Способ микробиологического анализа кала Советский патент 1979 года по МПК C12K1/04 

1

Изобретение относится к области медидины и предназначено для диагностических делей.

Известен способ микробиологического анализа кала, включающий посев кала на питательную среду и подсчет выросших колоний 1.

Однако в известном способе анализ кала осуществляется без учета его состава, а посевной материал распределяют недостаточно равномерно, что существенно влияет на точность измерений.

Целью настоящего изобретения является повыщение точности анализа.

Указанная цель достигается тем, что из исследуе мой пробы перед посевом извлекают микробную массу, а посев производят аэрозольным путем.

Изобретение иллюстрируется чертежами, где на фиг. 1 изображено устройство для извлечения микробной массы; на фиг. 2 - сетка, на фиг. 3-чашка; на фиг. 4 - проб,ка и на фиг. 5 - форсунка.

Способ микробиологического анализа каjia совершают следующим образом.

Устройство содержит дозирующий щприц 1 с остовом 2. Шприц 1 снабжен щтоком 3, ввинчиваемым в порщень 4. Остов 2 щприца состоит из цилиндрической части 5, резервуара 6, который представляет собой расширение ци.чиндрнческой части, навинчиваемой на резервуар крышки 7 и навинчиваемой на остов крышки 8. В крышке 8 остова имеется отверстие (на чертеже не

показано) для прохода штока 3 шприца. Резьбовой наконечник 9 шприца открывается в резервуар 6. Цедилка для удаления грубых частиц посевного материала состоит из сетки 10, вкладываемой в чашку 11 с

отверстиями (а) на дне. Пробка 12 для закрытия наконечника 9 шприца выполнена в виде палочки с резьбовым углублением на конце. Форсунка 13 выполнена в виде трубочки с внутренними резьбами в конечной части.

При подготовке к посеву в резервуар 6 прибора вкладывают чашку И, в нее-сетку 10, поршень 4 шприца при помощи штока 3 отводят до крышки 8, шток 3 вывинчивается. На сетку наносят кал и наливают физиологический раствор в соотношении приблизительно 1 ; 10. Крышку 7 навинчивают на резервуар 6. Путем взбалтывания, например при помощи электрической трясалки, в резервуаре получается равномерная взвесь кала. Потом прибор вкладывают в подходящую центрифугу, например ЦЛС-3, и проводят осаждение взвешенных в растворе кала .микробов и

других мелких частиц, пропускаемых цедилкой. После центрифугирования из прибора удаляют цедилку вместе с оставшимися грубыми частицами, ввинчивают шток 3 и надавливанием на поршень 4 удаляют надосадочную жидкость.

Количество осадка определяется путем отсчета делений шприца или взвешиванием црибора с последующим вычитанием веса порожнего прибора.

Таким образом осуш,ествляется обработка кала для количественного посева.

Приготовление взвесей различной концентрации осуш;ествляют следуюш,им образом: в шприц прибора набирают изотонический раствор Б заданном соотношении с количеством осадка, например 1 : 10; на наконечник 9 шприца навинчивают пробку 12 и при помош;и, например, электрической трясалки из осадка и набранного в шприц изотонического раствора приготавливают равномерную взвесь. Для более быстрого смешивания осадка с изотоническим раствором в шприц предварительно вкладывают три металлические шарика с диаметром примерно в 3 мм.

Удаляя из шприца часть взвеси, оставляют нужное количество ее для приготовления второго разведения с концентрацией взвеси, например в 10 раз меньше первой. Таким же путем можно готовить дальнейшие разведения.

Посев любого разведения производят аэрозольным путем. Для этого пробку 12 вывинчивают, а вместо нее навинчивают форсунку 13. При помощи поршня через форсунку заданное количество взвеси по делениям шприца наносят на питательную среду в чашке Петри, помещенной в закрытом пространстве, например в настольном боксе.

Дифференциация и подсчет выросших колоний микробов проводят известными методами. Пересчет общего количества бактерий или количества отдельных видов на 1 г или 1 мл микробной массы производят, в зависимости от желаемой точности, из показателей посевов взвесей 1-3 разных концентраций.

Предлагаемый способ можно применять для количественного микробиологического исследования также и других веществ, например пищевых продуктов.

Пример.

Прибор готовят к первой манипуляции следующим образом. В шприц вкладываются три металлических шарика, поршень 4 щприца при помощи штока 3 отводят до крышки 8, шток 3 вывинчивают, резервуар 6 с помещенной в нем цедилкой (чашкой и сеткой) закрывают крышкой 7.

