Способ дифференциации энтеровирусов Советский патент 1993 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано для дифференциации энтеровпрусов: полиомиелита. Коксаки А, Коксаки В и ECHO.

Целью изобретения является повышение точности дифференциации энтеровпрусов,

Для реализации этой цели используют гидрохлорид гуанидина, способного подавлять репродукцию пикорновирусов, в т.ч. и вирусов группы Коксаки А. Отсугстаие репродукции цитопатогенных изоляюв а культуре клеток, поддерживающая среда которых содержит гидрохлорид гаунидима в концентрации 200 мкг/мл и наличие одновременно в культуре клеток, поддерживающая среда которых содержит рабочую концентрацию нифзна белфтазида и их смеси 10 мкг/мл (при учете контрольных проб), позволяет отнести исследуемый изолят к вирусам Коксаки А.

Способ иллюстрирует следующий-пример: проводили дифференциацию 36 изо- лятов, выделенных от больных

полиомиелитом, серозным меьингитом, гер- пангиной отдельно ч п ассоциации,а также из образцов проб окружающей среды (сточные соды, вода открытых водоемов).

Приготовление перевиваемой культуры амниона человека FL.

Отбирают культуру со сплошным монослоем клеток, имеющих типичную для данной линии морфологию, с четко выраженными границами между клетками. Клетки снимают со стекла матрасов трип- син-персеном. Для этого приготавливают смесь равных объемов 0,25% раствора трипсина и раствора иерсена, подогревают ее о водяной бане до 30-35°С. Вначале с матраса выливают питательную среду, клеточный слой промывают 3 раза фосфатно-буфер- ным раствором (рН 7,5), не содержащим ионы кальция и магния. Затем теплой смесью (трипсин-версен) заливают монослой культуры клетик так, чтобы нее участки были покрыты жидкостью. В матрасы объемом 100, 250 и 1000 мл раствор добавляют,

(Л

С

со го

4 N N

соответственно, по 10. 15 и 30 мл. Матрасы встряхивают и помещают в термостат (37,0°С) на 15-20 мин до полного отделения клеток от поверхности стекла. Крупные конгломераты клеток диспергируют, пипетируя несколько раз клеточную взвесь. Суспензию клеток центрифугируют 10 мин. при 2000 об/мин., смесь трипсин-версен удаляют. Осажденные центрифугированием клетки ресуспендируют о небольшом объеме ростовой питательной среды, количество клегок подсчитывают в счетной камере Го- ряева. Взвесь клеток контролируют на бактериальную стерильность, разводят питательной средой с таким расчетом, чтобы в 1,0 мл содержалось 60 тыс. клеток. В качестве среды для выращивания клеток используют среду Игла; среду 199, Игла-МЕМ, 0,5% гидролизат лактальбумина и др., с добавлением телячьей сыворотки или сыворотки крупного рогатого скота (10%-ной) и антибиотиков. Перевиваемые клетки (FL) разливают в пробирки по 1,0 мл. Для поддерживания роста клеток используют те же вышеприведенные питательные среды без добавления сыворотки. В пробирках среду меняют через 4-ро суток культивирования клеток, Обновление сплошного монослоя клеток новой генерации наблюдали через 5-6 суток,

Приготовление рабочей концентрации растворов пиофана, белфтазида и их рабочей смеси,

Объемы рабочих растворов готовят в зависимости от количества типируемых изоля- тов. Препараты при разведении трижды перемешивают пипеткой, обьемом 10,0 мл. Исходные растворы из вскрытых ампул хранятся в стеклянных емкостях с притертыми пробками при 4±2°С до 60 суток, а рабочие растворы не хранятся.

Для приготовления рабочего раствора нифана, используемого в опыте, во флакон с 49,9 ±0,1 мл поддерживающей среды добавляют 0.1 ±0,01 мл содержимого ампулы. Аналогичным образом готовят рабочий раствор белфтэзида. Это пример приготовления 50,0 мл рабочего раствора с концентрацией 10,0 мкг/мл. Смесь соединений получают путем объединения равных объемов нифана и белфтазида в рабочих концентрациях 20 мкг/мл.

Приготовление рабочей концентрации гидрохлорида-гуанидина.

Объем рабочего раствора готовят в зависимости от количества гипирусмых изоля- тов Отвешивают 20,0 мг гидрохлорида гуанидинз, высыпают о стерильный флакон и добавляют поддержичающую среду до

100,0 мл. Раствор стерилизуют через асбестовый фильтр. Это пример приготовления 100,0 мл рабочего раствора гидрохлорид-гу- анидина с концентрацией 200,0 мкг/мл.

Титрование вируссодержащего материала.

