получения алкилселенопроизводного. Реакции могут быть выполнены в водной среде. Можно также пользоваться другими вытесняющими нуклеофилами, такими как селеномочевина. Полученные таким образом соединения потенциально пригодны в качестве радиоактивных лигандов при определении аденозин-3,5-циклического монофосфата (АМФ).
Продукты, относящиеся ко второму классу, могут быть получены при взаимодействии между селенметил-Ь-селеноцистеином - селеном-75 и 2-о-гемисукцинатом циклического нуклеотида в среде диметилформамида в присутствии N-этоксикарбонил-2-этоксидигидрохинолина (EEDQ). Эти продукты с сопряженными связями приготовлены из 3,5-циклического АМФ и 3,5циклического GMP и показано их прочное связывание с антителами для этих циклических нуклеотидов (IV и V)
О-СНг-о в
он
носнт. в А .0,
о
MHi
,h)
пЛ.i ys
к
I
А
А 3,
2з
Я.
f
А BS
I
,.
. в/4
-1. Ri -r-NH2; Кз 5еСНз; -ОН;
2. Ri -ОН; Н2 -NH2; 5еСНз; R4-ОН;
3. Ri -SeCHa; R2 -H; R3 -H; R4 --ОН;
4.R, -NH,; Ra ::-H;
R4 -OCO-CH2CH2CO.NHCHX
Х(СООН)СН.ЗеСНз;
5.R,-OH; R,r.H,; R4--OCO; CH,CH,CO.NHCH(COOH)CH,X
ХЗеСНзИзобретение позволяет использовать селен-75 для мечения циклических нуклеотидов вообще и в частности следующих групп, из которых I, II и П1 имеют наиболее значение.
I. AiBi. Аденозин-3,5-циклический фосфат (циклический АМФ), замещенный в положении 6, или 8, или 2. Например:
8-метилселеноциклический АМ.Ф, полученный из 8-бромциклического АМФ и метилселенида натрия;
6 - метилселенопуринрибозидциклический фосфат, полученный из 6-хлорпуринрибозидциклического фосфата и метилселеноцистеамина.
П. AiB2. Цистидин-3,5-циклический фосфат, замещенный в положении 2, или 4, или 2.
III.AiBs. Гуанозин-3,5-циклический фосфат (циклический СМФ), замещенный в
положении 2, 6, или 8, или 2. Например: 8-метилселеноциклический ОМФ, полученный из 8-бромциклического ОМФ и селеномочевины;
2-метилселеноинозин - 3,5 - циклический
фосфат (циклический JMP), полученный из
2-хлорциклического JMP и метилселенида
натрия;
2-амино-6 - метилселенопуринрибозидциклический фосфат, полученный из 2-амино6-хлорпуринрибозидциклического фосфата и метилселенида натрия;
№- (2 - метилселеноэтил) - циклический GMP, полученный из 2-хлорциклического
JMP и метилселеноцистемина.
IV.. Уридин-3,5-циклический фосфат, замещенный в положении 2, или 4, или 2.
V.АзВб. Тимидин-3,5-циклический фосфат, замещенный в положении 2 или 4.
VI.AiBe. Инозин-3,5-циклический фосфат (циклический ЛМФ, замещенный в положении 2, 6, 8 или 2.
В этих примерах, заместителями у пуринового или пиримидинового кольца являются либо селено-(С1-С4)-алкильные или(Ci-€4) - алкилселено - (Ci-€4) - алкиламиногруппы; заместители у кольца рибозы описываются формулой -OCO-CH2-CH2-CONH-R,SeR2,
где R представляет собой алкиленовые группы , которые могут нести на себе группу - СООН, а
R2 представляет собой алкильную группу Ci-С4.
Атомы селена содержат искусственно созданную высокую долю селена 75.
Получение 8-метилселеноаденозин - 3,5циклического монофосфата - селена-75.
Водный раствор кислого селенида натрия - селена-75 готовят путем прибавления воды (1 мл) к смеси красного селена- селена-75 (0,011 м атом; 300 мкюри; 27 кюри/м атом) и боргкдрида натрпя (1,6 мг; 0,042 ммоль).
