Штамм бактерий VIвRIо наRVеYI - продуцент индуцибельной L-лизиндекарбоксилазы Советский патент 1991 года по МПК C12N9/88 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и представтяет гобои нопыи штамм бактерии, продуцирующим инду- цибельную 1,-лизиндекарбоксилячу и может быть испольтоп.чю микробиологической промышленностью.

Цель изобретения - выявление более активного штамма-продуцента ин- дуцибельной 1-лнзинлекарбокситлчп Vibrio harveyi 107 (ИКМ B1714D), при- надлежатего другому систематическому классу.

Штамм существенно отличается от известного тем, «то он является строгим галофилом (не растет без Nad) и для получения ферментного чкстрак- та, клетки рачрушпют осмотическим шоком. Штамм Vibrio harveyi 107 выделен из вол Японского моря. Он характеризуется слелующимн признаками.

Морфологические признаки. Правиль- ные слегка и-чогнутые палочки размером 0,5-0,,4-2,6 мкм. Капсул, эндоспор или микроцист не образует. Грям- отрицательны. Р жидкой среде подвижны за счет наличия одного очехленного полярного жгутика.

Культуральные свойства. Рост бактерий Vibrio harveyi 107 на различных агариэованньгх средах при 30°С после 24 ч кутьтивированих представлены в табл.1.

На всех агаризованных питательных средах колонии круглые, желтовато- коричневые, прозрачные, блестящие с правильными краями.

Физиологические свойства. Птамм является факультативным анаэробом. д Оптимальная температура роста 28-32 f Температурные границы роста 5-7 и

3

3162

40-45 С. Восстанавливает нитраты до -нитритов. Реакция на оксидазу положительная. Выделяет хитиназу, амилазу, липазу, желатиназу. Обладает люминесценцией в сине-зеленой области спектра. Не способен накапливать поли &-оксибутират. Растет на синтетиче- ской среде, содержащей D-глюкозу и . Усваивает глюкозу, фруктозу, галактозу, мальтозу, сахарозу, маннит глицерин. Усваивает пептон, дрожжевой экстракт, а также соли аммония. Не нуждается в органических факторах роста. Содержит 46 мол.% ГЦ-пар в ДНК. Хемоорганотороф. Для роста и люминесценции необходимо присутствие в среде ионов натрия Оптимальная концентрация хлористого натрия 2,5- 3,0%. Признаки штамма устойчивы.

Музейная культура хранится в пробирках на полужидкой агариэованной среде Егоровой (пример 3) под ва зе- линовым маслом. Она хорошо сохраняется в течение 2-3 лет.

Пример 1. Для получения ино- кулята музейную культуру Vibrio har- veyi 107 пересевают на питательный агар (ПА) с 3% NaCl в чашки Петри и инкубируют в термостате при 30 С 24 ч Оживленную культуру пересевают в пробирку на косяки ПА с 3% NaCl и инкубируют 24 ч при 30°С. Затем культуру заливают 5 мл среды F 1. Полученную суспензию клеток засевают в кони- ческие колбы емкостью 250 мл со 100мл среды № 1. Культуру выращивают 18 ч при .

Для получения биомассы Vibrio har veyi 107 штамм выращивают на традици онной среде № 1 для данного вида, дополнительно добавляя кормовой лизин, как индуктор, г/л:

Пептон10,0

Кормовой лизин 8,0

Глюкоза2,0

Цитрат натрия 0,65

Nad30,0

Мр,804-7Р400,2

(.° 5

KFaP045,3

NazHP04.2,3

Дистиллированная

водаДо 1 л

рН6,0+0,2

Питательную среду разливают по 500 мл в конические колбы емкостью 750 мл и стерилизуют 30 мин при 0,5 атм. Стерильную питательную сре

0

5

0

Q

5

0

5

ду засевают инокулятом - культурой V.harveyi 107 в количестве 5% (по объему). Выращивание продуцента в -колбах проводят согласно известным условиям (начальный рН среды 6,0+. +.0,2, температура культивирования 30 С, без встряхивания колб в термостате) до выхода биомассы 0,22мг/мл питательной среды. Биомассу бактерии отделяют центрифугированием на центрифуге ЦЛС-3 при 4000 об./мин в течение 10 мин. Биомассу промывают 3%- ным NaCl и заливают 50 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 5,75 охлажденного до 4°С. R -экстракте определяют L-лизинлекарбоксилазную (ЛДК) активность манометрическим методом в аппарате Варбурга.