Титрование изолятов, подлежащих дифференциации, проводят в культуре клеток FL методом конечного разведения по цито0 патогенному действию и выражали в Ig ЦПДбо. Для титрования изолятов вначале готовят различные их разведения, обычно десятикратные от до 10 . Во все пробирки вносят по 9,0 мл стерильного физио5 логического раствора или раствора Хэнкса. Затем в первую пробирку вносят 1.0 мл ви- руссодержашего материала и получают разведение 10 (1:10). При помощи новой пипетки содержимое первой пробирки тща0 тельно перемешивают и 1,0 мл переносят во вторую пробирку, получая разведение 10 (1:100) и т.д. Перед заражением монослоя культуру FL йзолятами, предварительно производят 3 раза отмывание культур кле5 ток от сыворотки раствором Хэнкса. рН 7,5 или раствором Эрла, рН 7,6. На каждое десятикратное разведение вируссодержащего материала используют по 4 пробирки с культурой клеток. Вируссодержащий материал

0 сносят на монослой клеток в объеме 0,1 мл, а затем клетки инкубировали при 37,0± ±0,1 °С в течение 60 минут, после чего вносят поддерживающую среду без сыворотки. Инкубирование зараженной культуры про5 изводят при 37,0±0,1°С. Состояние зараженной культуры периодически проверяют под микроскопом в течение 7 дней. Результат цитопатического действия ЦПДбо изоля- та считают положительным, если не менее

0

половины клеток в культуре подвергались

специфической дегенерации. Титр (50,0% эффективной дозы) вычисляют по методу Рида-Менуа.

Дифференциацию вирусов проводят по

5 следующей схеме: в пробирку с культурой клеток, освобожденных от ростовой среды, заливают по 1 мл поддерживающей среды, содержащей отдельно нифан, белфтазид и их смеси и гидрохлорид гуанидина в рабо0 чей концентрации (по 4 пробирки). Затем вносят в каждую пробирку исследуемый материал в объеме 0,1 мл с активностью 100

ЦПД50.

В опыте ставят следующие контрольные 5 пробы,

1.Неинфицированную культуру клеток с раствором нифана.

2.Неинфицированную культуру клеток с раствором белфтазида.

3.Неинфицированную культуру клеток со смесью растворов нифана и белфтазида.

4.Неинфицированную культуру клеток с раствором гидрохлорида гуанидина.

5.Неинфицированную культуру клеток с поддерживающей средой.

6.Культуру клеток, инфицированную исследуемым материалом в объеме 0.1 мл. активностью 100 ЦПДю с поддерживающей средой.

Для каждой контрольной пробы используют по 2 пробирки с культурой клеток.

Учет результатов.

Определяют степень защиты культуры клеток нифаном, белфтазидом и гидрохло- ридом гуанидина от цитопатического действия (ЦПД) исследуемого материала по сравнению с таковым о контрольных пробах, в присутствии поддерживающей среды без нифана. белфтазида и гидрохлорид-гуа- нидина. Просмотры культуры клеток проводят через 24, 48 и 72 часа под световым микроскопом. Результаты учитывают npir регистрации в контрольной пробе исследуемого материала ЦПД на 3-4 креста. В не- инфицированных контрольных пробах клеток ЦПД должно отсутствовать. При наличии токсических изменений в культуре клеток в вышеперечисленных контрольных пробах со стороны нифана, белфтазида и их смеси результаты не учитывают и опыт повторяют с дозой, равной 1/2 либо 1/4 рабочей концентрации. При наличии подобных изменений со стороны гидрохлорида гуанидина вместо 200,0 мкг/мл используют рабо- чую дозу 150.0 мкг/мл. Белфтазид устанавливает принадлежность идентифицируемых агентов к группе вирусов Коксаки В и ECHO, нифан - к вирусу полиомиелита, смесь нифана и белфтазида - к вирусам полиомиелита ECHO и Коксаки В. а смесь нифана с белфтазидом и отдельно гидрохлорид гуанидин - к группе вирусов Коксаки А (табл.).

В результате дифференциации 32 изо- лятов от больных энтеровирусными инфекциями, а также из образцов окружающей среды установлено следующее: 8 относились к вирусу полиомиелита, 18 - к группам вируса Коксаки В и ECHO. 2 - к вирусам полиомиелита, Коксаки В и ECHO, остальные 4 изолята относились к группе вирусов Коксаки А.

При сопоставлении результатов дифференциации энтеровирусов с аналогичными, полученные в результате использования общеизвестных приемов идентификации (в ре- акции нейтрализации и встречного иммуноэлектрофореэа с типоспецифиче- скими иммунными сыворотками к. энтерови- русам, производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов), отмечалось полное совпадение.