Смесь перемешивают при комнатной температуре в атмосфере азота до тех пор, пока весь селен не растворится. Избыток боргидрида натрия разрушают путем нагревания раствора в течение 5 мин при 100°С. К раствору кислого селенида натрия - селена-75 прибавляют 8-бромаденозин-3,5циклический монофосфат (5,2 мг; 0,013 ммоль) в воде (1-мл) и смесь перемешивают в течение 3,5 ч при 90-95°С.
Реакционную смесь обрабатывают йодистым метилом (0,5 мл), дитиотрентолом (5 мг) и карбонатом натрия (10 мг) и перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. После этого смесь упаривают при пониженном давлении до небольшого объема, пелевой продукт выделяют и очишают методом препаративной тонкослойной хроматографии в двух системах: 1) 1 мм силикагель («Мерк 60 Рр254) н-бутанол, уксусная кислота, вода (60:15: :25) и 2) 1 мм целлюлоза (Авицель) н-бутанол, уксусная кислота, вода (60:15:25). Более быстро перемещаюшийся компонент с двумя радиоактивными полосами поглош.ения в ультрафиолетовой области спектра в системе 1 подвергнут повторному хроматографированию в системе 2. После авторадиографии пластинки медленнее перемещающийся из двух компонентов, полученный в системе 2, экстрагирован водой для получения fl мкюри 8-метилселеноаденозин-3,5-циклического монофосфата - селена-75.
. 287 нм (емакс. 16300). Идентичность продукта подтверждена сравнением с чистым, нерадиоактивным 8-метилселеноциклическим AMP в шести хроматографических системах.
Получение 8 - метилселеногуанозин-3,5циклического монофосфата - селена-75.
Водный раствор кислого селенида натрия - селена-75 готовят путем прибавления воды (1 мл) к смеси красного селена (0,016- м атом; 421 мкюри; 26,2 мкюр«/м - атом) и боргидрида натрия (1,5 мг; 0,039 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в атмосфере азота до полного растворения селена. Иодид 5-метилизотиоурония (3,8 мг; 0,017 ммоль) в воде (0,5 мл) продувают азотом и прибавляют к раствору кислого селенида натрия - селена-75. Реакционную смесь нагревают в течение 2 ч при 90°С. Анализ реакционной смеси по прошествии этого периода времени указал на наличие одного радиоактивного компонента с величиной Rf 0,60, дополняющего красный селен - селен-75. Раствор лиофилизируют и остаток 5 экстрагируют ацетоном (2 мл). Раствор в ацетоне выпаривают досуха для получения селеномочевины - селена-75 (157 мкюри; 6,0x10-3 ммоль), которую хранят в твердом состоянии при температуре -140°С до
10 момента ее использования.
К селеномочевине - селену-75 (6,0 X ХЮ ммоль) прибавляют 8-бромгуанозин-3,5-циклический монофосфат (свободная кислота; 3,2 мг; 7,5Х10 ммоль) в
5 безводном метаноле (1 мл) и смесь нагревают при температуре кипения с обратным холодильником в течение 8 мин, затем охлаждают. К реакционной смеси поочередно прибавляют метилат натрия (1,2 мг) в метаноле (220 мкл) и йодистый метил (10 мкл) в метаноле (250 мкл), реакционную смесь перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре. Раствор выпаривают досуха и остаток очищают методом
5 тонкослойной хроматографии с применением системы из 1 мм целлюлозы авицель на пластинке (94%-ный водный бутанол, 44%-ная водная пропионовая кислота, 1:1). Главный радиоактивный компонент после
0 определения его местоположения удаляют с пластинки и экстрагируют водой. Продукт (8,8 мкюри) хранят при температуре - 140°С. Установлено, что радиохимическая степень его чистоты составляет 96%,
5 но он содержит не радиоактивные примеси, поглощающие в ультра-фиолетовой области спектра. Часть продукта (0,3 мкюри) помещают в колонку сефадокса (20X1 см) и элюируют 0,1 М раствором бикарбоната
0 аммония. Главную радиоактивную фракцию, не содержащую нерадиоактивных примесей, поглощающих в ультрафиолетовой области спектра, собирают и выпаривают досуха.
