединений, характеризующаяся углеродными скелетами с многочисленными циклами, позволяет осуществлять физико-химическую стабилизацию производных, образующихся за счет окисления гемоглобина.

Неорганическая соль принимает участие в детергентной активности. Кроме того, она является необходимой для осуществления измерения с помощью удельного сопротивления.

Осмотический агент по существу играет лейкопротекторную роль, когда реактив используют при нейтральном рН-значении, для благоприятствования дифференциации лейкоцитарных субпопуляций.

Наконец, буфер является определяющим компонентом, так как рН реактива представляет собой важную характеристику. В самом деле, в зависимости от рН реактив позволяет идентифицировать одну или несколько лейкоцитарных субпопуляций.

Когда величину рН реактива доводят до практически нейтрального значения (рН составляет 5-8), то с его помощью можно определять количество и идентифицировать три следующие лейкоцитарные субпопуляции: лимфоциты, моноциты и нейтрофилы.

Когда величину рН реактива доводят до основного значения (рН составляет 8-12), то с его помощью можно, кроме того, идентифицировать и определять количество полинуклеарных эозинофилов.

Таким образом, для тех видов применения, которые требуют идентификации полинуклеарных эозинофилов, величину рН реактива нужно доводить до основного значения.

Напротив, если идентификация эозинофилов не требуется, то величину рН реактива доводят до практически нейтрального значения.

В реактиве, согласно изобретению, детергент предпочтительно выбирают среди следующих соединений:

- первичные амины, ацетаты и гидрохлориды жирных аминов;

- четвертичные аммониевые соли и триметилцетиламмоний-бромид;

- амиды замещенных диаминов, катионизированные этилсульфатом; диэтаноламинопропиламин; диэтиламинопропиламид; и

- циклизованные амиды диэтилентриамина.

Детергент предпочтительно присутствует в концентрации от 0 до 50 г/л, и более предпочтительно около 18 г/л.

Из соединений гликозидного типа особенно предпочтительны сапонины, называемые еще сапонозидами, которые могут быть либо тритерпенового типа, либо стероидного типа.

В реактиве, согласно изобретению, соединение гликозидного типа присутствует предпочтительно в концентрации от 0,5 до 20 г/л и более предпочтительно около 2 г/л.

Неорганическую соль предпочтительно выбирают среди следующих соединений: хлорид, сульфат или фторид натрия или калия.

Эта неорганическая соль присутствует предпочтительно в концентрации от 1 до 15 г/л, и более предпочтительно около 8 г/л.

Осмотический и/или лейкопротекторный агент реактива, согласно изобретению, предпочтительно выбирают среди маннита, D-глюкозы и аналогичных соединений.

Этот осмотический и/или лейкопротекторный агент присутствует предпочтительно в концентрации от 0 до 30 г/л, и более предпочтительно около 2,5 г/л.

Органический и/или неорганический буфер предпочтительно выбирают среди следующих соединений:

- триэтаноламин;

- гидрофосфаты натрия и калия;

- N-(2-ацетамидо)-2-иминодиуксусная кислота;

- N-(карбамоилметил)иминодиуксусная кислота;

- 2-амино-2-метилпропан-1,3-диол;

- глицин;

- карбонат натрия;

- лимонная кислота; и

- трис(гидроксиметил)аминометан.

Этот буфер предпочтительно присутствует в концентрации от 0 до 2 мас.%.

Согласно первому варианту осуществления изобретения, с помощью буфера устанавливают величину рН реактива в диапазоне 5-8.

Согласно другому варианту осуществления, с помощью этого буфера устанавливают величину рН реактива в диапазоне 8-12.

Ниже изобретение описывается с помощью следующих примеров, не ограничивающих его объема охраны.

ПРИМЕР 1

Реактив получают из нижеперечисленных соединений в указанных концентрациях:

Соединения Концентрация

Хлорид натрия 9 г/л

С₁₅Н₃₄НСl (катионный детергент) 12 г/л

Сапонин тритерпенового типа 2 г/л

Карбонат натрия (буфер) 2 г/л (0,2 мас.%)

Соединения смешивают и рН доводят до щелочного значения в диапазоне 8-12, а именно 10,5.

С помощью таким образом полученного реактива проводят два гематологических анализа, используя автоматический гематологический анализатор, выпускаемый под маркой АВХ-Микрос французской фирмой АВХ.

Для этой цели предварительно смешивают определенный объем пробы анализируемой крови с определенными объемами разбавителя и вышеуказанного реактива.

В примере измерения проводят на крови животного. Результаты измерений, проведенных на двух различных пробах крови, представлены на фигурах 1 и 2.

На этих фигурах представлено количество лейкоцитов в зависимости от относительной интенсивности. Констатируют существование 4 лейкоцитарных субпопуляций.

В данном случае речь идет об анализе по удельному сопротивлению, так что наблюдают, справа налево, разграниченные курсорами, следующие субпопуляции: лимфоциты (ЛИМ), моноциты (МО), гранулоциты (ГРА) и полинуклеарные эозинофилы (ЭОЗ).

Автоматический анализатор дает следующие результаты расчета, которые указывают, для каждой лейкоцитарной субпопуляции, количество подсчитанных клеток и соответствующий процент.

