СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ГЕПАТИТА В Российский патент 1995 года по МПК G01N33/53 A61K39/29 

Изобретение относится к способу получения поверхностного антигена гепатита В путем микробиологического синтеза, который может быть использован в медицинской промышленности для изготовления вакцины против гепатита В.

Известны вакцины против гепатита В на основе НВs-антигена из сыворотки доноров (J. med. Virol. 1982, 10, 65-74). Однако, такие вакцины небезопасны для человека, так как могут содержать инфекционные частицы гепатита В и могут быть контаминированы другими вирусами, например, ретровирусами, содержащимися в сыворотке.

Способ получения вакцин из сывороток является многостадийным, содержит 2-3 стадии инактивации, а выход поверхностного антигена не превышает 10%
Известен способ получения НВs-антигена из штамма-продуцента дрожжей, заключающийся в культивировании штамма-продуцента в среде с богатым содержанием фосфора, в переносе клеток в среду с низким содержанием фосфора для репродукции НВs-антигена с последующим отмыванием клеток на центрифуге с проточным ротором. Далее клеточную пасту, освобожденную от среды, разводят до исходного объема фосфатным буфером и разрушают клетки с помощью гомогенизатора высокого давления. Конечный продукт получают с выходом 29% и с содержанием примесного белка до 20% что делает его применение в качестве вакцины невозможным (РNAS, 1985, 82, 6830).

Наиболее близким к заявленному по совокупности признаков является способ получения рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В, включающий культивирование штамма-продуцента дрожжей в среде на стадии синтеза НВs-антигена не содержащей фосфат, и выделение антигена с использованием адсорбционной хроматографии на пористых кремнеземах с элюцией бикарбонатным буфером рН 9,1-9,5 с последующим центрифугированием в градиенте плотности 50% тартрат К(Na) 25% глицерин при соотношении компонентов 1:1. Недостатком данного способа является низкий выход поверхностного антигена гепатита В после стадии ферментации и разрушения (200-300 мкг антигена с 1 л ферментера) (А. с. СССР N 1389060, кл. МКИ А 61 К 39/29).

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение выхода поверхностного антигена гепатита В.

Способ получения рекомбинантного поверхностного антигена гепатита В включает в себя культивирование и инкубацию штамма-продуцента дрожжей на питательной среде с последующим разрушением клеток дрожжей и выделением целевого продукта НВsAg, отличием которого является то, что культивирование проводят на питательной среде, содержащей пептон и дрожжевой экстракт с конечной суммарной концентрацией неорганического фосфора 40-200 мг/л, а инкубацию проводят на питательной среде, содержащей пептон и дрожжевой экстракт с конечной суммарной концентрацией неорганического фосфора 5-50 мг/л.

Использование на стадии культивирования дрожжей и биосинтеза антигена питательной среды, лимитированной по неорганическому фосфору, позволяет получать оптимальный выход антигена независимо от вида сырья.

Использование питательной среды как на стадии выращивания биомассы, так и на стадии биосинтеза антигена, с содержанием неорганического фосфора в количестве, выходящем за пределы оптимальных значений предлагаемого способа, не приводит к получению антигена с хорошим выходом.

При культивировании используют штамм дрожжей, содержащий рекомбинантную плазмиду с геном НВsAg и способную продуцировать иммуногенный НВsAg. В качестве такого исходного штамма может быть использован любой штамм дрожжей продуцент НВsAg, например, штамм Saccharomyces cerevisiae DBY 746/pNMVG-46, полученный включением трансформированной плазмиды рNMVG-46 в реципиентный штамм DBY 746. Плазмида рNMVG-46 получена путем генноинженерной модификации из известной плазмиды рADG47 (Мол. генетика, микробиология и вирусология, 1986, N 8, N 12-19).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. В биореактор с рабочим объемом 10 л, содержащим 9 л стерильной среды состава, мас. пептон из кислотного гидролизата казеина (отечественный) с исходным содержанием неорганического фосфора 0,5-0,6 мг/г 3,0; экстракт дрожжевой (отечественный) с исходным содержанием неорганического фосфора 2,0-2,5 мг/г 1,0; глюкоза 2,0, содержащей фосфора неорганического 40-42 мг/л, при рН 5,0-5,5 вносят культуру дрожжей S.c. DBY 746/pNMVG-46 в количестве 1,0 л, выращенную на минимальной среде (см. приложение 1) и имеющую титр клеток 4,1˙10⁷ см³ культуральной жидкости. Культивирование ведут при температуре 29+1^оС в течение 20 ч. Получают накопительную культуру с титром клеток 2,0˙10⁸ кл/см³ культуральной жидкости.

