Способ ковалентной иммобилизации физиологически активных соединений Советский патент 1979 года по МПК A61K38/28 C08F4/04 

(54) СПОСОБ КСВАЛЕНТНСЙ ИММОБИЛИЗАЦИИ

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

в амилазидные, что существенно изменяет природу исходного полимера. По- ливинилймидаэол воойце нельзя применять по этому способу. Кроме того избыточное количество реакционноспособных групп на полимере, оставшихся после реакции с физиологически активным соединением, должно быть инактивировано во избежание побочных реакций с последним, что также ведет к изменению свойств физиологически активного соедииения. Кроме того избыточные реакционноспособные группы на полимере неизбежно ведут jc внутри- илимekмoлeкулярным сшивкам физиологически активных соединений, что, как правило, снижает акти ность полимерных модификаций физиологически активных соединений.

Известен также способ ковадентной иммобилизации физиологически активных соединений введением в последние винильной группировки при реакции, например, физиологически;активного соединения с хлорангидридом акриловой кислоты, с последующей полимеризацией (сополимеризацией) винильного производного физиологически активного соединения методами полимерной химии, например, при инициировании полимеризации винильных групп мономеров (физиологически активных веществ, содержащих винильные группировки) УФ- облучением или обычными инициаторами радикальной полимеризации з.

Этот способ обладает пониженной реакциоиноспособностью двойной связи на физиологически активном соединении, которая не позволяет получать полимеры с регулируемой концентрацией физиологически активной составляющей в коньюгате, поскольку в случае сополимеризаци обычных виниловых мономеров с мономером физиологически активным веществом вследствие огромной разницы в константах сополимеризации, получаются койьюгаты, обогаще.нные обычным винильным мономером.

Цель изобретения - расширение ассортимента иммобилизующих виниловых мономеров и упрощение способа, которое СОСТОИТ в том, Что азо-связь, введенная в высокомолекулярное физиологически активное соединение, позволяет более широко регулировать соотношения физиологически активной компоненты и полимерной компоненты в иммобилизованном образце. . ,,,... Это достигается тем, что инициатора используют соеди

формулы

(l-:tr iif-C-R / т ТI

игн,

(JH,

«HS

L-R

ХА)

(1Нз

CHj

I

I

г-н

БН2

(-С--|{ :н-с-С

ли

/

I

к

1SH

.1

сн.

dH,

в

(Б

где Т - остаток физиологически активного соединения;

амидная или сложноэфирная . rpynnHpoBka,

Полимеризацию проводят в водных растворах при 4О-65 С. В качестве винильных .мономеров используют винилимидазол, винилпирролидон, акриламид, акрИлбвую кислоту или их смеси с дивинильными соединениями, например с N , N-этиленбисакриламидом для получения подшитых полимерных структур, Физиологически активное соединение, содержащее азо-сВязь, т.е. высокомолекулярный инициатор полимеризации, винильных мономеров, получают при реакции физиолгически активного соединения гормона или фермента, например инсулина, с бисхлоргидратом имидоэфйра азоизомасляной кислоты.

Пример 1. Синтез высокомолекулярного инициатора - физиологически активного; соединения , содержащего реакционноспособную азо-связь, на основе инсулина.

1,5 г инсулина суспензируют в 200 мл сухого диметилформамида, содержащего 0,25 мл триэтиламйна и 60 мг . бис-хлоргидрата бис-метилиМидата азоизомасляной кислоты. Реакционную смесь перемешивают в течение трех дней при 4 С. За это время инсулин растворяется. Реакционную массу высаживают в 600мл

- сухого эфира, центрифугируют. Остаток растворяют в 10 мл (0,1 моль ) аммиака и хроматографируют на колонке (200 X 5 см) на сефадексе Г-75. Выделяют две фракции: 1-е объемом задержки 450 МЛ2 - с объемом задержки 700 мл. Выход фракции 19%, 2 - 52%. Физико-химическое и биологическое изучение - электрофоретическая подвижность веществ из фракции 1 и 2 исходного инсулина, данные по дисперсии оптического вращения (ДОВ) тех жевеществ до и после обработки трипсином (расщепление связи аргинин 22 - глицин 23) или до и после обработки меркаптоэтанолом (расщепление дисульфидных связей показало, что вещество из фракции 1 имеет структуру А, а из фракции 2 - Б, т.е. является внутримолекулярносшитым производным инсулича. Биологические испытания проводят, определяя содержание глюкозы и кровИ кроликов. Каждое вещество испытывакуг в двух сериях на девяти кроликах. В . табл.1 приведены физико-химические свойства и биологические характеристики высоко|молекулярных инициаторов - физиологически активных соединений (на основе инсулина). П р и м е р 2. Иммобилизация инсул на на поливиналимидазсхпе. 200 мг модифицированного инсулина типа Б выдерживают в растворе, состоящем из 2,8 мл дистиллированной воды и 1,2мл N -винилимидазола при 65 С в течение 4 ч. Затем смесь разбавля1от равным объемом (0,1 моль аммиака и хроматографиру ют на сефакксе Г-75. Фрак ция, соответствующая поливинилимияиазольной форме инсулина, выходила с объемом задержки 300 мл. Мол. вес. 8ООО-1200, определен с помощью гель хроматографии. Биологическая активност полимерной модификации инсулина по с ни-35

же ни ю уровня глюкозы в крови кроликов 150% по сравнению с исходным инсу;ла -,. ном. Определена с помощью стандартного; мыщьяково-молибденоврго метода 7, две серии опытов.на девяти кроликах, под- кожно, из расчета 0,5 ед/кг живого веса. Полимерный инсулин изучен электро6

торых обусловлено длиной цепи иммобилизующего полимера, а долей физиологически активной компоненты и физиологической активностью коньюгата при использовании полимерных коньюгатов для регулирования биологических процес сов в организме.

Таблица 7 фотометрически и спектрополяриметрически. Аналогично получены и исследованы другие производные йнсулййй (см. табл.2) Гомополимер не образуется. Предлагаемый способ ковалентноЙ-,им.мобилизации физиологически активных соединений на, полимерах расширяет ассортимент иммобилизующих виниловых полимеров, благодаря чему возможно получение новых ин1 ересных модифицированных полимерных форм физиологически активных соединений, воздействующих на живой .организм, и повьпие-ние их биологической активности. Например, возможна модификация физиологически активных соединений немодифицированными поливинилимидазолом, поливйнилпирролидоном и др. достаточно хорошо изученнымив Медицинском отношении и совместных с биологическими системами поли1 геров. Причем полученные ковалентныепблимерные коньюгаты не имеют Нежелательных внутри - и межмблекулярных сшивок физиологически активных компонентов ввиду контролируемой модификации физиологически активного соединения при получении высокомолекулярного физиологически активного инициатора. В свою очередь, данный инициатор позволяет широко варьирова1ть собтнЪШёнйе физиологически активной компоненты и полимерной компоненты в кокьюгате, на основании чеГо можно установить корреляцию структурных параметров, изменение ко7672857Условия получения и характеристики полимерных Т а б л и да производных инсулина

200

Винилпир-2,98 Вода 1,2 ролидон

200

АкриловаяТоже . То же Трже

к-та -

+ 65 1ОООО52

+40 8000100