Способ получения полиадениловой и полиинозиновой кислот Советский патент 1989 года по МПК C07H21/00 C12P19/34 

Изобретение относится к биотехнологии и касается ферментативного синтеза высокополимерных гомополири- бонуклеотидов и может быть использовано в медицине, генетике и молекулярной биологии.

Целые изобретения является снижение себестоимости и улучшение качества за счет повышения биологической активности целевых продуктов.

Способ заключается в том, что используют смесь аденозин-5 -монофосфата (АМФ) и аденозин-5 -трифосфата (АТФ) в молярном соотношении (0,9-1,3):1, при этом процесс проводят в присутствии ферментной фракции E.coli, содержащей аценилаткина- зу и ацетаткиназу при температуре 12-15 с, рН 7,5-7,3. Вьщеление целевого продукта ос 1цествляют преимущественно трехкратным переосаждением калиевой соли полинуклеотида одним объемом этанола из буферного раствора фосфата калия, что позволяет упростить процесс вьщеления полиадени- ловой кислоты (поли-А) за счет сок4

00 сх

31470738

ращения числа стадий с 5 и до 3 и уменьшить трудоёмкость способа. Остановку реакции осуществляют преимущественно добавлением в реакционную смесь хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 2,5:1, что позволяет сохранить.высокую полимерность образовавшегося полинуклеотида, тем

10 г клеток E.coli MR ЕбОО суспендируют в 45 мл буфера А (0,05 моль/л трис-HCl рН 7,5, 2 ммоль/л ДТТ, 0,1 ммоль/л ЭДТА) и добавляют 20 мг лизоцима, растворенного в 1,5 мл буфера А. Смесь перемешивают 45 мин при 4±2°С и клетки разрушают в течение 3 мин с помощью

самым повысить качество целевого про-in ультразвукового дезинтегратора. За . ,- П с -- ОПв7

тем в смесь добавляют 2,5 мл 20%- ного раствора декстрана (мол.масса 500 тыс.) и 5 мл 40%-ного раствора полиэтиленгликоля (мол.масса 6 тыс смесь перемешивают 20 мин и центрифугируют в течение 15 мин при 3 тыс.об/мин. Верхнюю фазу сливают и замеряют концентрацию белка спект рофотометрическим методом. Обычно концентрация белка составляет 14 мг/мл. Выход ферментной фракции 50 мл или 700 мг,белка. Этого количества достаточно для получения 370 г поли-А,

дукта.

Предлагаемый способ получения высокомолекулярных поли-А и полиинози- новой кислот (поли-И) заключается в следующем. Готовят реакционную 15 смесь, содержащую АМФ и АТФ в моляр- ном соотношении (О,9-1,3):1, а также ионы магния, буфер трис-HCl рН 7,3-7,5, ацетилфосфат, ферментную фракцию E.coli и полинуклеотидфосфо- 20 рилазу (ПНФазу). Реакцию проводят при 12-15 с. Остановку реакции .осуществляют преимущественно добавлением смеси ;хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 2,5:1. Выделение 25 готового продукта осуществляют трехкратным осаждением калиевой соли одним объемом этанола из-буферного раствора фосфата калия.Для получения

тем в смесь добавляют 2,5 мл 20 ного раствора декстрана (мол.ма 500 тыс.) и 5 мл 40%-ного раст полиэтиленгликоля (мол.масса смесь перемешивают 20 мин и цен фугируют в течение 15 мин при 3 тыс.об/мин. Верхнюю фазу слив и замеряют концентрацию белка с рофотометрическим методом. Обыч концентрация белка составляет 14 мг/мл. Выход ферментной фрак 50 мл или 700 мг,белка. Этого к чества достаточно для получения 370 г поли-А,

Получение поли-А. Готовят р онную смесь, содержащую 1,3 ммо АМФ, 1,2 ммоль АТФ (соотношени 1,08:1); 0,02 моль трис-HCl рН 0,05 ммоль ацетилфосфата, 1 мм

полигИполиадениловую кислоту,содержа-30 хлористого магния, 20 мг азида

шуюся в реакционной смеси, подвергают дезаминированшо известным способом. Непрореагировавшие мономеры АМФ и АТФ йосле регенерации (отделения неорганического фосфата), например, на смоле АВ17 2 могут быть вновь использованы для синтеза поли-А). В результате получают препарат поли-А с мол.массой 200-250 тыс.Дальтон (коэффициент седиментации 14,8±0,3 S), общий выход полинуклеотида составляет 56-58%.