Культуру клеток в количестве 10 л переносят в биореактор с рабочим объемом 100 л, содержащий 90 л стерильной питательной среды состава, мас. пептон из кислотного гидролизата казеина (отечественный) с исходным содержанием неорганического фосфора 0,5-0,6 мг/г 1,5; экстракт дрожжевой (отечественный) с исходным содержанием неорганического фосфора 2,0-2,5 мг/г; глюкоза 2,0, соли, микроэлементы, витамины (см. приложение 2), содержащей фосфора неорганического 5,0-6,0 мг/л при рН 5,5-6,0. Культивирование ведут при температуре 30^оС в течение 22 ч.

Культуральную жидкость с содержанием клеток 1,4˙10⁸ кл/см³ подают на проточную центрифугу типа Westfalia со скоростью протока 500 л/ч. Клеточную пасту освобождают от среды промыванием 0,05 М карбонатным буфером с рН 9,0 методом микрофильтрации с использованием мембранных фильтров с диаметром пор 0,2-0,45 мкм либо трехкратной отмывкой в буфере того же состава с последующим отделением биомассы на проточной центрифуге типа Westfalia при скорости протока 500 л/ч. Получают 1,2 кг биомассы, которую суспендируют в 10 л карбонатного буфера состава: 0,05 М Na₂CO₃ NaHCO₃, 0,15 M NaCl, 10 mM ЭДТА, 0,2 мМ фенилметилсульфонилфторида и 0,3% Тween-20. Разрушают с помощью гомогенизатора типа Gaulin APV при давлении 600-700 атм в 3 цикла. Получают 15 л осветленного гомогенизата, в котором определяют содержание антигена. Титр антигена составляет 20 мкг/мл осветленного гомогенизата. Выход антигена 3,0 мг с одного литра культуральной жидкости. Содержание НВsAg определяют методом иммуноферментного анализа с использованием наборов Abbott Auszyme II. Антигенную активность измеряют в мкг/мл, используя в качестве стандарта отраслевой стандартный образец активности НВsAg (ОСО 42-28-153-88), выпускаемый ГИСК им. Л.А. Тарасевича. На электрофореграммах в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях рекомбинантный антиген представлен в виде полосы мономера 24 kD. Иммуноспецифичность этой полосы показана методом иммуноблоттинга с использованием коммерческих анти-НВs, меченных йодом-125.

П р и м ер 2. В биореактор с 9 л стерильной питательной среды состава, мас. пептон (фирмы ДИФКО) с исходным содержанием неорганического фосфора 4,5-5,0 мг/г 2,0; экстракт дрожжевой (фирмы ДИФКО с исходным содержанием неорганического фосфора 10-11 мг/г 1,0; глюкоза 2,0, содержащей фосфора неорганического 195-200 мг/л, при рН 5,0-5,5 вносят культуру дрожжей в количестве 1 л, выращенную на минимальной среде (см. приложение 1) и имеющую титр 4,4˙10⁷ кл/см³ культуральной жидкости. Культивирование ведут при температуре 29+1^оС в течение 24 ч. Получают накопительную культуру с титром 2,8˙10⁸ кг/см³ культуральной жидкости.

Культуру клеток в количестве 10 л переносят в биореактор, содержащий 90 л стерильной питательной среды состава, мас. пептон (фирмы ДИФКО) с исходным содержанием неорганического фосфора 4,5-5,0 мг/г 1,0; экстракт дрожжевой (фирмы ДИФКО) с исходным содержанием неорганического фосфора 10-11 мг/г 0,1; глюкоза 2,0; соли, микроэлементы, витамины (см. приложение 2), содержащей фосфора неорганического 50 мг/л, при рН 5,5-6,0. Культивирование ведут при температуре 30^оС в течение 24 ч.

Культуральную жидкость, содержащую 2,0˙10 ⁸ кл/см³, подвергают обработке аналогично описанному в примере 1.

