ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к реактиву и набору реактивов для классифицирования и подсчета лейкоцитов в биологическом образце.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Клетки крови продуцируются в костном мозге, дифференцируются из незрелых клеток в зрелые клетки и мигрируют в периферическую кровь. У здорового человека незрелые лейкоциты не встречаются в периферической крови. Однако в ряде случаев незрелые лейкоциты появляются в периферической крови пациентов, страдающих лейкозом, метастазированием рака в костный мозг, множественной миеломой, тяжелой инфекцией или другими подобными заболеваниями. Поэтому очень важно классифицировать и определять зрелые и незрелые лейкоциты в биологических образцах для диагностирования этих заболеваний.
В качестве реактива для определения незрелых лейкоцитов известен реактив, раскрытый в патентном документе Japanese Unexamined Patent Publication No. Hei 10(1998)-206423. Этот реактив смешивают с биологическим образцом с получением образца для измерения, полученный образец для измерения вводят в проточный цитометр, и на основе оптической информации, полученной в результате воздействия света с конкретной длиной волны, классифицируют и, соответственно, подсчитывают зрелые и незрелые лейкоциты в образце. Кроме того, незрелые лейкоциты могут быть дополнительно классифицированы на миелобласты, незрелые гранулоциты и другие подобные клетки, и, соответственно, подсчитаны.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачи, решаемые изобретением
При анализе клеток крови с использованием традиционного реактива, например, на проточном цитометре в ряде случаев частично перекрываются область сигнала дебриса лизированных эритроцитов (эритроцитарных теней) и область сигнала миелобластов. При анализах с использованием такого реактива, даже когда анализируют образец крови, не содержащий миелобластов, сигнал дебриса эритроцитов ошибочно распознается как сигнал миелобластов, вследствие чего при анализе клеток крови нельзя получить точный результат. Например, периферическая кровь пациентов, страдающих специфическими заболеваниями, такими как множественная миелома, рак желчного протока, перитонит, диабет, гломерулонефрит, плеврит или другими подобными заболеваниями, не содержит миелобласты. Однако при проведении анализа клеток крови в периферической крови таких пациентов с использованием традиционного реактива в ряде случаев сигнал обнаруживался в области, где на скатерограмме обнаруживаются миелобласты. Причина этого, как считают, заключается в том, что эритроциты в образце крови этих специфических пациентов не лизированы полностью, и отличаются от эритроцитов в образце крови здорового субъекта или пациентов с заболеваниями, отличными от тех, которые упомянуты выше. Если в периферической крови обнаруживается большее количество миелобластов, чем количество, которое присутствует на самом деле, то существует вероятность постановки неправильного диагноза и лечения. Используемый здесь термин "эритроцитарные тени" обозначает эритроциты, которые утратили свой гемоглобин в результате реакции образца крови и реактива для анализа крови, но не произошло в достаточной степени их сжатие.
Поэтому целью настоящего изобретения является разработка реактива, который позволяет классифицировать и подсчитывать незрелые лейкоциты более точно, даже при проведении анализа образцов крови пациентов с такими описанными выше специфическими заболеваниями.
Средства решения задач
Для решения описанных выше задач авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования и обнаружили, что упомянутые выше задачи могут быть решены путем снижения осмотического давления реактива для анализа незрелых лейкоцитов до уровня ниже того, который традиционно использовали.
Для того чтобы предотвратить лизис этих клеток крови во время измерения, считалось предпочтительным, чтобы традиционный реактив для анализа незрелых лейкоцитов имел такое же осмотическое давление, какое имеют незрелые лейкоциты и зрелые лейкоциты.
Однако в настоящий момент обнаружено, что точность анализа биологических образцов от пациентов, страдающих специфическими заболеваниями, такими как множественная миелома, рак желчного протока, перитонит, диабет, гломерулонефрит, плеврит или другими подобными заболеваниями, повышается, если используют реактив для анализа, имеющий неожиданно низкое осмотическое давление по сравнению с общепринятыми значениями. Например, при использовании реактива для анализа, имеющего низкое осмотическое давление, миелобласты и лизированные эритроциты могут быть различены более четко. Более того, к настоящему моменту неожиданно обнаружено, что реактив для анализа по настоящему изобретению позволяет отличать незрелые лейкоциты от зрелых лейкоцитов так же четко, как это достигается в случае традиционного реактива, имеющего высокое осмотическое давление, даже для биологических образцов от пациентов, страдающих заболеваниями, отличными от упомянутых выше специфических заболеваний. Например, обнаружено, что в результате использования реактива для анализа по настоящему изобретению может быть предотвращено появление эритроцитарных теней.
Для некоторых образцов крови сигнал миелобластов и сигнал базофилов перекрываются даже тогда, когда используют реактив, имеющий низкое осмотическое давление. Вследствие этого возможно идентифицирование миелобластов в периферической крови здорового субъекта, несмотря на то, что миелобласты в ней отсутствуют, и получение ошибочного результата. Эта дополнительная проблема, заключающаяся в перекрывании сигналов миелобластов и базофилов, могла бы быть решена путем понижения концентраций поверхностно-активного вещества и солюбизирующего вещества в реактиве для анализа незрелых лейкоцитов до уровня более низкого, чем тот, который обычно применяется. Соответственно, с помощью реактива по настоящему изобретению становится возможным более четкое отличие базофилов от миелобластов, даже в образцах крови, содержащих высокое количество базофилов. Кроме того, снижение концентраций поверхностно-активного вещества и солюбилизирующего вещества в условиях низкого осмотического давления позволяет классифицировать зрелые лейкоциты, по меньшей мере, на три разновидности.
Одним аспектом настоящего изобретения является реактив для анализа незрелых лейкоцитов, включающий:
поверхностно-активное вещество, которое может повреждать клеточные мембраны эритроцитов и зрелых лейкоцитов,
солюбилизирующее вещество, которое вызывает сжатие поврежденных клеток крови и
краситель для окрашивания нуклеиновой кислоты,
причем реактив имеет осмотическое давление не ниже чем 10 мОсм/кг и ниже чем 150 мОсм/кг.
