Способ выделения компонентов гемагглютинина и нейраминидазы Советский патент 1978 года по МПК A61K35/76 

1 Изобретевие отиосится к обласгш мтфобяоЛОГЙН.

Известен способ выдадевня комповеятов геиагглнттина в веАрамняадазы путеы солюбнлрзацйя вируса грйвва различиях гатамнов дегергеетфм с последующем отделением содюбагазароватп) коитжептов от субвмрусгаа частиц очясткой or дето геет« {I).

Однако такой способ не обеспечивает сед 1НВНОГО солюбнлнзяртвапйя .1шж генаг ijtfOTHBHHOB н йейрамйнндаэы.

Целью изобретения является селехтнваое.солюбнлнзнр« анне компонентов.

Это достигается тем, что солюбалнзацвю осушествлйют катйовиын дегергевпгом общей формулы

К,® Из

КX®

/

Hf 1Ц

где RI, Rj, Ra. R - одинаковые нлв разлнчвые алкнльные нлм аркльные остатки.

нлн RI и Rj вместе с азотом образуют 5-6члеяный насыщенный гетероцяБл,

а Ra - алкил нлн арнл,

8ЛМ RI, Ra, Ra вместе с азото образуют 5-6членный й асыщеввый но азоту гетеррцнкл; X -аниой.,

Кроме того, соотношение белок : детергент :i:2 - 1:10.

ПреАпагаемыА способ может быть осуществлен использованием вируса гриппа тнпов А, AI, AI НЛП В млн смеси двух нлн больше нэ этих вирусов. Снецнфически используемый иламм висйт от желательного яммутггета в целевого иммуиогена.

Используемый в соответствин с изобретением штамм вируса целесообразно размножать (В1фастить) нз ктным способом, например. вупяв повЕГОрвоЗ прививки на И-дневжН эмбрионе (эмбриоинр аииого) куриного яйца н инкубации в течение соответствующего отрезка времени щш соответствукицей температуру, например в течение 2 дней нрн 37°С. Объединяют полученную аллантоидную жндкость, вирус концентрируют путем ультрафугования н последующего ресуспендироваиня в буферярованиом (например фосфатным буферным раствором) физиологическом растворе повареввой otxnH, или путем фуговавня на прогточшнзональной центрифуге с применением, например, градиента тростннкового сахара в буферироваа ном фосфатным буфером физиологическом ршггворе ш вареииой соли), с последующим сиик«нне 1ес А(фЖа1111я тростникового сахара ние 5% предпочтительно путем диализа против нзйовргяческрго раствора, циан путем хроматЬг{)|фня на сефадексе, млн разбавления и подвергают очистке. Концентрация исходного BHffyca йе имеет (сритического значения и может быть осуществлена в зависимости от задаш1ого количества иммуногеиа.

.Величину рН внруе1юго концентрата целесообразно, поддерживать а интервале от 6,5 де 8,5, при этом HC{iOAb3yiof, например, фосфатный буферный р.аствсф, ко1ГО| ый добавляют до внесения катнониого детергента, а концентрат можно ннактивировать добавкЫ, на пр111«ер«фчорм«1льдегкда. Затем к вирусному концентрату приливают катнонный (пред110чт1йНел1 1Ю в виде водного pacriifopa). Необж д11Мо«. количество катионнсй-о детергента завис1(т на11рим«,9тнрнродм детергента. Детергент вносят в таком количестве, чтобы весовое tobtiiOffieHiite детергент : тротенн. в йолуЧ«НйЫ1 ciiecH находилось в ННтервале от 1:2 дь l:iO а особенности от :3 до 1:5). После JIpiбaвл ilHядefte eнтa смесь цедесообраэно выдер;| ать, найрнмеп, от 30 мнн до. 1в час прн тейивратуре от 4 до . Прн более высшшх температурах . более короткую выдержку. Смесь оста влякуг аредночтительно на 30- во iiiiiR прн Комнатной температуре или оставляю ; да утра ярн .

В качестве катнонирго -детергента может бнцтънсяользован любой катнонныА детергент, Дрст1вто ноактнвны1|, .чтобы «Ейлюбнлизнровать reuarfJiieTHHHH 1 и нейрамниидаэ у, однако, неflMrraiWiHQ активный в условиях реакции чтоiSw Ъазру нтьвсё внруст ч : у .ntilMib3yeMbK в соответствии с изобретеМ|| мкатНонныедете| Менты могут; быть выбра.«Ы 11 известного класса соединений ф фкулы

X

чл. «ь - f

..... .:. -: Щ .. ..: ,

где R1 Rj, R4 - одинаковые или paaлнчнь1е алхнльные нля арилмые остатки нян Rt я Яг вместе -с азотом образуют 5-6члекйый насЫ|Ценн1ий гётёр М1нкл, а; IRa .-.aafkiM или apiuij . . или JRv, Rj, Из вместе с азотом Образуют ; &-б-чмейный ненасыщеннь1Й по азоту гегеро.-«ми:.- : : :- .: ..:.

X--аинон. .... . : . . ; .

Т1|1«длаг1:11 иый способ может бьт осущ1вствггей ясЖхпьэрвайяем вируса гриппа типов А, At А| илн В «uiH ciiecH двух или больше из

itirit iMpycdia. .л--.; ;. .; ..

j ГрИЙЯа а НТВ Ген КОГО ТИЛЯ

лН- З ГСйЕкрмбннаяты штамма А2), Aichi (68)

. р)Е|| :М1 | бМса1рт; н кубацй«в: на я(6риоиировааном

ity mitbli ййце «течение 2 дней прн 37°С.