5 После выпаривания с водой для удаления бикарбоната аммония получают 8-метилселоногуанозин-3,5 - циклический монофосфат - селен-75 (0,22 мкюри). Этот продукт связывает антитела, возникающие
0 против циклического СМФ-2-сукцинил-В5А.
Сочетание 2-О - сукцинилгуанозин - 3,5циклического монофосфата и селенометилL-селеноцистеина - селена-75.
Раствор 2-0-сукцинилциклического ОМФ
5 (0,45 мг; 1,0 ммоль) и Ы-этоксикарбонил-2этоксидигидрохинолина (0,7 мг) в безводном диметилформамиде (75 мкл) прибавляют к раствору селенометил-1,-селеноцистеина-селена-75 (16,1 мкюри); 1 ммоль)
0 и триэтиламина (5 мкл) в диметилформамиде (100 мкл). Реакционную смесь перемещивают при комнатной температуре. Методом тонкослойной хроматографии с использованием системы целлюлозы авицель
(н-бутанол. уксусная кислота, вода 60:15:.
:25) установлено присутствие двух основных радиоактивных компонентов: селенометил-/,-селеноцистеина - селена-75 с величиной Rf 0,63, а метилселеноцистеинового селен-75-производного с сопряженными связями 2-О-сукцинилциклического ОМФ с величиной Rt 0,40. Продукт конденсации Rf 0,40) выделен методом препаративной тонкослойной хроматографии с применением целлюлозы авицель и указанной выше системы элюентов. Получен продукт с активностью 0,7 мкюри.
Получение диселенида - селена-75: бис6,6- (пуринрибозид-3,5-циклического монофосфата).
Раствор 6 - хлорпуринрибозид-3,5-циклического монофосфата (5,0 мг; 0,012 ммоль) и кислого селенида натрия - селена-75 (0,06 ммоль) в воде (2 мл) нагревают в атмосфере азота в течение 2 ч. Реакционную смесь вносят в колонку сефадекса ДЕЛЕ (J5X I см) и элюируют 0,1 М растворолт дикарбоната аммония (500 мл), 0,2 М (500 мл) и наконец 0,3 М раствором бикарбоната аммония (500 мл). Главную фракцию, обладающую радиоактивностью и поглощающую в ультрафиолетовой области спектра, собирают и выпаривают досуха. При повторных выпариваниях с водой удаляют остаточный бикарбонат аммония. Продукт, представляющий собой диссленид - селен-75 бис-6,6- (пуринрибозид-3,5циклического монофосфата) дает спектр поглощения в ультрафиолетовой области с .макс. 287 нм. После восстановления диселенида при помощи дитиотрентола (10 мг) в 1 М буферном растворе трис с величиной рН 7,5 (5 мл) изменения в спектре поглощения в ультрафиолетовой области указывают на характеристическое поглощение 6-селенопурина с .макс. 345 н.м.
Получение 6-метилселенопуринрибозид3,5-циклического монофосфата - селена-75.
Йодистый метил (0,15 мл) и дитиотретиол (12 мг) прибавляют к раствору диселенида - селена - 75 бис - 6,6- (пуринрибозид - 3,5 - циклического монофосфата) (3,7 мкмоль; 20 мккюри) в 1 М буферном растворе трис с величиной рН 7,5 (5 мл), смесь тщательно перемещивают в течение I ч. Раствор вносят в колонку сефадекса ДЕАЕ (15x2 см) и после этого колонку элюируют 0,2 М раствором бикарбоната аммония. Главную фракцию, поглощающую в ультрафиолетовой области спектра и обладающую радиоактивностью, собирают и выпаривают досуха; повторные выпаривания с водой служат для удаления остаточного бикарбоната аммония. Выход 6-метилселенопурннрибозид-3,5 - циклического монофосфата - селена-75 соответствует 27 мккюри.
Ямакс. 231 мм, 304 нм (рН 7). Один компонент обнаружен методом хроматографии
на целлюлозе PEJ с 0,2 М раствором бикарбоната аммония.
Пример I. Типовая характеристика чувствительности к дозе излучения при 5 определении циклического AMP с применением 8-метилселеноаденозин - 3,5-циклического монофосфата - селена-75.