Другим аспектом настоящего изобретения является набор реактивов для анализа незрелых лейкоцитов, включающий:
первый реактив, который включает поверхностно-активное вещество, которое может повреждать клеточные мембраны эритроцитов и зрелых лейкоцитов, и солюбилизирующее вещество, которое вызывает сжатие поврежденных клеток крови, и который имеет осмотическое давление не ниже чем 10 мОсм/кг и ниже чем 150 мОсм/кг, и
второй реактив, который включает краситель для окрашивания нуклеиновой кислоты.
Дополнительным аспектом настоящего изобретения является способ классифицирования незрелых лейкоцитов, включающий стадии:
смешивания биологического образца, возможно содержащего незрелые лейкоциты, с реактивом для анализа незрелых лейкоцитов, включающим поверхностно-активное вещество, которое может повреждать клеточные мембраны эритроцитов и зрелых лейкоцитов, солюбилизирующее вещество, которое вызывает сжатие поврежденных клеток крови, и краситель для окрашивания нуклеиновой кислоты, и имеющим осмотическое давление не ниже чем 10 мОсм/кг и ниже чем 150 мОсм/кг, для окрашивания нуклеиновой кислоты зрелых лейкоцитов, и
измерения, по меньшей мере, одной величины светорассеяния и, по меньшей мере, одной величины флуоресценции незрелых лейкоцитов, подвергнутых обработке на предшествующей стадии, для классифицирования незрелых лейкоцитов на основе разницы интенсивностей светорассеяния и флуоресценции.
Осуществление изобретения
Реактив и набор реактивов для анализа незрелых лейкоцитов по настоящему изобретению позволяет более точно классифицировать и подсчитывать незрелые лейкоциты и зрелые лейкоциты по сравнению с традиционным реактивом даже при анализе биологических образцов от пациентов, страдающих специфическими заболеваниями, такими как множественная миелома, рак желчного протока, перитонит, диабет, гломерулонефрит, плеврит или другими подобными заболеваниями.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 схематически изображен пример проточного цитометра, который может быть использован для анализов незрелых лейкоцитов с применением реактива или набора с реактивом по настоящему изобретению.
На фиг.2 представлена скатерограмма, полученная в примере 1.
На фиг.3 представлена скатерограмма, полученная в примере 2.
На фиг.4 представлена скатерограмма, полученная в примере 3.
На фиг.5 представлена скатерограмма, полученная в примере 4.
На фиг.6 представлена скатерограмма, полученная в примере 5.
На фиг.7 представлена скатерограмма, полученная в примере 6.
На фиг.8 представлена скатерограмма, полученная в примере 7.
На фиг.9 представлена скатерограмма, полученная в примере 8.
На фиг.10 представлена скатерограмма, полученная в примере 9.
На фиг.11 представлена скатерограмма, полученная в примере 10.
ОПИСАНИЕ ПОЗИЦИОННЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
6 Пробозаборное устройство
21 Источник света
22 Коллиматорная линза
23 Проточная ячейка
24 Конденсорная линза
25 Пластина с отверстием
26 Детектор малоуглового светорассеяния
27 Конденсорная линза
28 Дихроическое зеркало
28' Фильтр
29 Детектор бокового светорассеяния
30 Пластина с отверстием
31 Детектор боковой флуоресценции
32, 33 и 34 Усилители
35 Анализирующий блок
Наилучший вариант осуществления изобретения
Реактив для анализа незрелых лейкоцитов по настоящему варианту осуществления (далее называемый "реактивом") позволяет классифицировать лейкоциты, содержащиеся в биологическом образце, на зрелые и незрелые лейкоциты и, соответственно, их подсчитывать. Он также позволяет классифицировать зрелые лейкоциты, по меньшей мере, на три вида, такие как лимфоциты, моноциты, гранулоциты, базофилы и другие подобные клетки и, соответственно, их подсчитать. Кроме того, настоящий реактив позволяет дополнительно классифицировать незрелые лейкоциты на незрелые гранулоциты и миелобласты, и, соответственно, точно их подсчитать.
Используемый здесь термин "незрелые лейкоциты" относится к незрелым лейкоцитам, которые существуют обычно в костном мозге и не встречаются в периферической крови здорового субъекта. Незрелые лейкоциты включают, например, миелобласты, промиелоциты, миелоциты, метамиелоциты и другие подобные клетки. В ряде случаев промиелоциты, миелоциты и метамиелоциты в совокупности называют "незрелыми гранулоцитами". Миелобласты включают лейкоцитарные кроветворные клетки-предшественники, такие как стволовые клетки миелоидного типа (CFU-GEMN); колониеобразующие единицы нейтрофилов-макрофагов (CFU-GM); колониеобразующие единицы эозинофилов (CFU-EOS) и другие подобные клетки.
Биологический образец, подвергаемый анализу с помощью реактива по настоящему варианту осуществления, конкретно не ограничивается, при условии, что он содержит лейкоциты, и включает, например, кровь, мочу, пунктат костного мозга, образец, взятый при аферезе, и другие биологические образцы.
Реактив настоящего варианта осуществления включает поверхностно-активное вещество, которое может повреждать клеточные мембраны эритроцитов и зрелых лейкоцитов, солюбилизирующее вещество, которое вызывает сжатие поврежденных клеток крови, и краситель для окрашивания нуклеиновой кислоты, и имеет осмотическое давление не ниже чем 10 мОсм/кг и ниже чем 150 мОсм/кг.
При смешивании биологического образца и реактива в результате действия поверхностно-активного вещества и солюбилизирующего вещества происходит повреждение клеточных мембран клеток крови, содержащихся в образце. Как правило, поверхностно-активное вещество повреждает клеточные мембраны эритроцитов и зрелых лейкоцитов, в то время как клеточные мембраны незрелых лейкоцитов являются устойчивыми к повреждению. Поврежденные клетки крови, такие как эритроциты и зрелые лейкоциты, сжимаются под действием солюбилизирующего вещества. С другой стороны, так как клеточные мембраны незрелых лейкоцитов повредить трудно, то эти клетки меньше сжимаются при воздействии солюбилизирующего вещества, чем эритроциты и зрелые лейкоциты.
Среди поврежденных клеток крови ядра лейкоцитов при воздействии красителя для окрашивания нуклеиновой кислоты, как правило, окрашиваются интенсивно. А неповрежденные незрелые лейкоциты окрасить трудно. Кроме того, так как эритроциты не имеют ядер, их трудно окрасить упомянутым выше красителем для окрашивания нуклеиновой кислоты. Вследствие этого могут быть различены, соответственно, незрелые лейкоциты, зрелые лейкоциты и эритроциты.
