СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ BACILLUS ANTHRACIS Российский патент 1998 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 A61K39/07 C12Q1/04 C12R1/07 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам характеристики штаммов по биологической активности.

Известен качественный способ определения гемолитической активности, который заключается в том, что исследуемую культуру высевают на мясопептонный агар с 5 - 10% дефибринированной крови барана. Посевы инкубируют при 35 - 37^oC в течение 18 - 20 ч, после чего производят учет результатов визуально по наличию прозрачной зоны гемолиза вокруг колоний (Коротич А.С., Погребняк Л.И. Сибирская язва. Киев, Урожай, 1976, с. 89).

Недостатком этого способа является низкая его чувствительность. Значительная плотность агара при относительно высоком уровне продукции гемолитических веществ агаровыми культурами Bac. anthracis затрудняет диффузию этих веществ в толщу агара, содержащего эритроциты. Кроме того, при добавлении 5 - 10% дефибринированной крови приблизительно половину этого объема составляет сыворотка крови, обладающая выраженным ингибирующим действием по отношению к гемолизу Bac. anthracis. Поэтому данный способ пригоден только для выявления гемолитической активности высокоактивных продуктов гемолизинов, к которым можно причислить большинство сапрофитовых представителей рода Bacillus. При работе с Bac. anthracis это способ гемолитическую активность не выявляет.

Известен количественный способ определения гемолитической активности (Ткаченко В. Методика учета реакции гемолиза с помощью фотоэлектроколориметра ФЭК-М. Доклады Иркутского противочумного института, В.1, Улан-Уде, 1961). Этот способ предусмотрен для определения гемолитической активности веществ различной химической природы.

Готовят стандартную взвесь отмытых эритроцитов морской свинки, гемолизат которой, разведенный в 20 раз, дает на ФЭК-М в кюветах с толщиной слоя жидкости 3,045 - 3,060 мм при зеленом светофильтре экстинкцию 0,250 ед.опт.пл.

При определении гемолитического действия тех или иных веществ в каждой пробе контроля или опыта должно быть 0,4 мл стандартной взвеси эритроцитов, содержащихся в 4 мл жидкости (физиологический раствор, бульон). Лишь при таком соотношении 50%-ный гемолиз в опыте будет характеризоваться экстинкцией 0,250 ед. опт.пл. или близким к этому значением, что соответствует наибольшей оптической чувствительности колориметра ФЭК-М.

Растворы или взвеси, содержащие гемолитические агенты, смешивают со стандартной взвесью эритроцитов в ранее указанном соотношении и термостатируют при 37^oC. Для остановки реакции гемолиза опытные и контрольные пробы центрифугируют. Надосадочную жидкость колориметрируют против соответствующего контроля. Степень гемолиза выражают в процентах с учетом того, что 50%-ный гемолиз характеризуется оптической плотностью гемолизата, соответствующей 0,250 ед.опт.пл.

Данный способ дает четкие количественные показатели, что необходимо для изучения динамики процесса гемолиза, влияния различных физических и химических факторов на активность гемолизина и т.д.

Недостатком этого способа является необходимость соответствующего оборудования (центрифуга, ФЭК), а также то, что сам процесс довольно трудоемок. Кроме того, при работе с вирулентными штаммами возбудителя сибирской язвы центрифугирование гемолитической смеси должно производиться в изолированном боксе в герметически закрывающейся центрифуге, исследователь должен работать в полном противочумном костюме 1 типа.

Получение же стерильных фильтратов бульонных культур требует высококачественных фильтрующих устройств. Стерильным можно считать фильтрат только после подтверждения этого отрицательными результатами контрольных высевов. Результаты считаются окончательными только после выдерживания их в течение нескольких суток, на протяжении которых фильтрат в значительной мере утрачивает свою гемолитическую активность.

Данный способ не пригоден для определения неоднородности популяции штаммов, т.к. при засеве спорами бульона образуется смешанная популяция различных клонов и определяется ее суммарная гемолитическая активность.