Стандартные растворы циклического АМФ, содержащие 1, 2, 4 и 8 пикомоль в
0 50 ммоль буферного раствора трис/ЭДТА, (4 м.моль), рН 7,5 (50 мкл) вносят пипеткой в пробирки при 2-4°С. Буферный раствор вносят также в пробирки с общей дозой, контрольной дозой и нулевой дозой
5 соответственно, 150, 150 и 50 мкл, также при 2-4°С. В каждую пробирку прибавляют 8-метилселеноциклический АМФ - селен-75 (3 пикомоль); удельная активность около 22 кюри/ммоль в 50 мкл буферного
0 раствора.
Во все пробирки, за исключением контрольных вносят связывающий белок (экстракт из мыщц быка) в 100 мкл буферного раствора. Содержимое пробирок смещива5 ют вращательным движением в течение примерно 5 с, а затем цх выдерживают в течение 3 ч при 2-4°С. Во все пробирки, за исключением общей дозы вводят суспензию древесного угля в воде (100 мкл) и
0 после перемещивания вращательным движением в течение примерно 5 с содержимое пробирок немедленно центрифзгируют для осаждения древесного угля. Из верхнего прозрачного слоя каждой пробирки отбирают пробы по 200 мкл, как и из пробирки с общей дозой и отсчитывают на гаммасчетчике. Результаты представлены ниже.
Связанный
Доза циклического AMP,
циклический АМФ, пикомоль
меченый селеном-75, %
О 1 2
38,8 29,7
26,7
4 2,4
8 16,6
16 10,6
Пример 2. Типовая характеристика чувствительности к дозе излучения при определении циклического СМФ с применением 8-метилселеногуанозин-3,5 - циклического монофосфата-Se 75.
Стандартные растворы циклического ОМФ, содержащие 0,25; 0,5; 1,0; 2; 4; 8 и 1600 пикомоль в 100 мкл б}ферного раствора на 50 ммоль трис/ЕДТА (4 ммоль) с рН 7,5 вносят пипеткой в пробирки, выдерживавщиеся при 2-4°С, концентрация в 16000 пикомоль на 100 мкл использована для определения неспецифической связи. В пробирку вносят также 100 мкл буферного раствора для определения отсчета для нулевой дозы. В каждую пробирку прибавляют 8-метилселеноциклический GMO - селен-75 (0,25 пикомоль, удельная активность около 24 кюри/ммоль) в 50 мкл буферного раствора. Антитело сыворотки (против циклического ОМФ-2-сукцинилBSA) в 50 мкл буферного раствора вводят иосле этого во все пробирки. Содержимое пробирок быстро перемешивают вращательным движением и выдерживают в течение 3 ч при 2-4°С. Во все пробирки прибавляют по 1 мл водного раствора сульфата аммония (насыщенного на 60%) при 2-4°С и пробирки иосле перемешивания их содержимого выдерживают в течение 5 мин при 2-4°С и затем центрифугируют. После декантирования верхнего прозрачного слоя жидкости и удаления приставшей жидкости осадки используют для проведения отсчета на гамма-счетчике. Для получения отсчета для общей дозы пользуются 0,25 пикомоль 8 - метилселеноциклического - ОМФ - селена-75 (удельная активность около 24 кюри/ммоль в 50 мкл буферного раствора). Полученные результаты приведены ниже.
пикшГь Дик иГескГоМР. пикомольмеченый селеном-75, %
О45,3
0,2533,7
0,527,8
1,022,3
2,014,0
4,09,3
8,06,5
Пример 3. Типовая характеристика чувствительности к дозе излучения при определении циклического ОМФ с применением ceлeнoмeтил-L-ceлeнoциcтeинoвoгo - селен - 75 - производного с сопряженными двойными связями 2-О-сукцинилциклического GMP.