Осмотическое давление реактива по настоящему варианту осуществления составляет не ниже чем 10 мОсм/кг и ниже чем 150 мОсм/кг, предпочтительно - от 10 до 100 мОсм/кг, и более предпочтительно - от 10 до 60 мОсм/кг. Такое осмотическое давление может быть получено путем смешивания описанных далее компонентов в описанном далее количестве или путем соответствующей корректировки концентрации буферного вещества. Однако возможна также корректировка давления, если в этом есть необходимость, путем добавления сахаридов, аминокислот, хлорида натрия и других подобных веществ.
Среди сахаридов могут быть упомянуты, но этим не ограничиваясь, моносахариды, такие как глюкоза, фруктоза и другие подобные моносахариды; полисахариды, такие как арабиноза и другие подобные полисахариды; и сахарные спирты, такие как ксилит, сорбит, маннит, рибит и другие подобные спирты.
Например, при применении в реактиве ксилита его можно использовать в количестве от 0 до 10 г/л, более предпочтительно - от 4 до 8 г/л.
Аминокислоты могут включать валин, пролин, глицин, аланин и другие подобные аминокислоты. Предпочтительно использовать любой из двух или оба глицин и аланин.
Например, при применении в реактиве глицина его можно использовать в количестве от 0 до 10 г/л, более предпочтительно - от 2 до 6 г/л.
Предпочтительно, чтобы поверхностно-активным веществом, которое может вызывать повреждение клеточных мембран эритроцитов и зрелых лейкоцитов, являлось неионное поверхностно-активное вещество, и более предпочтительно - полиоксиэтиленовое неионное поверхностно-активное вещество. Более предпочтительно, чтобы полиоксиэтиленовым неионным поверхностно-активным веществом являлось полиоксиэтиленовое неионное поверхностно-активное вещество, имеющее следующую формулу (I):
(где R1 представляет C9-25 алкильную, алкенильную или алкинильную группу; R2 представляет -O-, -COO- или
и n является целым числом от 10 до 40).
Поверхностно-активное вещество, представленное приведенной выше формулой (I), может включать полиоксиэтилен(15)олеиловый эфир, полиоксиэтилен(20)олеиловый эфир, полиоксиэтилен(20)стеариловый эфир, полиоксиэтилен(15)цетиловый эфир, полиоксиэтилен(20)цетиловый эфир и другие подобные вещества. Поверхностно-активное вещество может быть одного или более видов.
Концентрация поверхностно-активного вещества в реактиве может быть соответствующим образом выбрана в зависимости от типа поверхностно-активного вещества. Когда поверхностно-активным веществом является полиоксиэтиленолеиловый эфир, предпочтительно, чтобы его концентрация в реактиве составляла от 500 до 15000 ppm (м.д.), более предпочтительно - от 750 до 10000 м.д., и еще более предпочтительно - от 1000 до 2500 м.д.
В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения концентрацию поверхностно-активного вещества устанавливают в интервале относительно низких концентраций, таких как, например, от 1000 до 10000 м.д. При таком интервале концентраций предотвращается повреждение клеточных мембран базофилов (одной из форм зрелых лейкоцитов) в отличие от использования реактива, имеющего относительно высокую концентрацию поверхностно-активного вещества, в результате чего может быть предотвращено повреждение базофилов и высвобождение клеточных компонентов базофилов из клеток. Соответственно, базофилы, так же как и другие зрелые лейкоциты, могут легко окрашиваться под действием красителя для окрашивания нуклеиновой кислоты. С другой стороны, как было указано выше, клеточные мембраны миелобластов (одной из форм незрелых лейкоцитов) не повреждаются, в силу чего они с трудом окрашиваются. Вследствие этого базофилы и миелобласты более эффективно различаются.
При применении нескольких поверхностно-активных веществ может быть соответствующим образом выбрано их соотношение в смеси, исходя из гидроксильного числа поверхностно-активных веществ. Например, при использовании полиоксиэтилен(15)олеилового эфира, имеющего гидроксильное число 64,8, и полиоксиэтилен(20)олеилового эфира, имеющего гидроксильное число 52,4, предпочтительно, чтобы соотношение этих компонентов в смеси составляло 1:9.
Указанное выше солюбилизирующее вещество может включать, например, производные саркозина, производные холевой кислоты, метилглюканамиды и другие подобные вещества. Могут быть использованы одно или более выбранных из них.
Производные саркозина включают производные саркозина, имеющие следующую структурную формулу, и их соли. Конкретно можно упомянуть N-лауроилсаркозинат натрия, лауроилметил β-аланин натрия, лауроилсаркозин и другие подобные вещества. Производные холевой кислоты включают производные холевой кислоты, имеющие следующую структурную формулу, и их соли. Конкретно можно упомянуть CHAPS (3-[(3-холамидопропил)диметиламмоний]-1-пропансульфонат), CHAPSO ([(3-холамидопропил)диметиламмоний]-2-гидрокси-1-пропансульфонат) и другие подобные вещества. Метилглюканамиды включают MEGA8 (октаноил-N-метилглюкамид), MEGA9 (нонаноил-N-метилглюкамид), MEGA10 (деканоил-N-метилглюкамид) и другие подобные вещества.
Производные саркозина имеют следующую структурную формулу:
где R1 является C10-22 алкильной группой; и n составляет от 1 до 5.
Производные холевой кислоты имеют следующую структурную формулу:
где R1 является атомом водорода или гидрокси группой.
Метилглюканамиды имеют следующую структурную формулу:
где n составляет от 5 до 7.
Концентрация солюбилизирующего вещества в реактиве может быть соответствующим образом выбрана, исходя из типа используемого солюбилизирующего вещества. При использовании производного саркозина в качестве солюбилизирующего вещества предпочтительно, чтобы концентрация солюбилизирующего вещества в реактиве составляла от 50 до 3000 м.д., более предпочтительно - от 100 до 400 м.д. При использовании производного холевой кислоты предпочтительно, чтобы его концентрация составляла от 50 до 10000 м.д., более предпочтительно - от 50 до 1300 м.д. При использовании метилглюканамида предпочтительно, чтобы его концентрация составляла от 500 до 8000 м.д., более предпочтительно - от 500 до 1100 м.д.