Анализ 1 (фигура 1):

ЛИМ: 3956 клеток 53,23%

МО: 420 клеток 5,65%

ГРА: 2576 клеток 34,65%

ЭОЗ: 481 клетка 6,47%

Анализ 2 (фигура 2):

ЛИМ: 1071 клетка 9,34%

МО: 805 клеток 7,00%

ГРА: 8906 клеток 77,52%

ЭОЗ: 706 клеток 6,14%

Таким образом, реактив согласно настоящему примеру позволяет идентифицировать и определить количество каждой из четырех вышеуказанных субпопуляций.

ПРИМЕР 2

Используют такой же реактив, что и в примере 1, и проводят аналогичные анализы двух различных проб крови человека. Измерения осуществляют с помощью автоматического гематологического анализатора АВХ-Вега фирмы АВХ.

Результаты представлены на фигурах 3 и 4.

Для пробы, соответствующей фигуре 3, анализ позволяет идентифицировать и определить количество четырех следующих субпопуляций: лимфоциты (ЛИМ), моноциты (МО), гранулоциты (ГРА) и полинуклеарные эозинофилы (ЭОЗ). Эти последние составляют 5% от всей популяции.

В случае пробы, соответствующей фигуре 4, анализ позволяет идентифицировать и определить количество трех следующих субпопуляций: лимфоциты (ЛИМ), моноциты (МО) и гранулоциты (ГРА). Кроме того, согласно анализу обнаруживают, что проба не содержит полинуклеарных эозинофилов (содержание 0%).

ПРИМЕР 3

Используют реактив, аналогичный используемым в примерах 1 и 2, но устанавливают нейтральное рН-значение, а именно 7,6. Проводят аналогичные анализы пробы крови человека. Измерения осуществляют с помощью автоматического гематологического анализатора АВХ-Вега фирмы АВХ.

Результаты измерений представлены на фигуре 5. Выявляются единственные три следующие основные лейкоцитарные субпопуляции: лимфоциты (ЛИМ), моноциты (МО) и гранулоциты (ГРА).

ПРИМЕР 4

Используют реактив, аналогичный используемому в примере 3, следовательно, с установленным нейтральным рН-значением. Проводят аналогичные анализы пробы крови человека. Измерения осуществляют с помощью автоматического гематологического анализатора типа АВХ-Микрос фирмы АВХ.

Результаты измерений представлены на фигуре 6. Как и в примере 3, выявляют единственные три следующие основные лейкоцитарные субпопуляции: лимфоциты (ЛИМ), моноциты (МО) и гранулоциты (ГРА).

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологическим анализам. Реактив для определения содержания гемоглобина и количества лейкоцитов в пробе крови включает, по крайней мере, один детергент катионного типа; сапонин; по крайней мере, одну неорганическую соль и осмотический и/или лейкопротекторный агент; и органический и/или неорганический буфер, подходящий для избирательного установления величины рН реактива, либо на практически нейтральном значении рН 5-8, либо на основном значении рН 8-12. Использование реагента позволяет определять содержание гемоглобина без использования цианидов, а также идентифицировать и определять количество лейкоцитарных субпопуляций. 11 з.п. ф-лы, 6 ил.

1. Реактив для определения содержания гемоглобина и количества лейкоцитов в пробе крови, отличающийся тем, что он включает по крайней мере один детергент катионного типа, сапонин, по крайней мере одну неорганическую соль и осмотический и/или лейкопротекторный агент, и органический и/или неорганический буфер, подходящий для избирательного установления величины рН реактива, либо на практически нейтральном значении рН 5-8, либо на основном значении рН 8-12.2. Реактив по п.1, отличающийся тем, что детергент выбирают среди следующих соединений: первичные амины, ацетаты и гидрохлориды жирных аминов, четвертичные аммониевые соли и триметилцетиламмонийбромид, амиды замещенных диаминов, катионизированные этилсульфатом, диэтаноламинопропиламин, диэтиламинопропиламид и циклизованные амиды диэтилентриамина.3. Реактив по любому из пп.1 и 2, отличающийся тем, что концентрация детергента составляет не более 50 г/л.4. Реактив по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что сапонин присутствует в концентрации от 0,5 до 20 г/л.5. Реактив по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что неорганическую соль выбирают среди следующих соединений: хлорид, сульфат или фторид натрия или калия.6. Реактив по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что неорганическая соль присутствует в концентрации от 1 до 15 г/л.7. Реактив по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что осмотический и/или лейкопротекторный агент выбирают среди маннита, D-глюкозы и аналогичных соединений.8. Реактив по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что осмотический и/или лейкопротекторный агент присутствует в концентрации от 0 до 30 г/л.9. Реактив по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что органический и/или неорганический буфер выбирают среди следующих соединений: триэтаноламин, гидрофосфаты натрия и калия, N- (2-ацетамидо)-2-иминодиуксусная кислота, N-(карбамоилметил) иминодиуксусная кислота, 2-амино-2-метилпропан-1,3-диол, глицин, карбонат натрия, лимонная кислота и трис(гидроксиметил)аминометан.10. Реактив по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что органический и/или неорганический буфер присутствует в концентрации до 2 мас.%.11. Реактив по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что с помощью буфера устанавливают величину рН реактива на значении 5-8.12. Реактив по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что с помощью буфера устанавливают величину рН реактива на значении 8-12.