Наиболее близким по существу к предлагаемому изобретению является способ определения гемолитической активности Bacillus anthracis, включающий приготовление двухслойных агаровых пластин с добавлением эритроцитов барана в верхний слой, формирование лунок в толще агаровых пластин, внесение в них суточной бульонной культуры, инкубирование проб с последующим учетом результатов по наличию зон гемолиза вокруг лунок (авт.св. СССР N 1597404, C 12 Q 1/04, 07.10.90, Бюл. N 37).

Способ осуществляется следующим образом.

Готовили 1%-ный агар на физиологическом растворе, который затем расплавляли, охлаждали и разливали в стерильные чашки Петри по 20 мл. Также готовили на физиологическом растворе 0,7%-ный агар, в который после охлаждения до 45^oC вносили 6% осадка отмытых эритроцитов барана, после чего наносили по 5 мл на застывший нижний слой агара. После полного застывания верхнего агарового слоя в пластинах пробойником диаметром 8 мм делали лунки, дно которых запаивали 1 - 2 каплями расплавленного 1%-ного агара. На одной чашке располагали 6 - 7 лунок. Затем готовили взвесь спор изучаемых штаммов, соответствующую 10 ед.опт.мут. В пробирки с 3 мл стерильного бульона Хоттингера засевали по 0,05 мл (1 кап) приготовленной взвеси спор и помещали их в термостат при 36^oC на 24 ч. В лунки вносили суточную бульонную культуру по 0,1 мл. Посевы инкубировали при температуре 36^oC. Учет производили через 24 и 48 ч.

Данный способ оказался значительно чувствительнее качественного, т.к. применение отмытых эритроцитов устраняло ингибирующее влияние сыворотки, а процесс диффузии гемолитических веществ, находящихся в лунке в виде раствора (бульонная культура), проходил быстрее, чему также способствовало уменьшение плотности и толщины слоя агара, содержащего эритроциты.

Способ удобен при одновременной работе с большим количеством штаммов, выявляет различия в гемолитической активности.

Недостатком способа является невозможность оценки гемолитической активности изолированных колоний, что не обеспечивает возможность отбора клонов с различной гемолитической активностью в рамках одного штамма. Недостаток обусловлен тем, что используется бульонная культура, вследствие чего оценивается гемолитическая активность всей популяции исследуемого штамма.

Целью изобретения является повышение чувствительности и ускорение анализа, обеспечение возможности отбора колоний с различным уровнем гемолитической активности в рамках одного штамма за счет создания лучших условий синтеза и проявления функциональной активности гемолизина сибиреязвенного микроба, а также за счет применения наиболее чувствительных к его действию отмытых эритроцитов человека.

Поставленная цель достигается тем, что приготавливают двухслойную агаровую питательную среду на бульоне Хоттингера с концентрацией агара в нижнем слое 1,0 - 1,5 мас.%, а в верхнем слое 0,6 - 0,8 мас.% с добавлением дрожжевого экстракта 2 - 2,5 г/л и кальция хлористого 0,30 - 0,33 г/л, высевают исследуемую культуру на верхний слой, инкубируют посев в присутствии эритроцитов человека в количестве 6 - 8% от объема среды в течение 22 - 24 ч и учитывают результаты по наличию зон гемолиза эритроцитов.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Применение в верхнем агаровом слое более чувствительных эритроцитов человека, добавление стимулятора синтеза гемолизина и его функциональной активности CaCl₂ и дрожжевого экстракта, стимулирующего рост колоний Bac. anthracis - способствует повышению чувствительности способа.

Принципиальным отличием является то, что в предлагаемом способе агаровые пластины представляют собой питательную среду, на поверхности которой происходит рост колоний, секреция гемолизина, его диффузия в толщу агара с эритроцитами и выявление его действия по зоне гемолиза вокруг изолированных колоний. В прототипе двуслойные пластины с эритроцитами являются лишь тест-системой для выявления гемолизина, секретируемого микробной популяцией бульонной культуры в целом при предварительном выращивании. В связи с этим срок выполнения исследования сокращается до 24 ч по сравнению с 72 ч в прототипе.