Кроме того, в качестве солюбилизирующего вещества могут быть использованы н-октил-β-глюкозид, монокапрат сахарозы, N-формилметиллейцилаланин и другие подобные вещества. При использовании этих веществ предпочтительно, чтобы их концентрация в реактиве составляла от 5 до 50000 м.д., более предпочтительно - от 5 до 6600 м.д. Может быть использовано одно солюбилизирующее вещество само по себе, или несколько солюбилизирующих веществ в комбинации.
В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, вследствие относительно низкой концентрации солюбилизирующего вещества, подавляется повреждение клеточных мембран базофилов (одной из форм зрелых лейкоцитов) в отличие от использования реактива, имеющего относительно высокую концентрацию солюбилизирующего вещества, в результате чего может быть предотвращено повреждение базофилов и высвобождение клеточных компонентов базофилов из клеток. Соответственно, базофилы, так же как и другие зрелые лейкоциты, могут легко окрашиваться под действием красителя для окрашивания нуклеиновой кислоты. С другой стороны, как было указано выше, клеточные мембраны миелобластов (одной из форм незрелых лейкоцитов) не повреждаются, в силу чего они плохо окрашиваются. Вследствие этого базофилы и миелобласты более эффективно различаются.
Приведенный выше краситель для окрашивания нуклеиновой кислоты конкретно не ограничивается при условии, что он может окрашивать нуклеиновую кислоту, и предпочтительно является флуоресцентным красителем. При использовании такого красителя эритроциты, не содержащие нуклеиновую кислоту, почти не окрашиваются, в то время как лейкоциты, содержащие нуклеиновую кислоту, интенсивно окрашиваются. На основе разницы в интенсивности окрашивания эритроциты и лейкоциты могут быть различимы. Кроме того, зрелые лейкоциты, у которых клеточные мембраны повреждены и в которые может проникать краситель, окрашиваются красителем интенсивно, в то время как неповрежденные незрелые лейкоциты обычно почти не окрашиваются. На основе разницы в интенсивности окрашивания среди лейкоцитов могут быть отличены зрелые лейкоциты и незрелые лейкоциты.
Краситель для окрашивания нуклеиновой кислоты выбирают соответствующим образом в зависимости от характеристики света, используемого для анализа. Например, предпочтительно, чтобы использовались красители, имеющие следующие структурные формулы.
(1) Краситель, имеющий следующую формулу (II):
где R1 и R2 являются низшей алкильной группой; n равно 1 или 2; X- является анионом; и Z является атомом серы, атомом кислорода, или атомом углерода, который замещен низшей алкильной группой.
Низшая алкильная группа в R1 и R2 в приведенной выше формуле (II) относится к C1-6 линейной или разветвленной алкильной группе. Она включает, например, метильную, этильную, пропильную, бутильную, изобутильную, втор-бутильную, трет-бутильную, пентильную и гексильную группы, среди которых предпочтительной является метильная группа.
Низшая алкильная группа в Z включает такие же группы, как приведенные выше. Предпочтительно Z представляет собой атом серы.
Анион X- включает ионы галогенов (фторидный, хлоридный, бромидный или йодидный ион), боргалогенидные ионы (BF4 -, BCl4 -, BBr4 -, и так далее), ионы фосфорных соединений, ионы галоген-кислородных кислот, ионы фторсерных кислот, метилсульфатные ионы, и ионы тетрафенилборных соединений, которые имеют галоген или галогеналкильную группу в качестве заместителя на ароматических кольцах. Среди них предпочтительным является йодидный ион.
Следующий краситель, имеющий приведенную выше формулу (II), подходит в качестве красителя для окрашивания нуклеиновой кислоты.
Краситель A:
(2) Краситель, имеющий следующую формулу (III):
где R1 и R2 являются низшей алкильной группой; n равно 1 или 2; и X- является анионом.
В приведенной выше формуле (III) низшая алкильная группа в R1 и R2 и в анионе X- определяется так же, как было описано для приведенной выше формулы (II).
Следующий краситель, имеющий приведенную выше формулу (III), подходит в качестве красителя для окрашивания нуклеиновой кислоты.
Краситель B:
(3) Краситель, имеющий следующую формулу (IV):
где R1 является атомом водорода или низшей алкильной группой; R2 и R3 являются атомом водорода, низшей алкильной группой или низшей алкокси группой; R4 является атомом водорода, ацильной группой или низшей алкильной группой; R5 является атомом водорода или необязательно замещенной низшей алкильной группой; Z является атомом серы, атомом кислорода или атомом углерода, который замещен низшей алкильной группой; n равно 1 или 2; и X- является анионом.
В приведенной выше формуле (IV) низшая алкильная группа в R1 определяется так же, как было описано для приведенной выше формулы (II).
Низшая алкильная группа в R2 и R3 определяется так же, как было упомянуто выше. Низшая алкокси группа означает C1-6 алкокси группу и включает метокси, этокси и пропокси группы, среди которых метокси и этокси группы являются предпочтительными. Предпочтительно R2 и R3 являются атомом водорода.
В приведенной выше формуле (IV) предпочтительно, чтобы ацильной группой в R4 являлась ацильная группа, полученная из алифатической карбоновой кислоты, и включала, например, ацетильную, пропионильную и другие подобные группы, среди которых ацетильная группа является предпочтительной. Низшие алкильные группы определены выше.
Низшая алкильная группа в R5 определена выше. Необязательно замещенная низшая алкильная группа обозначает низшую алкильную группу, которая может быть замещена одной-тремя гидрокси группами, атомами галогена (фтора, хлора, брома или йода) и другими подобными группами, и предпочтительно, чтобы она являлась метильной или этильной группой, замещенной одной гидрокси группой.
Низшая алкильная группа в Z определена выше. Предпочтительно Z является атомом серы.
Предпочтительно анион X- является бромидным ионом или BF4 -.
Следующие красители, имеющие следующую формулу (IV), подходят в качестве красителя для окрашивания нуклеиновой кислоты.
Краситель C:
(4) Краситель, имеющий следующую формулу (V):
где X1 и X2 являются независимо Cl или I.
(5) Краситель, имеющий следующую формулу (VI) (NK-3975):
(6) Краситель, имеющий следующую формулу (VII) (NK-1570):
(7) Краситель, имеющий следующую формулу (VIII) (NK-1049):
(8) Краситель, имеющий следующую формулу (IX) (NK-98):
(9) Краситель, имеющий следующую формулу (X) (NK-141):
(10) Йодид пропидия или бромид этидия.
