Способ получения антигенно измененных вируса гриппа Советский патент 1979 года по МПК C12K7/00 

Изобретение относится к области медицины и касается вирусологии.

Известен способ получения антигенно измененных вариантов вируса гриппа путем введения в куриный эмбрион иммунной сыворотки к вирусу гриппа и вируса гриппа с последующей инкубацией и выделением целевого продукта 1.

Однако такой способ не позволяет вызвать повышение иммуногенности и стабильные изменения свойств у различных штаммов вируса гриппа.

Целью настоящего изобретения является стабилизация иммуногенных свойств вируса гриппа.

Для этого куриные эмбрионы предварительно пассивно и.ммунизируют изологичной иммунной сывороткой по всем подтипам вирусов гриппа и затем через 24-28 час вводят вирус гриппа. Вирус гриппа вводят в дозе ЭЙД (эмбриональных инфекционных доз).

Способ осуществляют следующим образом.

Изологические иммунные сыворотки вводят в эмбрион в определенные сроки (не менее чем за 24 час до введения вируса).

Этот прием обеспечивает равномерное распределение антител в жидкостях и на поверхности чувствительных клеток куриного эмбриона, в силу чего антитела могут воздействовать на вирус не только в фазе адсорбции и прикрепления к поверхности клеток, но и в фазе выхода вирионов из них. Этот прием предотвращает проявление феномена разведения. Для введения в эмбрион используется смесь иммунных изологических сывороток к представителям всех подтипов вируса, циркулировавщих до выделения направленно изменяемого штамма.

Цель этого приема - предотвратить реверсию свойств вариантов в сторону штаммов-предшественников и направить изменение свойств по пути, близкому естественному процессу изменчивости. Вирус, который подвергается направленному воздействию, вводится в пассивно иммунизированный эмбрион неразведенным, т.е. в систему вносится ЭЙД.

Этот прием позволяет вводить в пассивно иммунизированные эмбрионы весь набор

частиц, из которых под влиянием антител сохраняют свою активность наиболее жизнеспособные или атипичные по сравнению с основной массой варионов исходной популяции.

Контроль дозы сыворотки в пассивно иммунизираванном эмбрионе осуществляется: по уровню антигемагглютининов в жидкостях эмбриона непосредственно перед введением вируса; по силе их нейтрализующего воздействия в пассивно иммунизированном эмбрионе через 48-72 час после введения вируса.

Изменение свойств вируса (повыщение или понижение его иммуногенности) регулируется количеством введенной в эмбрион сыворотки, которое контролируется по выщеуказанному методу, а также кратностью воздействия иммунными сыворотками.

Пример. I. Отбор штаммов вируса и получение изологических иммунных сывороток.

Изологические иммунные сыворотки (петушиные) готовят по методу Srnedei к изменяемому вирусу и представителям вирусов-пред1пественников. Например, если изменяемы.м вирусо.м является пггамм А2 Гонконг/1/68, то помимо вируса для иммунизации петухов испо.;1ьзуют предшествен 1ики: АО (свиней), АО (Шкл), А1 (Пан, Скандинавия), А2 (Сингапур, Одесса, Ленигнад) или другие, близкие им по свойствам штаммы.

П. Пассивная иммунизация куриных эмбрионов 9-10 срока инкубации, выбор и контроль дозы иммунных сывороток в эмбрионе.

Концентрация антител в жидкостях эмбриона должна приближаться к «фоновому уровню антигемагглютининов к вируса.м-пред шественникам в сыворотках крови . При этом, однако, эмбриональные жидкости должны содержать антитела в титре не менее 1:10.

Заданную концентрацию антител в пассивно иммунизирова.чпых эмбрионах получают при введении количества сыворотки, которое определяют путе.м предварительных расчетов, исходя из титра сывороток и усредненного веса э.мбриональной жидкости и эмбриона с оболочками. Правильность расчетов контролируется определением уровня антиге.магглюти инов в жидкостях эмбрионов через 24-48 час после пассивной и.ммунизации и г ыращивания в термостате. Например, для того, чтобы в жидкостях эмбрионов антиге.магглютинины содержались в пределах титров :10-1:20, в каждый эмбрион вводят по 0,16 мл изологической сыворотки с титром специфических антиге.магглютининов 1:1280. Через 24-48 час инкубации и последующего охлаждения титры антител в жидкостях при контрольном определении в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) составляют от 1:8-1:16.

Заданная концентрация антигемагглютининов в жидкостях эмбриона является исходной. Поскольку было установлено, что концентрация сыворотки в пассивно иммунизированном эмбрионе определяет свойства селекционируемых вирусов, то последующие этапы работы предусматривают контроль ее содержания не только по уровню антиге.магглютининов в жидкостях эмбрионов, но и по силе их нейтрализующего воздействия на вирус.

Для того, чтобы осуществить указанные контроли, отбирают количество сывороток, необходимое для пассивной иммунизации 20 эмбрионов. Сыворотки смешивают. В каждый H:i 10 эмбрионов вводят 1/20 часть приготовленной смеси. Оставн уюся смесь сывороток разводят изотоническим растворо.м поваренной соли с коэ()фициентом 2 до титр (но конечному разведению в эмбриональной жидкости перед :)аражением, т.е. неразведенная эмбрио1 алы1ая жидкость после 24 - 48 час пассивно иммунизированнь кх эмбрионов ;1.олжна тормозить 4 гемагглютинирующие еди1п-1цы - ГАИ изменяемого вируса). Каждым раз1 е;1ением смеси сывороток пассивно иммунизируют по 10 эмбрионов.