За единицу ДИК-активностн принимают такое количество фермента, который при 37°Г. и рН реакционной смеси 5,75 через 1 мин от субстрата (0,025 М) отщепляет 1 мколь ГОг. ЛДК-активность выражают единицами в пересчете на 1 мг сухих клеток и в мг белка (специфическая активность). Белок определяют методом Бредфорда.

Пример 2. Для получения биомассы культуру Vibrio harveyi 107 выращивают на традиционной среде для данного вида, дополнительно добавляют как индуктор кормовой лизин, г/л:

Пептон10,0

Кормовой лизин 8,0

Глюкоза3,0

NaCl30,0

MgSCV/H O0,2

ОШАНИН0,5

,3

Na2HP042,3

Дистиллированная

водаДо 1 л

РН6,0+0,2

Способ приготовления среды, условия культивирования продуцента и определения активности как в примере 1.

Пример 3. Для получения биомассы культуру Vibrio harveyi 107 выращивают на традиционной среде для данного рода следующего состава, дополнительно добавляя как индуктор кормовой лизин, г/л:

Пептон 10,0

Кормовой лизин 8,0

NaCl.30,0

MgS04-7HtO0,5

КНгНР041,0

Рыбная вытяжка 0,5 л Водопроводная вода До 1 л рН6,0±0,2

Способ приготовления питательной среды, условия культивирования продуцента, определение активности, как в примере 1.

Предлагаемая культура на известной среде не росла, так как п ней отсутствует NaCl. При добавлении в известную среду 37 NaCl культура росла, но выход биомассы и ЛДК-актив- ность была ниже и составляла 6,75 ед./мг сухих клеток и 21,6 ед./мг белка.

В табл.2 приведены данные о лизни декарбоксилаэнон активности штамма Vibrio harveyi 107 и известного Esch richia coli MRE 600. Как видно из табл.2, предлагаемый ттамм Vibrio

to

-2C

22394А

harveyi 107 отличается от известного в 2,14-2,24 раза большей ЛДК-ак- тивностью в 1 мг сухих клеток. Кро- е ме того, время культивирования сокращается на 2 ч. Данное преимущество может существенно уменьшить себестоимость ферментного препарата при его изготовлении. Ферментный препарат L-лизиндекарбоксилаэы может быть использован при определении L-лиэина. Для получения определенного количества ферментного препарата уменьшается число ферментация, расход пара и электроэнергии, что делает штамм выгодным для применения в промышленных условиях. Формула изобретения

15

Штамм бактерий Vibrio harveyi BKM В-1 714D - продуцент индуцибельной 1.-ли- зиндекарбоксилазы.

а б л и ц а 1

Ияобретгние относится к бтютех- нопогин, я частности к получению нопого штамма, обладлкцчего пыс1жой L-личинтекарбоксилл тион активностью, и можгт быть ис польяопапо при определении I-личина. Штамм Vibrio har- cyi BKMB-1714 D (107) пылелон in под Японского моря. 11тамм проявляет высокую активность индуиибсгп ной I -ли- эипдеклрбоксилп П 11,8-12,5 ед./мг сухом бактериальном биомассы и 44- 59 ед./мг OPJIK.T. Ь1тамм сохраняет активность при хранении его под вазелиновым маслом и в лиофилизированном состоянии. 2 табл. с Ј С С

Агаризованная среда Кгоровой (пример 3)1,5-2,0

Питательный агар сухой (гидролизат кильки)+37 Nad1,0-1,5

Лгаризоплнная полу- синтетическая среда (пример 2)0,8-1,0

Мясо-пептонный бульон + 3% NaCl0,5-0,6

Таблица 2