Вес сырой биомассы составляет 1,5 кг; объем осветленного гомогенизата 15 л, титр антигена 22 мкг/мл осветленного гомогенизата. Выход антигена с одного литра культуральной жидкости составляет 3,3 мг.

П р и м е р 3. Процесс ведут аналогично примеру 2; на стадии выращивания биомассы используют питательную среду с содержанием неорганического фосфора 300 мг/л. Среду готовят из 2,0 мас. пептона с исходным содержанием неорганического фосфора 8,0 мг/г и 1,0 мас. экстракта дрожжевого с исходным содержанием неорганического фосфора 15,0 мг/г. На стадии биосинтеза антигена используют питательную среду с содержанием неорганического фосфора 100 мг/л, составленную из 1,0 мас. пептона и 0,1 мас. экстракта дрожжевого с вышеуказанным содержанием исходного неорганического фосфора. Получают 1,8 кг сырой биомассы; биосинтез антигена при этом отсутствует.

П р и м е р 4. В биореактор с 9 л стерильной питательной среды состава, мас. сернокислотный гидролизат казеина (отечественный) с исходным содержанием неорганического фосфора 2,0-2,5 мг/г 2,0; экстракт дрожжевой (отечественный) с исходным содержанием неорганического фосфора 5,0-6,0 мг/г 1,0; глюкоза 2,0, содержащей фосфора неорганического 100 мг/л, при рН 5,0-5,5 вносят культуру дрожжей в количестве 1 л, выращенную на минимальной среде (см. приложение 1) и имеющую титр 4,3˙10⁷ кл/см³ культуральной жидкости. Культивирование ведут при температуре 29+1^оС в течение 20 ч. Получают накопительную культуру с титром 2,2˙10⁸ кл/см³ культуральной жидкости.

Культуру клеток в количестве 10 л переносят в биореактор, содержащий 90 л стерильной питательной среды состава, мас. сернокислотный гидролизат казеина (отечественный) с исходным содержанием неорганического фосфора 2,0-2,5 мг/г 1,0; экстракт дрожжевой (отечественный) с исходным содержанием неорганического фосфора 5,0-6,0 мг/г 0,1; глюкоза 2,0; соли, микроэлементы, витамины (см. приложение 2), содержащей фосфора неорганического 25-30 мг/л, при рН 5,5-6,0. Культивирование ведут при температуре 30^оС в течение 24 ч.

Получают культуральную жидкость с титром клеток 1,7˙10⁸ кл/см³. Отделение, отмывку биомассы от остатков питательной среды, разрушение биомассы клеток и осветление гомогенизата проводят аналогично описанному в примере 1.

Вес сырой биомассы составляет 1,35 кг. Получают 15 л осветленного гомогенизата с титром антигена 21 мкг/мл. Выход антигена с одного литра культуральной жидкости 3,15 мг.

П р и м е р 5. В биореактор, содержащий 9 л стерильной питательной среды состава, мас. пептон (отечественный) с исходным содержанием неорганического фосфора 0,05 мг/г 3,0; экстракт дрожжевой (отечественный) с исходным содержанием неорганического фосфора 4,0-5,0 мг/г 1,0; глюкоза 2,0, содержащей 40 мг/л фосфора неорганического при рН 5,0-5,5 вносят культуру дрожжей и проводят культивирование как описано в примере 1. Титр клеток на стадии выращивания биомассы составляет 1,8˙10⁸ кл/см³ культуральной жидкости.

Культуру в количестве 10 л переносят в биореактор с рабочим объемом 100 л, содержащий 90 л стерильной питательной среды состава, мас. пептон (отечественный) с исходным содержанием неорганического фосфора 0,05 мг/г 3,0; экстракт дрожжевой (отечественный) с исходным содержанием неорганического фосфора 4,0-5,0 мг/г 0,1; глюкоза 2,0, соли, микроэлементы, витамины (см. приложение 2), содержащую фосфора неорганического 4-5 мг/л при рН 5,5-6,0. Культивирование ведут при температуре 30^оС в течение 24 ч. Культуральную жидкость с титром клеток 1,4˙10⁸ кл/см³ подвергают переработке аналогично описанному в примере 1. Получают 1,15 кг сырой биомассы; 15 л осветленного гомогенизата с титром антигена 18 мкг/мл. Выход антигена с одного литра культуральной жидкости составляет 2,7 мг.