После снятия крышки 7 в резервуар прибора вкладывают кусочек кала величиной с горошину и вливают изотонический раствор, примерно до Д объема резервуара. После навинчивания крышки 7 прибор перемещают в электрическую трясалку и подвергают взбалтыванию в течение 20 мин. После этого прибор помещают в центрифугу ЦЛС-3 и производят осаждение микробов в течение 15 мин при 4000 об/мин. По окончании центрифугирования крышку 7 отвинчивают, цедилку вместе с оставшимися грубыми частицами удаляют, ввинчивают шток 3 и надавливанием на поршень 4 удаляют надосадочную жидкость. Определяют вес цеитрифугата: вес прибора вместе с осадком минус вес порожнего прибора : 122,4 г-122,0 ,4 г. В шприц набирают 4 мл изотонического

раствора, канюлю шприца закупоривают пробкой 12 и при помощи электрической трясалки получают взвесь 1:1. После удаления 4,5 мл взвеси и набирания 4,5 мл изотонического раствора получают взвесь

1 : 100, потом подобным образом из 0,5 мл взвеси 1 : 100 и 4,5 мл изотонического раствора получают взвесь 1 : 1000, которая пригодна к посеву на дифференциальноэлективные среды.

Для производства посева на канюлю щприца надевают трубочку с форсункой и надавливанием на шток 3 0,5 мл взвеси 1 : 1000 через форсунку разбрызгивают на поверхность питательной среды в чашке

Петри, помещенной в настольном боксе.

На дифференциально-элективные среды для исследования количественных соотношений различных видов кишечных бактерий высевали по 0,5 мл взвеси микробной

массы 1 : 1000. Использовали среду Эндо, Плоскирева, висмутасульфита и молочносолевого агара.

На среде Эндо выросли бледно-розовые слизистые колонии (колонии № 1), в среднем по 4 Б см, всего в чашке - 312, и красные с металлическим блеском колонии (№ 2), Б среднем по 12 в см, всего - 936; на среде Плоскирева - всего слизистых колоний 16 (№ 3), красных 60 (№ 4), бесцветных 8 (№ 5), на среде висмута-сульфита буровато-зеленого цвета колоний (№ 6), в среднем 8 в см, черных (№ 7) всего - 6, черных блестящих (№ 8) -2, на молочно-солевом агаре всего - 6 желтых колоний (№ 9).

По ферментативным, морфологическим и некоторым другим свойствам установлено, что в колониях № 1 и 3 растут клебсиелла, в колониях № 2, 4, 6 - эщерихия, № 5 и

8 - цитробактер, № 7 - протеймирабилис, № 9 - золотистый стафилококк.

Самое большое количество бактерий составил род клебсиелл (не считая нормального обитателя кишечника - эшерихий),

который был признан предположительным возбудителем гастроэнтерита у данного больного. Это предположение подтвердилось четырехкратным повышением титра антител в ходе заболевания по данным непрямой гемагглютинации к антигенам из

культур клебсиелл. Реакция с антигенами из других выделенных культур, а также с диагностикумами шигелл и салмонелл, не показала диагностических титров.

В посевах необработанного кала того же больного выросла в больших количествах только эшерихия, а протей, стафилококк и клебсиелла выросли в нескольких колониях (2-6), что не дает основания судить о преобладании какого-либо из этих родов, а тем самым и о возможности этиологической роли.

С целью сравнения пересчитали количество самых важных в данном случае бактерий - клебсиелл - на 1 л микробной массы по данным посева на среде Эндо. Посеяно 0,5 мл взвеси 1:1000(1 г: 1000): ,0005 г; 1:0,. Выросло колоний 312, в 1 г 312Х2000 624000.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет более точпо определить количественные соотношения разных видов микробов в кале, исключить влияние на эти соотношения различного у отдельных обследуемых количества посторонних примесей и получить сравнимые данные для исследования экологии микробов кишечника, для определения нормального и патологического состава микробов, особенно условно патогенных.

Кроме того, применение форсунки дает возможность получить более равномерный, по сравнению с известными методами, посев материала, что также способствует более точному определению количества различных микробов. Вместе с удаляемой

жидкой частью кала удаляются и веш,ества, задерживающие рост посеянных микробов, этим достигаются более хорошие результаты посевов.

5 Исследование кала при помощи предлагаемого способа является более чистым и удобным, представляет меньшую опасность заражения, требует меньше трудовых затрат по сравнению с известными методами.

0 При сравнении результатов посева кала по предлагаемому способу и по известному методу (без обработки кала) выявилось значительное преимущество первого в отношении высеваемости. Так, при исследова5 НИИ кала 202 больных параллельно обеими способами салмонеллы выделялись при обработке кала у 18 больных, без обработки - у 9, шигеллы соответственно у 9 и 6, протей - у 59 и 16, золотистый стафилококк - у 30 и 8, клебсиелла - у 9 и 2, энтеробактер - у 14 и 4.

Формула изобретения

Способ микробиологического анализа ка5 ла, включающий посев кала на питательную среду и подсчет выросших колоний, отличающийся те.м, что, с целью повышения точности анализа, из исследуемой пробы перед посевом извлекают микробную массу, 0 а посев производят аэрозольным путем.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Т. А. Авдеева. «Методические указания по количественному микробиологиче5 скому исследованию при дизентерии. Л., 1964, с. 3-5.

9иг.1

Й/2.5

РигЛ