(11) Гетеродимер этидий-акридин, диазид этидия, гомодимер-1 этидия, гомодимер-2 этидия, моноазид этидия, триметиленбис[[3-[[4-[[(3-метилбензотиазол-3-ий)-2-ил]метилен]-1,4-дигидрохинолин]-1-ил]пропил]диметиламиний]тетрайодид (TOTO-1), 4-[(3-метилбензотиазол-2(3H)-илиден)метил]-1-[3-(триметиламино)пропил]хинолиний дийодид (TO-PRO-1), N,N,N',N'-тетраметил-N,N'-бис[3-[4-[3-[(3-метилбензотиазол-3-ий)-2-ил]-2-пропенилиден]-1,4-дигидрохинолин-1-ил]пропил]1,3-пропандиаминий тетрайодид (TOTO-3) или 2-[3-[[1-[3-(триметиламино)пропил]-1,4-дигидрохинолин]-4-илиден]-1-пропенил]-3-метилбензотиазол-3-ий дийодид (TO-PRO-3).
Концентрация приведенного выше красителя составляет, предпочтительно, от 0,01 до 500 м.д., и более предпочтительно - от 0,1 до 200 м.д. в реактиве. Приведенный выше краситель может быть использован сам по себе или два или более красителей могут быть объединены.
Величина pH реактива согласно настоящему варианту осуществления составляет, предпочтительно, от 5,0 до 9,0, более предпочтительно - от 6,5 до 7,5, и еще более предпочтительно - от 6,8 до 7,3. Величина pH реактива может быть скорректирована при помощи буферного вещества. Используемым буферным веществом может являться, например, буфер Гуда, такой как HEPES, MOPS (3-морфолинпропансульфоновая кислота), MOPSO (2-гидрокси-3-морфолинпропансульфоновая кислота) или BES (2-[бис(2-гидроксиэтил)амино]этансульфоновая кислота), забуференный фосфатом физиологический раствор и другие подобные буферы. Может также быть использовано вещество, корректирующее pH, такое как гидроксид натрия.
Реактив по настоящему варианту осуществления может быть получен путем растворения приведенных выше поверхностно-активного вещества, солюбилизирующего вещества, красителя для окрашивания нуклеиновой кислоты и необязательного компонента (компонентов) в соответствующей среде до описанных выше концентраций. Соответствующая среда конкретно не ограничивается при условии, что она способна растворять приведенные выше компоненты, и она включает воду, спирт, этиленгликоль, диметилсульфоксид (DMSO), их смесь и другие подобные растворители.
Приведенные выше поверхностно-активное вещество, солюбилизирующее вещество и краситель для окрашивания нуклеиновой кислоты могут быть использованы в виде одного реактива, который смешивают с биологическим образцом для анализа незрелых лейкоцитов. Альтернативно, для анализа незрелых лейкоцитов может быть использован набор реактивов, содержащий первый реактив, включающий поверхностно-активное вещество и солюбилизирующее вещество, и второй реактив, включающий краситель для окрашивания нуклеиновой кислоты.
Поэтому настоящее изобретение также предлагает набор реактивов для анализа незрелых лейкоцитов, включающий первый реактив, который включает поверхностно-активное вещество, которое способно повреждать клеточные мембраны эритроцитов и зрелых лейкоцитов, и солюбилизирующее вещество, которое способно вызывать сжатие поврежденных клеток крови, и который имеет осмотическое давление не ниже чем 10 мОсм/кг и ниже чем 150 мОсм/кг; и второй реактив, который включает краситель для окрашивания нуклеиновой кислоты.
Концентрации поверхностно-активного вещества и солюбилизирующего вещества в приведенном выше первом реактиве могут быть такими, чтобы при смешивании первого реактива со вторым реактивом могли быть получены концентрации, описанные выше для реактива для анализа незрелых лейкоцитов. При необходимости, осмотическое давление первого реактива может быть скорректировано в требуемом интервале путем растворения поверхностно-активного вещества и солюбилизирующего вещества в соответствующей описанной выше среде, и путем соответствующей корректировки количества буферного вещества. Для корректировки могут быть использованы приведенные выше сахариды, аминокислоты и другие подобные вещества.
Концентрация красителя для окрашивания нуклеиновой кислоты во втором реактиве должна быть такой, чтобы при смешивании первого реактива со вторым реактивом могла быть получена концентрация красителя, описанная выше для реактива для анализа незрелых лейкоцитов. Предпочтительно чтобы второй реактив являлся реактивом, в котором краситель для окрашивания нуклеиновой кислоты растворяют в органическом растворителе, таком как этиленгликоль, так как в этом случае повышается стабильность красителя при хранении.
Реактив и набор реактивов могут быть использованы для анализа незрелых лейкоцитов путем приготовления образца для измерения путем смешивания реактива (реактивов) с биологическим образцом и проведения анализа измеряемого образца в проточном цитометре. Соотношение в смеси (по объему) биологического образца и реактива или суммы первого и второго реактивов в наборе реактивов составляет, предпочтительно, от 1:10 до 1:1000.
В наборе реактивов соотношение в смеси (по объему) первого и второго реактивов составляет, предпочтительно, от 1000:1 до 10:1.
При использовании набора реактивов порядок добавления при смешивании соответствующего реактива в наборе реактивов и биологического образца конкретно не ограничивается. Предпочтительно чтобы смешивали первый реактив и второй реактив, а затем к ним добавляли биологический образец.
Для смешивания реактива или реактивов в наборе реактивов с биологическим образцом могут быть выбраны соответствующие условия в зависимости от используемого реактива (реактивов). Например, температура и время реакции могут быть выбраны от 20 до 40°C и от 3 до 30 секунд, соответственно. Когда температура реакции является высокой, время реакции может быть меньшим; когда температура реакции является низкой, время реакции может быть большим.
При использовании для анализа проточного цитометра свет воздействует на клетки крови в измеряемом образце, проходящем через проточную ячейку, с получением такой оптической информации, как светорассеяние, флуоресценция и другой подобной оптической информации. На основе этой информации могут быть определены типы и число клеток крови.