П р и м е р 6. В биореактор, содержащий 9 л стерильной питательной среды состава, мас. пептон (отечественный) с исходным содержанием неорганического фосфора 0,05 мг/г 0,5; экстракт дрожжевой с исходным содержанием неорганического фосфора 2,0-2,5 мг/г 0,1; глюкоза 2,0, содержащей 2,0 мг/л фосфора неорганического при рН 5,0-5,5 вносят культуру дрожжей и проводят культивирование как описано в примере 1. Титр клеток на стадии выращивания биомассы 5,0˙10⁷ клеток/см³ культуральной жидкости.

Культуру в количестве 10 л переносят в биореактор с рабочим объемом 100 л, содержащий 90 л стерильной среды состава, мас. пептон (отечественный) с исходным содержанием неорганического фосфора 0,05 мг/г 0,1; экстракт дрожжевой 2,0-2,5 мг/г 0,1; глюкоза 2,0, соли, микроэлементы, витамины (см. приложение 2), содержащую фосфора неорганического 2,0 мг/л при рН 5,5-6,0. Культивирование ведут при температуре 30^оС в течение 24 ч. Культуральную жидкость с титром клеток 1,0˙10⁷ в см³ подвергают переработке аналогично примеру 1. Получают 0,110 кг сырой биомассы и 15 л осветленного гомогенизата с титром антигена 1,5 мкг/мл. Выход антигена с одного литра культуральной жидкости 0,225 мг.

Примеры 3 и 6 показывают, что использование питательной среды на стадии выращивания биомассы и биосинтеза антигена с содержанием неорганического фосфора в количестве, выходящем за пределы оптимальных значений, не позволяет получать антиген с хорошим выходом.

Таким образом, предложенный способ позволяет получать рекомбинантный поверхностный антиген гепатита В с хорошим выходом при использовании сырья различного происхождения.

П р и л о ж е н и е 1 Состав, мас. KH₂PO₄ 0,100 NaCl 0,010 CaCl₂ безводный 0,020 MgSO₄˙7H₂O 0,102 (NH₄)₂SO₄ 0,500 Глюкоза 2,00 Р-р микроэлементов 0,50 мл/л Р-р витаминов 1,00 мл/л Дистил. вода До 100,0
Раствор микроэлементов Состав, мг% KJ 20,0 H₃BO₃ 2,0 MnSO₄ 2,0 MoO₄(NH₄)₂ 2,0 FeSO₄ 10,0 Дистил. вода До 100 мл
Раствор витаминов Состав, мг% Тиамин хлорид 20,00 Пиридоксин 20,00 Рибофлавин (мононуклеотид) 20,00 Пантотенат кальция 20,00 Никотиновая кислота 20,00 п-Аминобензойная кислота 20,00 Биотин 0,20 Инозитол 1000,0 Дистил. вода До 100 мл
П р и л о ж е н и е 2 Состав, мас. KCl 0,100 NaCl 0,010 CaCl₂ безводный 0,020 MgSO₄˙7H₂O 0,102 (NH₄)₂SO₄ 0,500 Р-р микроэлементов 0,50 мл/л (см. приложение 1) Р-р витаминов 1,00 мл/л (см.

приложение 1)

Использование: в области биотехнологии, в частности для получения поверхностного антигена гепатита B. Сущность изобретения: рекомбинантный поверхностный антиген гепатита B получают путем культивирования штамма-продуцента дрожжей на питательной среде, состоящей из пептона и дрожжевого экстракта, и содержащей 10-200 мг/л неорганического фосфора, с последующей инкубацией антигена на питательной среде, содержащей 5-50 мг/л неорганического фосфора.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ГЕПАТИТА В, включающий культивирование и инкубацию штамма-продуцента дрожжей на питательной среде с последующим разрушением клеток дрожжей и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что культивирование проводят на питательной среде, содержащей пептон и дрожжевой экстракт, с конечной суммарной концентрацией неорганического фосфора в питательной среде 40-300 мг/л, а инкубацию проводят в питательной среде, содержащей пептон и дрожжевой экстракт, с конечной суммарной концентрацией неорганического фосфора в питательной среде 5-50 мг/л.