Способ получения полипептидов, обладающих противозачаточным действием Советский патент 1979 года по МПК A61K38/17 

Изобретение относится к медицинской промьонпенности и касается получения противозачаточных средств.

Предложенные полипептиды - новые соединения и способ их получения в патентной и научно-технической литературе не описан.

Целью изобретения является получение полипептидов , обладающих противозачаточным действием.

Эта цель достигается тем, что полипептидный компонент, выделенный из фолликулостимулирующего гормона, лютеостимулирующего гормона или их р -суб-единицы, человеческого плацентарного лактогена, человеческого пролактина, человеческого хориального гонадотропина, 20-30 или 30-39 аминопептида, состоящего из С-концевых

остатков Ь-суб-единицы человеческого хориального гонадотропина, общей формулы

X-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Prq-Pro-ProSer-Leu-Pro-Ser-y,

где X обозначает;

Ser-Lys-Glu-Pro-Leu-Arg-Pro-Arg-Cys-Arg-Pro-lle-Asn-Ala-Thr-Leu-Ala-Val-Glu-Lys-Glu-Gly-Cys-Pro-Val-Cys 2.9 lle-Thr-Val-Asn-Thr-Thr-lle-Cys--A.ln4-O

-Gly-Try-Cys-Pro-Thr-Met-Thr-Arg-Val50-Leu-Gln-Gly-Val-Leu-Pro-Ala-Leu-Pro60

-Gln-Val-Val-Cys-Asn-Try-Arg-Asp-v iilo-Arg-Phe-Glu-Ser-Ile-Arg-Leu-Pro-G.i.y50

-Cys-Pro-Arg-Gly-Val-Asn-Pro-Val-Vfal-Ser-Tyr-Ala-Val-Ala-L.eu-Ser-Cyг,--Gln90-Cys-Ala-Leu-Cy,4-Arg-Arg-Ser-Thr Thr-Asp- :ys-Gly-Gly-Pro-Lys-Asp-nis1-IQ