Конкретно, описанный выше анализ может быть осуществлен при помощи проточного цитометра, показанного на фиг.1. Далее, в качестве примера вариантов настоящего осуществления описывают определение миелобластов.
Образец для измерения, выходящий из пробозаборного устройства 6, проходит через входную часть проточной ячейки 23. Клетки крови образца проходят через входную часть, выстроившись в линию. Свет, излучаемый источником 21 света, направляют через коллиматорную линзу 22 на клетки крови, проходящие через проточную ячейку 23. В результате воздействия света на клетки крови возникает боковое светорассеяние, боковая флуоресценция и малоугловое светорассеяние. Боковое светорассеяние направляют в детектор бокового светорассеяния (фотоэлектронный умножитель) 29 через конденсорную линзу 27 и дихроическое зеркало 28. Боковую флуоресценцию направляют в детектор боковой флуоресценции (фотоэлектронный умножитель) 31 через конденсорную линзу 27 и дихроическое зеркало 28, фильтр 28' и пластину 30 с отверстием. Малоугловое светорассеяние направляют в детектор малоуглового светорассеяния (фотодиод) 26 через конденсорную линзу 24 и пластину 25 с отверстием.
Сигнал малоуглового светорассеяния, сигнал бокового светорассеяния и сигнал боковой флуоресценции, генерируемые детектором 26 малоуглового светорассеяния, детектором 29 бокового светорассеяния и детектором 31 боковой флуоресценции, соответственно, усиливаются с помощью усилителей 32, 33, и 34, соответственно, и вводятся в анализирующий блок 35.
В анализирующем блоке 35 из вводимого сигнала малоуглового светорассеяния, сигнала бокового светорассеяния и сигнала боковой флуоресценции вычисляются интенсивности малоуглового светорассеяния, бокового светорассеяния и боковой флуоресценции, соответственно. Анализирующий блок 35 генерирует первую двухмерную карту распределения, имеющую две оси интенсивности малоуглового светорассеяния и интенсивности флуоресценции, и идентифицирует область, где появляются все лейкоциты образца (область суммы лейкоцитов) на двухмерной карте распределения. Кроме того, анализирующий блок генерирует вторую двухмерную карту распределения, имеющую две оси интенсивности бокового светорассеяния и интенсивности флуоресценции клеток, появляющихся в области суммы лейкоцитов. На этой двухмерной карте распределения определяют область появления зрелых лейкоцитов (область зрелых лейкоцитов), область появления лимфоцитов (область лимфоцитов), область появления моноцитов (область моноцитов), и область появления гранулоцитов (область гранулоцитов). Кроме того, определяют область появления миелобластов (область миелобластов 1) и область появления незрелых гранулоцитов (область незрелых гранулоцитов).
Затем генерируют третью двухмерную карту распределения, имеющую две оси интенсивности бокового светорассеяния и интенсивности малоуглового светорассеяния, и определяют на этой двухмерной карте распределения область появления миелобластов (область миелобластов 2). Число миелобластов, содержавшихся в образце, вычисляют как количество клеток, появляющихся в области миелобластов 1 и области миелобластов 2, и число незрелых гранулоцитов, содержавшихся в образце, вычисляют как количество клеток, появляющихся в области незрелых гранулоцитов. Кстати, так как миелобласты имеют большой размер и имеют одно ядро, они генерируют высокую интенсивность малоуглового светорассеяния и низкую интенсивность бокового светорассеяния. Кроме того, они генерируют низкую интенсивность флуоресценции, так как они, как было описано выше, почти не окрашиваются. Ввиду того что незрелые гранулоциты имеют большой размер, и их ядра являются сегментированными, они генерируют высокую интенсивность малоуглового светорассеяния и интенсивность бокового светорассеяния. Кроме того, они генерируют низкую интенсивность флуоресценции, так как они почти не окрашиваются.
Кроме того, настоящее изобретение предлагает способ анализа незрелых лейкоцитов, включающий смешивание настоящего реактива для анализа или реактивов в наборе реактивов для анализа с биологическим образцом.
В предпочтительном варианте осуществления способа настоящего изобретения концентрация поверхностно-активного вещества в реактиве для анализа или в смешанном реактиве из первого и второго реактивов в наборе реактивов для анализа составляет, предпочтительно, от 500 до 15000 м.д., более предпочтительно - от 750 до 10000 м.д., и еще более предпочтительно - от 1000 до 2500 м.д.
В других предпочтительных вариантах осуществления способа настоящего изобретения, при использовании производного саркозина или его соли в качестве солюбилизирующего вещества, концентрация солюбилизирующего вещества в реактиве или в смешанном реактиве из первого и второго реактивов в наборе реактивов составляет от 100 до 400 м.д.; при использовании производного холевой кислоты она составляет от 50 до 1300 м.д.; и при использовании метилглюканамида она составляет 500 до 1100 м.д.
Согласно этим предпочтительным вариантам осуществления в биологическом образце могут быть более четко отличены базофилы и миелобласты.
Примеры
Настоящее изобретение будет разъяснено более подробно с помощью следующих примеров. Однако настоящее изобретение не ограничивается следующими примерами.
(Пример 1)
Готовили первый реактив и второй реактив, имеющие следующий состав.
<Первый реактив>
Смешивали приведенные выше компоненты, и корректировали значение pH до 7,0 с помощью NaOH. Осмотическое давление и удельная электропроводность первого реактива составляли 20 мОсм/кг и 0,78 мСм/см, соответственно.
<Второй реактив>
Растворяли краситель в этиленгликоле с получением второго реактива. В качестве красителя для окрашивания нуклеиновой кислоты использовали описанный выше краситель C.
Смешивали первый реактив (980 мкл), 20 мкл второго реактива и 20 мкл образца крови, взятого у здорового донора (содержание базофилов составляло 2,1%, миелобласты отсутствовали), и осуществляли их взаимодействие при 35°C в течение 19 секунд с получением измеряемого образца. Проводили анализ полученного для измерения образца на проточном цитометре, показанном на фиг.1, и измеряли интенсивность бокового светорассеяния, интенсивность малоуглового светорассеяния и интенсивность флуоресценции. В качестве источника света использовали красный полупроводниковый лазер.