Известно использование ферментных фракций E.coli для синтеза различных компонентов нуклеиновых кислот, однако в предлагаемом способе ферментная фракция используется по другому функциональному назначению, а именно для осуществления сопряженных ферментативных фракций, ведущих к образованию поли-А из смеси АМФ и АТФ, что позволяет получить новый, неочевидный положительный эффект, заключающийся в повьш1ении степени поликонденсации и, следовательно, к повьш1ению молярной массы целевого продукта.

Пример 1. Приготовление ферментной фракции E.colj..

35

45

50

55

рия, 50 мкл ферментной фракции готовленной как описано выше) 0,5 мл препарата ПНФазы (150 е Добавляют дистиллированную вод объема 100 мл и смесь инкубиру 14°С. Степень превращения моно в полинуклеотид контролируют г фильтрацией на колонке с сефар 4В. При достижении максимально .превращения реакцию останавлив добавлением смеси хлороформа с амиловым спиртом-в соотношении и интенсивно перемешивают в те 30 мин. После центрифугировани си и отделения водного слоя к добавляют 1 моль/л калийфосфат буфера до конечной концентраци 0,1 моль/л и поли-А высаживают объемом охлажденного этанола. осаждение калиевой соли поли-А калийфосфатного буфера повторя дважды, затем поли-А растворяю воде и лиофильно высушивают. В составляет 1,1 ммоль включенны полинуклеотид (поли-А) мономер 480 мг. Спиртовый супернатант держащий непрореагировавшие мо ры, упаривают на ротационном рителе и регенерируют на коло

10 г клеток E.coli MR ЕбОО суспендируют в 45 мл буфера А (0,05 моль/л трис-HCl рН 7,5, 2 ммоль/л ДТТ, 0,1 ммоль/л ЭДТА) и добавляют 20 мг лизоцима, растворенного в 1,5 мл буфера А. Смесь пе, ремешивают 45 мин при 4±2°С и клетки разрушают в течение 3 мин с помощью

ультразвукового дезинтегратора. За . ,- П с -- ОПв7

тем в смесь добавляют 2,5 мл 20%- ного раствора декстрана (мол.масса 500 тыс.) и 5 мл 40%-ного раствора полиэтиленгликоля (мол.масса 6 тыс смесь перемешивают 20 мин и центрифугируют в течение 15 мин при 3 тыс.об/мин. Верхнюю фазу сливают и замеряют концентрацию белка спект- рофотометрическим методом. Обычно концентрация белка составляет 14 мг/мл. Выход ферментной фракции 50 мл или 700 мг,белка. Этого количества достаточно для получения 370 г поли-А,

Получение поли-А. Готовят реакционную смесь, содержащую 1,3 ммоль АМФ, 1,2 ммоль АТФ (соотношение 1,08:1); 0,02 моль трис-HCl рН 7,4, 0,05 ммоль ацетилфосфата, 1 ммоль

нат0 хлористого магния, 20 мг азида

5

5

0

5

рия, 50 мкл ферментной фракции (приготовленной как описано выше) и 0,5 мл препарата ПНФазы (150 ед.акт.) Добавляют дистиллированную воду до объема 100 мл и смесь инкубируют при 14°С. Степень превращения мономеров в полинуклеотид контролируют гель- фильтрацией на колонке с сефарозой 4В. При достижении максимального .превращения реакцию останавливают добавлением смеси хлороформа с изо- амиловым спиртом-в соотношении 2,5:1 и интенсивно перемешивают в течение 30 мин. После центрифугирования смеси и отделения водного слоя к нему добавляют 1 моль/л калийфосфатного буфера до конечной концентрации 0,1 моль/л и поли-А высаживают одним объемом охлажденного этанола. Переосаждение калиевой соли поли-А из калийфосфатного буфера повторяют дважды, затем поли-А растворяют в воде и лиофильно высушивают. Выход составляет 1,1 ммоль включенных в полинуклеотид (поли-А) мономеров или 480 мг. Спиртовый супернатант, содержащий непрореагировавшие мономеры, упаривают на ротационном испарителе и регенерируют на колонке со