Так, из 8 изолятов вируса полиомиелита два штамма относились к типу 1, остальные 2 и 4 к типам II и III. Из 18 изолятов, принадлежащих к вирусам Коксаки В и ECHO: 4 штамма относились к вирусу Коксаки В1, 3 - Коксаки ВЗ, 2 - Коксаки Вб, 6 - к вирусу ECHO 6, остальные 3 штамма - к вирусу ECHO 7. Из 2 изолятов вирусов, принадлежащих к группе вирусов полиомиелита. Коксаки В и ECHO, были идентифицированы доз штамма оируса полиомиелита типов П и ill. по одному штамму Коксаки ВЗ и ECHO 6. Остальные 4 изолята. относящихся к вирусам Коксаки А,были идентифицированы как Коксаки А7 (два штамма), Коксаки А9 (один штамм) и Коксаки А11 (один штамм).

Таким образом, осуществление дифференциации энтерооирусоп по предлагаемому способу является приемлемым для любой вирусологической лаборатории ввиду несложности технологических приемов, не связано с дополнительными экономическими затратами и обладав повышенной точностью, так как помимо известных групп знтсровирусов позволяет выявить дополнительную группу вирусов - Коксаки А.

Формула изобретения Способ дифференциации энтеровирусов, включающий заражение культуры клеток амниона человека, добавление в пробы нифана, белфтазида или их смеси с последующей дифференциацией вирусов полиоми- леита, Коксаки В и ECHO по цитопатическому действию, отличающийся тем, что. с целью расширения функциональных возможностей способа путем выявления вируса Коксаки А, параллельно в дополнительную пробу добавляют гидро- хлорид-гуанидин и дифференцируют вирус Коксаки А от других вирусов по отсутствию цитопатического действия.

Таблица 1

Использование: вирусология, медицина. Сущность изобретения: к культуре клеток амниона человека добавляют отдельно нифан, бслфтазид, их смесь и гуапидин гидрохлорид. Затем добавляют исследуемый материал. После инкубации определяют ци- топатичсское действие, Балфтазид устанавливает наличие вирусов Коксаки В и ECHO, нифан-Ешрусы полиомиелита, смесь нифана и белфтазида и отдельно гузнидин гидрохлорид- вирусы Коксаки А. 2 табл.

Варианты, возможные при учете результатов опыта

Примечание:-отсутствие дегенерации клеток;

+ дегенерация клеток на 3-4 креста.

Таблица 2 Характеристика способа-прототипа и предлагаемого способа

идентификации энтеровирусов

Набор материалов и реактивов

I. Из оляты, подл ежащие идентифи- I. То же самое нации.

гуанидина

Биологические свойства

I.Нифан - подавляет репродук- I. То же самое цшо вируса полиомиелита

Назначение

Дифференциальная диагностика Дифференциальная диагностика ви- вирусов полиомиелита, Коксаки русов полиомиелита, Коксаки А и В, В и ECHO, выделенных из проб выделенных из проб от сольных и

от больных и здоровых лвдей здоровых людей (фекалий, носогло- (фекалии, носоглоточные смывы, точные смыви. кровьг спинно-мозговая кровь, спинно-моэговал жид- жидкость), объекты окружающей сре- кость). объекты окружающей ды (сточные воды, вода открытых среды сточные воды, вода от- водоемов и т.п.) крытых водоемов) и т.п.

Способ применения

Технология осуществления спо- Технология предлагаемого способа соба, учет результатов деталь- предусматривает,помимо известных но описаны в прилагаемой ин- ингредиентов, дополнительный -при- струкции (I)готовление рабочего раствора гидрохлорида гуанидина

Стоимость препаратов

Кооператив Диагностикум при То же самое Львовском НИИ гематологии и переливания крови реализует . препараты по цене:

Яифан - руб. за I мл 0,6$ Стоимость гидрохлорид гуанидина: раствора;I ил, содержащий 200 ыхГ Ггидро Белфтаэид - I руб. за I мл хлорид гуанидина)«0,00021 коп. 0,ЭД раствора;из расчета 1,0 кг 10 руб. 60 коп.

Смесь Пифона и Белфтаэида - Всего: 4.0 ч- 0,00021 коп. «4,0руб.- 2,0 руб.- 0,00021 коп. (практически не отличается от прототипа) Всего: 4,0 руб.

ц182444112

Продолжение табл 2

Точность дифференциации

Споооб-прототип устанавливает принадлежность энтеровирусов к следующим группам:

б. Не энтеровирус либо смесь вирусов Дифференциация по упрощенной схеме

Не возможноЕсли вместо смеси Нифан + Белфтаэид использовать гидрохлорид

гуонидина, то дифференциацию энтеровирусов можно произвести на уровне следующих групп (см.табл.):

Следовательно, смесь Нифан 4- Бел- фтазид можно еаменить раствором гидрохлорида гуанндина. В этом случае стоимость препаратов составляет 2 руб.; 0,00021,, аместо 4,0 руб.

Следовательно, смесь Нифан 4- Бел- фтазид можно еаменить раствором гидрохлорида гуанндина. В этом случае стоимость препаратов составляет 2 руб.; 0,00021,, аместо 4,0 руб.