.JNm. э1атём охлаждают до . оставляют

яа уг. ,,.. V -

; r yiteH yic нйфнйироаанную .аллантойд. иую. жнд1((осТ1 об дияяют. Затем аи рус из

.ЛДлаит1Эт1Д П й ЙИД80СТН Концентрируют путем

фугования в проточнозональной центрнфуге(мрдель RK, электро-нуклеоиике) с применением градиента из тростникового сахара и буферированного фосфатным буфером раствора поваренной солн и подвергают очнстке. Содержа нне гемагглютнннна в вирусном концентрате после снижения процента тростникового сахара инже 5% путем дНализа против буферированного фосфатным буфером раствора поваренной соли и выдержки на холоду равно 1,2 Q прн содержании протеина в 0,7 мг/нл. Для отщепления нммуногена вирусную суспензию обрабатывакуг водным раствором детергента в количестве 1/50 ее объема (1%-иый раствор цетилтринетнламмоннйбромида). Через 30- 60 мни прн комнатной температуре реакцнон ную смесь подвергают градиентному фугованию с применением ранее полученных линейных градиентов тростникового сахара с яосле дующим ф| акц||О4)нрованием градиентов прн помощн яернстальтического насоса. Гемагглк)g танНи н нейрамНнндаза прн этом количественно соЛ1рбнлйзиру|6тся и содержатся в верхней части градиентов и хорошо отделяются от значительно быстрее оседающих остаточных частиц вируса.. .

Промер 2. Вирус размножают, концентрн5 и расщепляюйг по примеру t. Обработку .осуществляют равновесным фугованием в за-. ранее приготовленном градиенте тростникового сахара. После установления равновесия градиент фракционируют и испытывают. Гемагглк „ тиннн н нейрамннидаза содержатся в более . легкой части градиента н хорошо отделены от более плотных частиц вируса. ,

Пример 3. Процесс ведут по примеру I или 2, но используют штамм MRC-2 (рекомбинаиты типа AI), Англия (42/72) нлн MRC-11 (реМ .комбйнанты А г). Порт Ч ал мере (73).

Пример 4. Процесс ведут по примеру 1 или 3, но реакционную смесь обрабатывают прн помощи хром атографни на молекулярном сите. /7рижер 5. Водный раствор (0,5%-ный).цетйЛпнриДиннйбромкда приливают к вирусу грнппа типа А (Пастер/ЗО), предварительно НнактквнрованНому добавкой рмальдегида. Прялнвают детергент до конечной концентрации вт. 0,02 до 0,1/е. Затем обрабатывают аналогично примерам I, 2 и 3. 45 Пример б. Операцию ведут описанным в примерах I, 2, 4 или 5 способом, но со штаммом В (Масс/67)..

Пример 7. Процесс ведут аналогично примерам 1, 3, 5 нлн 6, но ймесь после расщепле ння обрабатывают пеллетированием в ультра50 центрифуге. Для этой цели можно использовать центрифугу. Бекманна L-2-65 В (ротор 60 Ti 35000 об/мин, 90 мин). Солк билизированный иммуноген содержится в верхней фракции.

Примере. Процесс ведут аналогичио любо55 му из примеров 1-7, но вместо цети.г1тримегиламмоннйбромида используют lVe-ный раствор мйристилтркметиламмояийбромида, бензотонийхлорида, метилбензотоиийхлорида, декамето.нмйхЛорида или стеарилдиметилбеизиламмоиийхлЬрида. FFptt этом получают сравинмые о | сзультат1з.

Пример 9. Полученную вакцину можно формулировать (пригопговить лекарственную форiry) следующим образом:

Смесь геммуногеяю 700 междун.ед.

Тиомеросэль1 ч. на 10.(ЮО ч.

Фосфатный буфер в 9 /в-ом

фнзнологнческом растворе

поваренной солиДо 0.5 мл

Иммуногенную смесь (нлн смесь нммуногенов) можно получить по любому на опнсанных нрнмеров, например описанным в.прим«феЗ способом с применением штамма гриппа MRC- 11 (рекомбннанты типа Аг). Порт Ча мере (73)..

Предлагаемый способ обеспечивав селектнвное солюбнлизнрованне компонентов.

Формула изобретения

I. Способ выделення компоненту гёмвгглютняива и нейрамииндазы путем самобнлнзацни мруса 1рнппа различных, штаммов Aet геятом с последующим отделеянем солюбилйзироваиных компонентов от субвирускых час- тиц очисткой от д«ггергента, отличающийся тем, что, с целью селективного солюбилизированнй компонентов, солюбнлнзацию осуществ як т катионным детергентом общей формулы

1| ф Ич

;

е

R.

где JRt, i) 1. Из. R - одинаковые или разлнчные аАкпльные яли арильные остатки,

или R,. н Ra . с образуют

5-б-члеНиый насыщенный гетероцикл,

а Кз - йлкил нля фил,

№Ш Ri, R, Из. вместе с азотом образуют

5)-г-бгчле1н1ый неиасыщекный по азоту гетеродикл:

X - анион.

2. Сткюб по и, I, отличающийся тем, что соотношение белонс: д етёргеНт 1:2 - t: 10.

Источняю информацин, прннятые во вннманне i экстертизе:

I. Г. VtrologY, т. 42. с. 566-575.