На основе полученной интенсивности малоуглового светорассеяния и интенсивности флуоресценции генерировали первую двухмерную карту распределения (скатерограмму), имеющую две оси интенсивности малоуглового светорассеяния и интенсивности флуоресценции. Согласно этой первой двухмерной карте распределения была определена область суммы лейкоцитов. Количество клеток, появившееся в идентифицированной области суммы лейкоцитов, подсчитывали как сумму лейкоцитов, содержавшихся в образце. На фиг.2(1) показана полученная скатерограмма. Для клеток, появившихся в идентифицированной области суммы лейкоцитов, генерировали вторую двухмерную карту распределения (скатерограмму), имеющую две оси интенсивности бокового светорассеяния и интенсивности флуоресценции, и третью двухмерную карту распределения (скатерограмму), имеющую две оси интенсивности бокового светорассеяния и интенсивности малоуглового светорассеяния. На второй и третьей двухмерных картах распределения определяли области миелобластов 1 и 2. На фиг.2(2) и (3) показаны полученные скатерограммы. Количество клеток, появляющихся в областях миелобластов 1 и 2, подсчитывали как число миелобластов, содержавшихся в образце. На фиг.2(4) показана полученная скатерограмма.
Как видно из фиг.2(1)-(4), на скатерограмме в области, где появляется потенциальный сигнал миелобластов, сигнал не обнаруживается, так как миелобласты не содержатся в образце крови здорового донора. Отсутствует сигнал для лизированных эритроцитов. Кроме того, в области миелобластов не появляются базофилы, так как они окрашены так же интенсивно, как и другие зрелые лейкоциты.
Вычисляли отношение миелобластов к сумме лейкоцитов (отношение миелобластов = количество миелобластов/сумма лейкоцитов × 100), которое составляло 0%. Визуально подтвержденное отношение миелобластов также составляло 0%.
(Пример 2)
Готовили первый реактив, имеющий следующий состав.
<Первый реактив>
Смешивали приведенные выше компоненты, и корректировали значение pH до 7,25 с помощью NaOH. Осмотическое давление и удельная электропроводность первого реактива составляли 20 мОсм/кг и 0,78 мСм/см, соответственно.
Образец крови от здорового донора анализировали так же, как описано в примере 1, за исключением того, что приведенный выше первый реактив использовали вместо первого реактива, применявшегося в примере 1.
На фиг.3(1)-(4) показаны полученные скатерограммы.
Как видно из фиг.3(1)-(4), на скатерограмме в области, где появляется потенциальный сигнал миелобластов, сигнал не обнаруживается, так как миелобласты не содержатся в образце крови здорового донора. Отсутствует сигнал для лизированных эритроцитов. Кроме того, в области миелобластов не появляются базофилы, так как они окрашены так же интенсивно, как и другие зрелые лейкоциты.
Отношение миелобластов к сумме лейкоцитов (отношение миелобластов = количество миелобластов/сумма лейкоцитов × 100) составляло 0%. Визуально подтвержденное отношение миелобластов также составляло 0%.
(Пример 3)
Анализ проводили так же, как в примере 1, за исключением того, что вместо образца крови от здорового донора использовали образец крови, содержащий миелобласты, от пациента с острым миелоидным лейкозом, и получали интенсивность бокового светорассеяния, интенсивность малоуглового светорассеяния и интенсивность флуоресценции.
На фиг.4(1)-(4) показаны полученные скатерограммы.
На основе скатерограмм на фиг.4(1)-(4) отношение миелобластов к сумме лейкоцитов составляло 1,2%. Визуально подтвержденное отношение миелобластов того же самого образца крови составляло 4,0%.
(Примеры 4-9)
Готовили первый и второй реактивы, имеющие следующий состав.
Смешивали первый реактив (980 мкл), 20 мкл второго реактива и 20 мкл любого из следующих образцов крови, и осуществляли их взаимодействие при 35°C в течение (17,5 секунд для примеров 4 и 11) с получением измеряемых образцов. Скатерограммы были получены, как описано в примерах 1-3.
В качестве образца крови использовали образец крови от пациента, страдающего лейкозом, содержащий миелобласты (далее обозначаемый как "миелобластный образец"), или образец крови от пациента, страдающего множественной миеломой, не содержащий миелобластов (эритроциты не были лизированы соответствующим образом) (далее обозначаемый как "образец с недостаточным гемолизом").
На фиг.5-11 показаны полученные скатерограммы. На соответствующих чертежах на фиг.5-11 (A) показывает скатерограмму при использовании в качестве образца крови миелобластного образца, и (B) показывает скатерограмму при использовании в качестве образца крови образец с недостаточным гемолизом. Как правило, миелобласты обнаруживаются на скатерограммах в "BL" области.
На осях Х и Y скатерограмм на фиг.5-11 отложены интенсивность бокового светорассеяния и интенсивность флуоресценции, соответственно. "Ly", "Mo", "Gran" и "IG" представляют сегменты, в которых появляются лимфоциты, моноциты, гранулоциты и незрелые гранулоциты, соответственно.
На основе этих скатерограмм были вычислены отношения миелобластов к сумме лейкоцитов и описаны как "BL область" на фиг.6-11.
Результаты на фиг.5-11 показывают, что при проведении анализа с использованием реактива (реактивов) по настоящему изобретению в миелобластном образце обнаруживали миелобласты, и в образце с недостаточным гемолизом отношение миелобластов было очень низким. Кроме того, при анализе образца с недостаточным гемолизом почти не обнаруживалась эритроцитарная тень, которая обнаруживается при использовании традиционного реактива. Поэтому показано, что в результате использования настоящего реактива (реактивов) могут быть получены точные результаты анализа, так как исключается ошибочное обнаружение миелобластов, даже при анализе образцов с недостаточным гемолизом. Более того, в случае обнаружения эритроцитарных теней на скатерограмме, область миелобластов и область эритроцитарной тени не перекрываются (данные не показаны). А именно показано, что путем использования настоящего реактива (реактивов) миелобласты могут быть четко различены от эритроцитарных теней, и незрелые лейкоциты могут точно быть измерены даже в таких образцах крови, как образцы крови от пациентов, страдающих множественной миеломой, так как на скатерограммах эритроцитарные тени не появляются в области миелобластов.
Настоящая заявка испрашивает приоритеты патентных документов Japanese Patent Application №№ 2007-166609 и 2008-84137, выданных 25 июня 2007 года и 27 марта 2008 года, соответственно, и их формулы изобретения, описания, чертежи и рефераты приводятся здесь путем ссылки на них.