Через 24 или 48 час по 5 эмбрионов, которым были введены различные разведения с)1вороток, вскрывают, и в РТГА с жидкостью каждого эмбриона опреде.шют содержание антигемагтлютининов к из.ме 1яемому вирусу и вирусам-нре.инественникам. Жидкости контрсхлируют также на стерильность.

III. Заражение пассивно иммунизированных куриных э.мбрионов. Определение режимов се, в соответствии с задачами исследований.

Оставшиеся эмбрионы (но 5 эмбрионов, laccHBHO иммунизированных неразведенными сыворотка.ми и сыворотками в разведениях) заражают 0,2 мл цельной вируссодержан1.ей жидкости изменяемого вируса (в каж;1ый эмбрион вводят 2. К)---2.1 О- эмбриональных инфекцноншзкх доз - ЭИ/1 - изменяемо1о вируса).

Заражен1И11е пассивно им.мунизнрованные эмбрионы через 48-72 час инкубации при 35--36°С охлаждают, вскрывают и исследуют в реакции гемаилютинации (РГА) с 1°/о взвесью эритроцитов кур. Контролируют на бактериальную стерильность, я Из лишенных бакзагрязнения жидкостей пассивно иммунизированных зараженных эмбрионов готовят смеси (смесь состоит из жидкостей эмбрионов, нассивно им.мунизированных каждым разведением сывороток).

Смеси э.мбриональных жидкостей, соответствуюн;ие разведениям сывороток, контролируют на содержание вируса методом предельных разведений. При отсутствии инфекционной активности неразведенного материала его пассируют трехкратно на куриных эмбрионах неразведенным.

Последующие воздействия сыворотками на изменяемый вирус проводят, исходя из задач исследований.

Получение вариантов.

В случае необ.ходимости получения на конечны.х этапа.х вариантов со сниженной иммуногенностью и изменивпшмися антигенными взаимоотношениями, для последующих воздействий применяют концентрации сывороток, которые снижают инфекционность изменяемого вируса в пассивно иммунизированных эмбрионах в сравнении с вирусом, пассированным в «нормальных эмбрионах, в раз, т.е. при последующем пассировании на куриных эмбрионах материала из зараженных пассивно иммунизированных эмбрионов вирус удается выявить в следую цих случаях: а) остаточная инфекционность проявляется при разведении жидкости в 10 раз; б) вирус удается выявить в неразведенной жидкости пассивно иммунизированного за|)аженно -о эмбриона; в) инфекционность вируса проявляется на 2-3 пассаже в куринсзм эмбр1-юне. (Первый тип воздействий ).

В случае необходимости получения вариантов вируса с повышенной и.ммуногенностью, высокой ре фодуктивной и гемагглютинирующей активностью, стимулирующих при иммунизации образование с более umpOKiiM спектром реагирования, чем исходный вирус, для последующих воздействий применяют концентрации сывороток, которые снижают инфекционную активность изменяемо10 вируса в пассивно им.мунизмрозанном эмбрионе в 10 -10 раз. (Второй тип воздействий).

После одного нассажа на куриных э.мбрионах вирусы, подвергн иеся воздействиям как но iiepBOMV, так и но второму типу, восстанавливают инфекционную и гемагглютипирующую активность, при этом инфекционная акт.ивность при последующих пассажах становится более высокой, чем у исходного вируса.

После ;1ассажа на куриных эмбрионах вирусы подвергают повторному воздействию сывороткам в пассивно и.чмунизированных эмбрионах со;)тветственно по первому и второму типу.

Проверяют ин(1екционную активность вируса после в .горО1чэ воздействия в пассивно иммунизи1)оваи11ом эм б пионе.

При воздействиях по первому типу - в случае повыщения остаточно: инфекционной активности для куриных эмбрионов изменяемого Biipyca после второго пассажа более чем в 10 раз, дозу иммунных сывороток, вводимых в эмбрион, увеличивают до подавляюи.ей инфекционную активность в раз.

По второму типу - воздействия проводят установленной первоначально дозой.

Свойства полученных вариантов проверяют с помощью общепринятых методов.

Количество воздействий иммунными сыворотками в пассивно иммунизированных эмбрионах проводят в соответствии с поставленной задачей.

Повышение иммуногенности происходит после 1-го - 3-х воздействий как по первому, так и по второму типу. Последующие воздействия по первому типу резко снижают иммуногенность вируса (по антителобразованию в течение 2-3 недель после иммунизации). При этом снижается также авидность вируса и изменяются его антигенные взаи.моотнощения с исходным вирусом и родственными вариантами.

Второй тип воздействий, помимо повыщения иммуногенности. вызывает стойкое повы1пение репродукт1 вной и гемагглютинирующей активности популяции вируса и вызывает образование антител с более широким спектром реагирования в РТГА.

Формула изобретения

1.Способ получения антигенно измененных вариантов вируса гриппа путем введения в куриный эмбрион иммунной сыворотки к вирусу гриппа я вируса гриппа с последующей инкубацией и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью стабилизации иммуногенных свойств вируса гриппа, куриные эмбрионы предварительно нассивно иммунизируют изологичной иммунной сывороткой по всем подтипам вирусов гриппа и затем через 24-48 час вводят вирус гриппа.

2.Способ по п. 1. отличающийся тем, что вирус гриппа вводят в дозе Ю- 108 ЭЙД.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. ЖМЭП, 10, 1954, с. 44.