Способ оценки эффективности очистки объектов внешней среды от кишечных вирусов Советский патент 1979 года по МПК C12K1/00 

1

Изобретение относится к области энидед(иологии, а именно способу оценки эффективности очистки объектов внешней среды от кишечных вирусов.

Известен способ оценки эффективности очистки объектов внешней среды от кишечных вирусов путем исследования образцов проб после очистки 1.

Однако известный способ не обеспечивает высокой точности оценки эффективности очистки объектов внешней среды.

Целью изобретения является повышение точности оценки.

Эта цель достигается тем, что в исследуемый образец предварительно вносят гуанидин (зависимый вариант кишечного вируса) и после очистки исследуемый образец высевают на культуру ткани с добавлением гидрохлорида гуанидина.

Способ осуществляют следующим образом.

Гуанидин (зависимый вариант кишечных вирусов) получают, используя культуру ткани почек обезьян или перевиваемые линии, чувствительные к кишечным вирусам. В качестве исходного используют любой тип кишечного вируса. Метод заключается в серии последовательных пассажей с нарастающи.ми дозами гидрохлорида гуанидина в питательной среде (от 10 до 150 мкг/мл).

На монослой культуры ткани наносят вируссодержашую жидкость в количестве 1 БОЕ (бляшкообразуюших единиц). Культуру выдерживают при температуре 37°С в течение 60 мин, затем заливают поддерживаюшей средой - 0,5% гидролизата лактальбумина в растворе Эрла (рН 7,6) с добавлением гпдрохлорида гуанидина в коицентрации 10 мкг на 1,0мл

среды.

Культуру ткани ежедневно мнкроскопируют, вплоть до обнаружения разрушения клеток вирусом, ори отсутствии такого эффекта в контрольных клетках, куда вирус

не вносят. Вируссодержащую жидкость используют для следующего пассажа. В последующих пассаж;ах используют нарастающие концентрации гидрохлорида гуанидина в питательной среде: 20-30-40-50-

60-70-80-90-100-120-150 мкг/мл.

Гуанндин (зависимый вариант вируса), полученный в последнем пассаже, проверяют на степень зависимости от гуаниднна, используя общепринятый метод бляшек. Гуанидин (зависимый вариант вируса) не образует бляшек (т. е. не размножается) под обычным питательным агаром и образует блящки под питательным агаром, содержащим гидрохлорид гуанидина (120-

150 мкг/мл).

Рабочее количество г аниди 1 зависимого варианта вируса получают, исходя из потребностей эксперимента. Титр гуанидин зависимого вируса определяют методом бляшек при содержании в питательном агаре 120-150 мкг/мл гидрохлорида гуанидина. До начала эксперимента заготовленное количество вируса хранят в замороженном состоянии при температуре 20°С.

При проведении эксперимента определенное количество гуанидин зависимого варианта вируса вносят в исследуемый объект внешней среды. Осушествляют сбор образцов, отобранных из данного объекта исследования. Количество собранных образцов, объем материала в Образцс, интервал между сбором и проч. зависят от целей эксперимента. После обработки образцов по общепринятым методикам осутцествляют выделение внесенного вируса на культуре ткани с добавлением в питательную среду гидрохлорида гуанидина. Гуанидин нодавляет репродукцию всех кишечных вирусов, кроме внесенного гуанидин зависимого варианта. Подсчет количества вирусов в образце осуществляют, используя метод бляшек ири добавлении в питательный агар 120-150 мкг/мл гидрохлорида гуанидина.

Способ поясняется следующим примером.

Пример. Способ определения эффективности очистки сточных вод. Гуанидин зависимый мутант вируса полиомиелита типа 1, штамм Ь5С2ав (вакционный штамм Сэбина) получают в культуре ткани почек обезьян макак резус в серии 22-х последовательнь1Х пассажей е нарастающими концентрациями гидрохлорида гуанидина в питательной средеотЮдо 150мкг/мл. Техника пассажей следующая: на монослой культуры ткани наносят вируссодержащую жидкость в количестве БОЕ. Культуру выдерживают при температуре 37°С в течение 60 мин, затем заливают жидкой поддерживающей средой-0,5% гидролизата лактальбумина в растворе Эрла (рН 7,6) с включением гидрохлорида гуанидина в концентрации 10 мкг/мл.