Изобретение относится к области медицины, в частности к анализу крови, и касается реактива для анализа незрелых лейкоцитов в периферической крови, включающего: полиоксиэтиленовое неионное поверхностно-активное вещество, солюбилизирующее вещество, выбранное из группы, состоящей из производного саркозина, производного холевой кислоты и метилглюканамида, и краситель для окрашивания нуклеиновой кислоты, причем реактив имеет осмотическое давление не ниже чем 10 мОсм/кг и ниже чем 150 мОсм/кг. Предложенный реактив позволяет более точно классифицировать и подсчитывать незрелые лейкоциты. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 11 ил., 1 табл.
1. Реактив для анализа незрелых лейкоцитов в периферической крови, включающий:
полиоксиэтиленовое неионное поверхностно-активное вещество,
солюбилизирующее вещество, выбранное из группы, состоящей из производного саркозина, производного холевой кислоты и метилглюканамида, и
краситель для окрашивания нуклеиновой кислоты,
причем реактив имеет осмотическое давление не ниже чем 10 мОсм/кг и ниже чем 150 мОсм/кг.
2. Реактив по п.1, где концентрация поверхностно-активного вещества в реактиве составляет от 500 до 15000 м.д.
3. Реактив по п.1, где полиоксиэтиленовое неионное поверхностно-активное вещество имеет следующую формулу (I):
где R1 представляет С9-25 алкильную, алкенильную или алкинильную группу; R2 представляет -О-, -СОО- или
и n является целым числом от 10 до 40.
4. Реактив по п.1, где полиоксиэтиленовым неионным поверхностно-активным веществом является полиоксиэтиленолеиловый эфир.
5. Реактив по п.4, где полиоксиэтиленолеиловый эфир имеет формулу (I), в которой n составляет от 15 до 20.
6. Реактив по п.1, где концентрация солюбилизирующего вещества в реактиве составляет от 100 до 400 м.д., когда солюбилизирующим веществом является производное саркозина; от 50 до 1300 м.д., когда солюбилизирующим веществом является производное холевой кислоты; и от 500 до 1100 м.д., когда солюбилизирующим веществом является метилглюканамид.
7. Реактив по п.1, где красителем для окрашивания нуклеиновой кислоты является, по меньшей мере, один краситель, выбранный из группы, состоящей из:
(1) красителя, имеющего следующую формулу (II):
где R1 и R2 являются низшей алкильной группой; n равно 1 или 2; X- является анионом; и Z является атомом серы, атомом кислорода или атомом углерода, который замещен низшей алкильной группой;
(2) красителя, имеющего следующую формулу (III):
где R1 и R2 являются низшей алкильной группой; n равно 1 или 2; X является анионом;
(3) красителя, имеющего следующую формулу (IV):
где R1 является атомом водорода или низшей алкильной группой; R2 и R3 являются атомом водорода, низшей алкильной группой или низшей алкокси группой; R4 является атомом водорода, ацильной группой или низшей алкильной группой; R5 является атомом водорода или необязательно замещенной низшей алкильной группой; Z является атомом серы, атомом кислорода или атомом углерода, который замещен низшей алкильной группой; n равно 1 или 2; и X- является анионом;
(4) красителя, имеющего следующую формулу (V):
где X1 и Х2 являются независимо Сl или I;
(5) красителя, имеющего следующую формулу (VI):
(6) красителя, имеющего следующую формулу (VII):
(7) красителя, имеющего следующую формулу (VIII):
(8) красителя, имеющего следующую формулу (IX):
(9) красителя, имеющего следующую формулу (X):
(10) йодида пропидия или бромида этидия;
(11) гетеродимера этидий-акридин, диазида этидия, гомодимера-1 этидия, гомодимера-2 этидия, моноазида этидия, триметиленбис[[3-[[4-[[(3-метилбензотиазол-3-ий)-2-ил]метилен]-1,4-дигидрохинолин]-1-ил]пропил]диметиламиний]тетрайодида (ТОТО-1), 4-[(3-метилбензотиазол-2(3Н)-илиден)метил]-1-[3-(триметиламино)пропил]хинолиний дийодида (TO-PRO-1), N,N,N',N'-тетраметил-N,N'-бис[3-[4-[3-[(3-метилбензотиазол-3-ий)-2-ил]-2-пропенилиден]-1,4-дигидрохинолин-1-ил]пропил]-1,3-пропандиаминий тетрайодида (ТОТО-3) или 2-[3-[[1-[3-(триметиламино)пропил]-1,4-дигидрохинолин]-4-илиден]-1-пропенил]-3-метил бензотиазол-3-ий дийодида (TO-PRO-3).
8. Реактив по п.1, который имеет рН от 5,0 до 9,0.
9. Набор реактивов для анализа незрелых лейкоцитов в периферической крови, включающий:
первый реактив, который включает полиоксиэтиленовое неионное поверхностно-активное вещество и солюбилизирующее вещество, выбранное из группы, состоящей из производного саркозина, производного холевой кислоты и метилглюканамида, и который имеет осмотическое давление не ниже чем 10 мОсм/кг и ниже чем 150 мОсм/кг, и
второй реактив, который включает краситель для окрашивания нуклеиновой кислоты.
10. Способ классифицирования лейкоцитов, включающий стадии:
смешивания периферической крови, возможно содержащей незрелые лейкоциты, с реактивом для анализа незрелых лейкоцитов, включающим полиоксиэтиленовое неионное поверхностно-активное вещество, солюбилизирующее вещество, выбранное из группы, состоящей из производного саркозина, производного холевой кислоты и метилглюканамида, и краситель для окрашивания нуклеиновой кислоты, и имеющим осмотическое давление не ниже чем 10 мОсм/кг и ниже чем 150 мОсм/кг, для окрашивания нуклеиновой кислоты зрелых лейкоцитов, и
измерения, по меньшей мере, одной величины светорассеяния и, по меньшей мере, одной величины флуоресценции незрелых лейкоцитов, подвергнутых обработке на предшествующей стадии, для классифицирования незрелых лейкоцитов на основе разницы интенсивностей светорассеяния и флуоресценции.
| US 2003219850 А1, 27.11.2003 | |||
| US 5389549 А, 14.02.1995 | |||
| Способ определения площади поверхности разрушения строительного материала | 1981 |
|
SU1004880A1 |