Стандартные растворы, циклического СМФ, содержащие 5, 10, 24, 40, 80 и 16000 пикомоль в 100 мкл буферного раствора из 50 ммоль трис/ЭДТА (4 ммоль) с величиной рН 7,5, вносят пипеткой в пробирки, выдерживавшиеся при 2-4°С. Концентрация в 16000 пикомоль на 100 мкл использована для определения неспецифической связи. В одну из пробирок вносят 100 мкл буферного раствора для определения отсчета, соответствующего нулевой дозе. В каждую пробирку вносят селенометил-L - селеноцистеинового - селен-75-производного с сонряженными двойными связями 2-0 - сукцинилциклического ОМФ (0,59 пикомоль, удельная активность около 16,1 кюри/ммоль) в 50 мкл буферного раствора. Антитело сыворотки (против циклического ОМФ 2-сукцинил-В5А) в 50 мкл буферного раствора вводили во все пробирки. Содержимое пробирок быстро перемешивают вращательным движением и выдерживают в течение 3 ч при 2-4°С. Во все пробирки вводят по 1 мл водного раствора сульфата аммония (насыщенного на 60%) при 2-4°С и после перемешивания, пробирки выдерживают в течение 5 мин при 2-4°С и содержимое центрифугируют.
После декантации верхнего прозрачного слоя жидкости и удаления приставшей жидкости осадки используют для проведения отсчета для общей дозы используют 0,5 пикомоль селенометил-Ь-селеноцистенового производного с сопряженными двойными связями 2-О-сукцинилциклического ОМФ в 50 мкл буферного раствора.
Полученные результаты аналогичны приведенным в нримере 2 в представлены ниже.
доза циклического ОМФ, ц„кл «еск „ТоМР. пико.мольмеченый селеном-75. %
24,5
О 5 10 20 40 80
17,3
16,7
11,8
8,3
6,1
Пример 4. Оценка 6-метилселенопуринрибозид-3,5 - циклического монофосфата - селена-75 при использовании его в качестве радиоактивного лиганда при анализе насыщенности циклического АМФ. Вследствие низкой удельной активности
6-метилселенопуринрибозид - 3,5-циклического монофосфата - селена-75, его способность к образованию связи исследована путем применения соединения селена-75 в качестве конкурирующего ингибитора при
связывании тритиированного циклического АМФ со связывающим белком.
6-Метилселенопуринрибозид - 3,5-циклической монофосфат - селен-75 (удельная активность 6,65 мкюри/ммоль) растворяют в буферном растворе трис/ЭДТА для получения растворов с концентрацией 1156 пикомоль, 105 пикомоль и 9,6 пикомоль в аликвотной пробе 50 мкл. При нормальном испытании 100 мкл связывающего
белка выдерживают вместе с тритиированным циклическим АМФ (0,9 пикомоль) и немеченым циклическим AMP (стандартные и испытуемые растворы). Связанный и свободный меченый циклический АМФ разделяют путем поглощения свободного циклического АМФ на древесном угле и активность связанного вещества определяют путем проведения отсчета для пробы верхнего прозрачного раствора. Для определения
активности селенового аналога сначала определяют связывание при нулевой дозе, т. е. процент тритиированного циклического АМФ, связываемого без немеченого циклического АМФ или селенового аналога. Эту величину затем сравнивают со связыванием тритиированного циклического АМФ в присутствии четырех различных доз селенового аналога. На основании полученных результатов можно вычислить количества немеченого циклического АМФ, которые вызвали бы снижение степени связывания, равное тому, которое вызывается селеновым аналогом. Результаты, приведенные в таблице, показывают, что 9,6 пикомоль 6-метилселенопуринрибозид-З б - циклического монофоефата вызывают такое же вытеснение тритиированного циклического АМФ, как и 12,2 пикомоль циклического АМФ, т. е., что при применяемых концентрациях оба эти соединения обладают весьма сходной способностью к связыванию. 12 Формула изобретения Способ качественного и количественного определения циклических нуклеотидов, основанный на обработке определяемого циклического нуклеотида меченым специфическим к каждому нуклеотиду реагентом, выделении продукта реакции и определении количества связанного меченого реагента, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и сокращения времени анализа, в качестве меченого специфического реагента используют реагент, меченный селеном-75. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Kobagashi R., Fang V. S., «А sample and competitive protein -binding assay for cyclic GMP, Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol., 67, 1975, p.p. 493-500. 2.Oilman A. G. «A protein binding assay for adenosine 35-cycIic monophosphate, Procudings of the National Academy of seiences, USA, Vol. 67, 1970, p.p. 305-312.