После появления цитопатического эффекта, т. е. разрушения клеток вирусом, вируссодержащую жидкость используют для следующего пассажа. В последующих пассажах концентрация гидрохлорида гуанидина в питательной среде нарастает: 20- 40-50-60-80-100-120-150 мкг/мл.

Рабочее количество гуанидин зависимого мутанта вируса полиомиелита получают в культуре ткани почек обезьян макак резус в присутствии 150 мкг/мл гидрохлорида гуанидина (рабочий объем содержал ЫО БОЕ/МЛ при титровании в присутствии 150 мкг/мл гидрохлорида гуанидина, без гуанидина титр вируса был равен 1-102 БОЕ/МЛ).

Полученный гуанидин зависимый вариант вируса полиомиелита используют для

оценки эффективности очистки сточной воды на отдельных сооружениях станции аэрации.

Расчетное количество вируса (1,5-10 БОЕ) вносят в объект внешней среды - через канализационную систему населенного нункта В сточные воды поселка. Такое количество вируса оказалось бы в канализационной системе, если 5-10% жителей

поселка выделяли бы этот вирус.

Образцы проб сточных вод на станции аэрации собирают в двух пунктах: н-осле механической очистки и после всех этапов очистки в течение 7 суток -с. момента внесения вируса. После специальной обработки образцов осуществляют выделение маркированного вируса и выявляют количество вируса в образцах методом бляшек с включением в питательный агар 120-

150 мкг/мл гидрохлорида гуанидина.

Последующий анализ нозволил установить, что при наличии 5-10% выделителей среди населения вирус обнаруживается в течение 7 суток в сточных водах, прошедших механическую очистку, и не обнаруживается в сточных водах, прошедших все этапы очистки. То есть принятая комплексная система очистки сточных вод на этой станции аэрации эффективна в отношении

кишечных вирусов. Предлагаемый способ производителен, так как позволяет вносить достаточное количество вируса в любой объект внешней среды -и избирательно выделять его до и после очистки.

Способ обладает высокой точностью, так как позволяет вносить рассчитанное и достаточное для исследований количество вируса.

Предлагаемый способ позволяет вносить

вирус в заданный момент времени, при этом исключена возможность неконтролируемого попадания гуанидин зависимого вируса в исследуемый объект.

Зависимость размножения полученного

Варианта кишечного вируса от гуанидина обеспечивает избирательное выделение данного вируса из объекта внешней среды. Добавление гуанидина в питательную среду разрешает репродукцию данного вируса

и подавляет репродукцию всех других кишечных вирусов.

Зависимость размножения полученного варианта кишечного вируса от гуанидина обеспечивает полную безопасность вируса

для человека, в организме которого гуанидин отсутствует, и, следовательно, вирус не может давать потомство в человеческой популяции, поэтому исключено вторичное, дополнительное загрязнение тем же вирусом объектов внешней среды.

Безопасность штамма обеспечивает возможность его внесения в любые объекты внешней среды - большие открытые водные системы, почвы, пищевые продукты.

Учитывая полную безопасность маркированного вируса, способ может найти широкое практическое применение для оценки эффективности очистки сточных вод, ВТОМ числе на действующих очистных сооружениях, эффективности обеззараживания питьевой воды, в том числе на станциях водоснабжения, эффективности методов пастеризации пищевы-х продуктов на предприятиях пищевой промышленности, для оценки эффективности новых способов очистки объектов внешней среды, для расшифровки процессов самоочистки, происходящих в природе, например, для изучения влияния факторов разведения воды в открытых водных системах, инсоляции, влияния промышленных стоков на выживаемость кишечных вирусов в сточных водах и в воде открытых водоемов. Ф о j-) м у л а изобретения Способ оценки эффективности очистки объектов внешней среды от кишечиых вирусов путем исследования образцов проб после очистки, отличающийся тем,что, с целью повышения точности оценки, в исследуемый образец предварительно вносят гуанидин зависимый вариант кишечного вируса и после очистки исследуемый образец высевают на культуру ткани с добавлением гидрохлорида гуанидина. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Журнал гигиены, эпидемиологии, микробиологии, иммунологии, 11,3, Прага, 1967, с. 259-264.