Способ осуществляется следующим образом. Готовят двуслойные агаровые пластины. Первым слоем в чашку Петри наливают 20 мл стерильного расплавленного агара следующего состава: 100 мл бульона Хоттингера (pH 7,2-7,4), 1 г агара, 0,2 г дрожжевого экстракта (Sigma), 0,3 мл стерильного 10-%-ного раствора CaCl₂. После полного застывания нижнего слоя сверху наливают 5 мл расплавленного агара: 100 мл бульона Хоттингера, 0,7 г агара, 0,2 г дрожжевого экстракта (Sigma), 0,30 мл 10%-ного раствора CaCl₂, в который после охлаждения до 45^oC стерильного добавляют 6% трижды отмытых в физиологическом растворе NaOH эритроцитов человека. Предварительно готовится взвесь спор исследуемого штамма, при посеве 0,1 мл которой на поверхности агаровой пластины в чашке Петри образуется 25 - 30 колоний. На поверхность агаровых пластин с эритроцитами наносят по 0,1 мл данной взвеси спор, плавным покачиванием распределяют по поверхности агара. После впитывания жидкости чашки переворачивают и помещают в термостат при 37^oC. Учет производят через 24 часа визуально по наличию четких зон гемолиза.

Возможность практического использования изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Готовили двуслойные агаровые пластины. Первым слоем в чашку Петри наливали 20 мл стерильно расплавленного агара следующего состава: 100 мл бульона Хоттингера (pH 7,4), 1 г агара, 0,2 г дрожжевого экстракта (Sigma), 0,31 мл стерильного 10%-ного раствора CaCl₂. После застывания нижнего слоя сверху наливали 5 мл расплавленного агара: 100 мл бульона Хоттингера, 0,7 г агара, 0,2 г дрожжевого экстракта (Sigma), 0,31 мл 10%-ного раствора CaCl₂, в который после охлаждения до 45^oC стерильно добавляли 6% трижды отмытых в физиологическом растворе NaOH эритроцитов человека.

Предварительно готовили взвесь спор Bac. anthracis СТИ-1, при посеве которой на поверхности агаровой пластины в чашке Петри образуется 15 - 25 колоний.

На поверхность агаровых пластин с эритроцитами наносили по 0,1 мл данной взвеси спор, плавным покачиванием распределяли по поверхности агара. После впитывания жидкости чашки перевернули вниз крышками и поместили в термостат при температуре 37^oC. Учет результатов провели через 24 ч визуально по наличию зон гемолиза вокруг колоний (фиг.1) и по их ширине.

Пример 2. Готовили двуслойные агаровые пластины. Первым слоем наливали 20 мл стерильного расплавленного агара следующего состава: 100 мл бульона Хоттингера (pH 7,2), 1,2 г агара, 0,23 г дрожжевого экстракта (Sigma), 0,33 мл 10%-ного раствора CaCl₂. После полного застывания нижнего слоя сверху наливали 5 мл расплавленного агара: 100 мл бульона Хоттингера, 0,8 г агара, 0,23 г дрожжевого экстракта (Sigma), 0,33 мл 10%-ного раствора CaCl₂, в который после охлаждения до 45^oC стерильно добавили 7% трижды отмытых эритроцитов человека.

Предварительно приготовили взвесь спор Bac. anthracis 228/8, при посеве которой на поверхности агаровой пластины в чашке Петри формировалось 15 - 25 колоний.

На поверхность двуслойных агаровых пластин с эритроцитами наносили по 0,1 мл данной взвеси спор, плавным покачиванием чашки распределяли по поверхности агара. После впитывания жидкости чашки перевернули вниз крышками и поместили в термостат при температуре 37^oC. Учет провели через 23 ч. Результаты представлены на фиг. 2. Отчетливо видны зоны гемолиза вокруг изолированных колоний, а также различия в их ширине.