51470738

смолой АВ17 2. Получают смесь АТФ, АДФ, АМФ и после добавления AJ№ (обычно 0,4 ммоль) до первоначального соотношения АМФ:АТФ, соответственно, 1,08:1 вновь используют в реакции биосинтеза поли-А. Дополнительно получают 0,64 ммоль поли-А. Общий выход поли-А составляет 58% к исходным мономерам. Молярная масса поли-А 200-250 тыс. Дальтон. Коэффициент седиментации равен 14,B±0,3S

Пример 2. Готовят реакционную смесь аналогично примеру 1 за исключением того, что исходные мономеры АМФ и АТФ берут в соотношении 0,9:1, а реакцию проводят при 12 С, при рН 7,3. В результате получают 1,730 ммоль поли-А (выход 56%) с молярной массой 200-250 тыс.Дальтон. Пример 3. Поли-А получают из смеси АМФ и АТФ аналогично примеру 1 за исключением того, что исходные и АТФ берут в соотношении 1,3:1, а рейкцию проводят при 15 С и при рН 7,5. В результате получают 1,733 ммоль поли-А (выход 57%) с молярной массой 200-240 тыс. Дальтон

Пример 4. Поли-А получают аналогично примеру 1 за исключением того, что исходные АМФ и АТФ берут в соотношении 0,8:1, а реакцию проводят при 8°С, при рН 7,0. В результате получают 1,470 ммоль поли-А (выход 49%) с молярной массой 150- 200 тыс. Дальтон.

Пример 5. Поли-А получают аналогично примеру 1 за исключением того, что исходные АМФ и АТФ берут в соотношении 1,6:1, а реакцию проводят при и при рН 7,8. В результате получают 1,290 ммоль поли-А (выход 43%) с молярной массой 180- 220 тыс.Дпльтон.

Пример 6. Получение поли-И. Получают поли-А аналогично примеру 1. Отделяют поли-А от непрореагировавших мономеров и растворяют в 10 мл буфера 0,1 моль/л трис-НС1 и рН 7,5, содержащего 1 ммоль/л хлористого магния и 1 ммоль/л ЭДТА, и добавляют 1,2 мл ледяной.уксусной кислоты. При непрерывном перемешивании небольшими порциями в течение 2- 3 ч прибавляют 1,2 г сухого нитрита

натрия. Перемешивание продолжают до достижения отношения оптических плотностей Г ,7. После чего смесь охлаждают до температуры (0-2) С, добавляют 1 моль/л фосфата

5 калия рН 7,0 и полинуклеотид осаждают одним объемом спирта (этанола). Дважды переосаждают поли-И из буферного раствора фосфата калия одним объемом этанола. В результате полу0 чают 1,39 ммоль поли-И с молярной - массой. 200-260 тыс.Дальтон.

Формула изобретения

5 Способ получения полиадениловой и полиинозиновой кислот, предусматривающий проведение ферментативной реакции из исходного субстрата-нукле- отида с помощью полинуклеотидфосфо0 рилазы с последующей ее остановкой смесью хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 2,5:1, и выделении целевого продукта осаждением полинуклеотида этанолом, отличающийся тем, что, с целью снижения себестоимости и улучшения качества за счет повышения биологической активности целевых продуктов, в качестве субстрата используют смесь .Q АМФ и АТФ в молярном соотношении (0,9-1,3):, при этом в него дополнительно вводят ферментативный комп- . леке из клеток штамма Eschrichia , coli MRE 600, содержащий аденил- аткиназу и ацетаткиназу, а ферментативную реакцию ведут при температуре 12-15 с и рН 7,3-7,5.

5

Использование: в химической промышленности. Сущность изобретения: в качестве субстрата используют смесь АМФ и АТФ в молярном соотношении (0,9-1,3):1, при этом в него дополнительно вводят ферментативный комплекс из клеток штамма МРЕ 600, содержащий аденилаткиназу и ацетаткиназу, а ферментативную реакцию ведут при температуре 12-15°С и пЕ 7,3-7,5.