Пример 3. Готовили двуслойные агаровые пластины. Первым слоем наливали 20 мл стерильного расплавленного агара следующего состава: 100 мл бульона Хоттингера (pH 7,4), 2,3 г агара, 0,25 г дрожжевого экстракта /Sigma/, 0,30 мл 10%-ного раствора CaCl₂. После полного застывания нижнего слоя сверху наливали 5 мл расплавленного агара: 100 мл бульона Хоттингера, 0,7 г агара, 0,25 г дрожжевого экстракта (Sigma), 0,30 мл 10%-ного раствора CaCl₂, в который после охлаждения до 45^oC стерильно добавляли 8% трижды отмытых физиологическим раствором NaOH эритроцитов человека.

Предварительно приготовили взвесь спор Bac. anthracis Ихтиман, при посеве которой на поверхности агаровой пластины в чашке Петри вырастает 15 - 25 колоний.

На поверхность агаровых пластин с эритроцитами наносили по 0,1 мл данной взвеси спор, плавным покачиванием чашки распределяли по поверхности агара. После впитывания жидкости чашки переворачивали крышками вниз и помещали в термостат при температуре 37^oC. Учет провели через 22 ч. Результаты представлены на фиг. 3. Четко видны зоны гемолиза вокруг изолированных колоний и различия по ширине у отдельных колоний в рамках одного штамма.

Как показали экспериментальные исследования, снижение концентрации дрожжевого экстракта в среде менее 2 г/л не создает условий для быстрого формирования достаточной величины колоний сибиреязвенного микроба, повышение же более 2,5 г/л приводит к усилению выработки микробом протеолитических ферментов, снижающих гемолитическую активность.

Снижение в среде концентрации CaCl₂ менее 0,30 г/л приводит к снижению активирующего влияния данного вещества на синтез и функциональную активность гемолизина, повышение более 0,33 г/л приводит к помутнению среды, затрудняющему учет результатов.

Время менее 22 ч недостаточно для роста необходимых колоний и формирования четких зон гемолиза. В сроки, более поздние чем 24 ч, наслаивается действие протеолитических ферментов, что может несколько искажать результаты.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование позволит по сравнению с прототипом увеличить чувствительность анализа, ускорить процесс в 3 раза, а возможность селекции клонов с различной гемолитической активностью в рамках одного штамма создаст условия гарантированного отбора субкультур в производстве вакцин, а также для экспериментального изучения роли гемолизина возбудителя сибирской язвы в механизмах патогенеза данной инфекции.

Изобретение предназначено для характеристики штаммов по их биологической активности. Готовят двуслойную агарную питательную среду на бульоне Хоттингера с добавлением дрожжевого экстракта 2 - 2,5 г/л и кальция хлористого 0,30 - 0,33 г/л. Концентрация агара в нижнем слое составляет 1,0 - 1,5 мас. %, а в верхнем слое - 0,6 - 0,8 мас.%. Высевают исследуемую культуру на верхний слой. Инкубируют посев в присутствии эритроцитов человека в количестве 6 - 8% от объема среды в течение 22 - 24 ч. Проводят учет результатов по наличию зон гемолиза эритроцитов. Изобретение повышает чувствительность и ускоряет анализ и отбор колоний внутри одного штамма. 3 ил.

Способ определения гемолитической активности Bacillus Anthracis, включающий приготовление двуслойной агаровой питательной среды с концентрацией агара в нижнем слое 1,0 - 1,5 мас.%, а в верхнем слое 0,6 - 0,8 мас.% с добавлением эритроцитов в количестве 6 - 8% от объема среды, посев исследуемой культуры на верхний слой, инкубирование посева с последующим учетом результатов по наличию зон гемолиза эритроцитов, отличающийся тем, что агаровую питательную среду готовят на бульоне Хоттингера с добавлением дрожжевого экстракта 2,0 - 2,5 г/л и 0,30 - 0,33 г/л кальция хлористого, инкубирование посева ведут в присутствии эритроцитов человека в течение 22 - 24 ч.