-Pro-Leu-Thr-Cys-Asp-Asp-Pro-Arg-Fhe-Gln-Asp-Ser,

ИЛИ Ser-Lys-Gln-Pro-Leu-Arg-ProHO

Arg-Cys-Arg-Pro- Пе-Asn-Al a-Thr Leu20

-Ala-Val-Glu-Lys-Glu-GJy-Cys-Pro-Val29

-Cys-He-Thr-Val-Asn-Thr-Thr-lle-Cys3 6 AQ -Ala-Gly-Tyr-Cys-Pro-Thr-Met-Thr-Arg-Val-Leu-Gln Gly-Val-Leu-Pro-Ala-Leu-Pro-Glx-Leu-Val-Cys-Asn Tyr-Arg Asp ,. « , r,° -Val-Arg-Phe-Glu-Ser-Ile-Arg-Leu-Pro-GIy-Cys-Pro-Arg Gly-Val-Asn Pro-Val- a°I--Ser-Tyr-Ala-Val-AIa-Leu-Ser- :ys-GlnKfys-Ala-Leu-Cys-Arg-(Arg)-Ser-Thr-Thr-Asp-Cys-Gly-Gly-Pro-Lys-Asp-llis-Pro-Leu-Thr-cTs-AsF-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp, или Asp-AsfT-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-slr-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser, ПП-ЛЧО-БРГ V И JJ- J. , или Thr,Cys-Asp-Asp-Pro-Arg-Phe - - . -G1 -Аи Phe-Gln-AsD , , 1 .. . или Phe-Gln-Asp-Ser, ,,,„,„., или Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp, или Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp „или Asp-Ilis-Pro-Leu-Thr-Cys-Asp-Ac ry-Prn Ara-Php-rln-Ast SerAsp-Pro Arg Phe-Cln Asp-Ser, а У обочначаета У Обозначает. -Pro-slr-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-sfr ,,„,,,„-Р,о-,г„, „ли P ro-sir-Ar,-Leu-P.o- Iy-Proт, ml- т1 г ,-, Г.1 -Pro-Asx-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln р ber-Leu го, „, „ о , или Arg- Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp ФЬ -р -П -т -р -П inr Fro- le i.eu fro ь п, т г, гч г, или Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro , „. - „ „, -Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln, или Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro36034 ,-Pro-Asx-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-Ser-Leu-Pro, или Pro-Ser-ftrg-Leu-Pro-Gly-Pro-Pro-Asx-Ttir-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-Ser-Leu-Pro, Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln, .« Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Pro-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln20 - е -Р ° Pro-Ser-Arg-Leu-ProGly-Pro-Pro-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-ProGln-Ser-Leu-Pro/подвергают взаимодействию с соеди не ни ем, содержащим диазогруппы, таким. диазосульфониловая кислота, декстР динитрофенол, тринитрофенол, ангидрид S-ацетомеркаптоянтарная кисло политирозин прямой или разветвлен30ный,натуральные белки,сахароза сополимеризованная с эпихлоргидрином,полиглюкоз а, гомологичный альбумин сыворотки, гемоцианин из Keyhole limpet или ти оглобулин, которые вводят в поло35жение 2-40 полипептидной структуры, осуществляют следующим об ,5 д„фицирующие группы, как гемо- цианин из Keyhole limpet, содержащие 40свободные аминогруппы, получают в буfР ° растворе, как фосфатный буфер, в растворе хлористого натрия Р Р растворе К МОдифицирующей группе добавляют толуолл :Диизоцианатный реактив, разбавленный 45диоксаном примерно от 1-10 до 1-40 1 Количество толуолдиизоцианата, добавляемого в раствор, может коле °„/ а ЙГоГ.°;ере - ; Г,аТГ °ТеТ,1:Г..Гг,.Т-, ( + 10)° С, предпочтительно 0-4° С, в те ,;2-2 ч. Избыток толуолдиизоцианата удаляют центрифугированием, 5 осадок промывают фосфатным буфером, оставшиеся вещества соединяют, активированный раствор модифицирующей группы затем соединяют с подлежащим сопряжению гормональным 60 гормональньи полипептидсяи, 6UПолипептид растворяют в тем же фосфатном буфере (5-30 мг/мл) , все количество модификатора и полипептида соединяют с соблюдением молярного dSсоотношения, желательного в сопряженном продукте. Соединенные растворы подвергают взаимодействию при 30- 50°С, предпочтительно 35-40 С, в течение 3-6 ч. Модифицированный полипептид и свободный не сопряженцый полипептид можно разделить обычными приемами, н пример, гельной фильтрацией. В качестве индикатора в реакционную смесь добавляют пикограммовые количества Л меченого полипептида во время реакции сочетания, а количество полученных сопряжением полилептида с модифицирующими группами (молярное соотношение) определяют объемом вьщеляемой радиоактивности. В способы модифицирования гормонов, не гормональных протеинов и их фрагментов (немодифицированных полипептидов) включена реакция сочетания с npHr-ieHeHKef-i водорастворимого карбодиимида. Аминогруппы немодифицированного полипептида вначале, предпочтительно, защищают ацетилированием, затем этот немодифицированный (ацетилированный) полипептид подвергают сопряжению с модификатором, как натуральный протеиновый модификатор например, гомоцианин из Keyhole limpet, гомологовый альбумин свшорот ки и т.п. или же декстраны, агенты FicoII или политирозин, предпочтительно, в присутствии гуанидина, как гуанидин HCI, применяя в качестве ак тивирующего реактива 10-этил-З(3-диметиламинопропил)-карбидиимид. В слу чае применения агента PicoII 70 его вначале обрабатываютэтилендиамином с целью достижения более эффективног конечного сочетания. Обработку этилендиамином осуществляют в растворе или диоксане, при комнатной температуре и рН , предпочтительно 10-11, в течение VJ 1/4-2 ч. Реакцию сочетания немодифицированного полипептида с модификатором проводят в растворе, например, глицинметилового эфира с выдерживанием рН 4-5, предпочтительно 4,5-4,8, при комнатной температуре в течение 2-8 предпочтительно 5 ч. Полученный моди фицированный полипептид может быть очищен обычными способами хроматогра фией на колонке. Вызывающие иммунитет вещества получают полимеризацией немодифицированного полипептида с применением бифункциональных сложных имидоэфиров Сложные имидоэфиры (диметиладипимидат,диметилсуберимидат идиэтйлмаЛонимидат) могут быть использованы для получения полимера. Полимеризацию обычно осуществляют при комнатной температуре в водном растворе при рН 9-12, предпочтительно около 10-11 в течение 1/4-2 ч. Вызывающие иммунитет вещества так же могут быть получены димеризацией через сульфидную связь, образованную окислением тиоловой группы на цис-остатке, с применением йодбензольной кислоты и реакции при комнатной температуре в течение 10-40 мин. Модифицированные полипептиды также могут быть получены с применением глутарового диальдегида в качестве агента сопряжения. Коммерческий глутаровый диальдегид в действительности не содержит свободного глутарового диальдегида, а состоит из очень сложной смеси полимеров, содержащих большое количество at, р -ненасьпценных дегидов . По взаимодействии с натуральньми протеиновыми модифицирующими агентами, такими как гомологовые аль-бумины сыворотки, эти полимеры образуют стабильную связь посре,пст. СРО бодной аминогруппы, остап.ияч альд- гид-ные группы свободныпи. Этот пром: ;:(уточный продукт затем в запт-юдействуат с неГ юдифицированным полипептидам з присутствии боргидрида щелочного металла, такого как натриПйоргидрид. Этот промежуточный продукт образуется при рН 7-10, предпочтительно 8-9, при температуре близкой к комнатной. Модифицированный полипептрщ также получают при комнатной температуре по истечении около 1/4-2 ч реакци ;. 1 о-лученный продукт выделяют в чистом виде обычными приемами (гельной физпзтрацией, диализом и лиофи.лизац :еЛ) . Полимеризованные сахарине мсгглфикаторы Ficoll 70 или декстран Т 70 получают с целью использования прп сопряжении путем обработки галогон-ангидридом циануровой кислоты, как хлорангидрид циануровой кислоть-, с образованием дигалогентриазипилового продукта присоединения. Реакцию ведут в растворителе, таком как диметилформамид, при 0-20 С . предпочтятельно 10-15°С, приблизительно 1/24 ч. Полученный прсмежуточны}5 продукт диализуют до полного удаления галоицных ионов, лиофилизируют н обрабатывают немодифицированным полипептидс при рН 8-11, предпочтительно 9-10, F течение 5-12 ч при 15-35°С, обычно при кcяv нaтн6й температуре. Полученный модифицированный полипептид может быть выделен известным способам. Выщеупомянутые полимеризованные сахарные модификаторы также можно обрабатьшать перйодатами щелочных металлов при рН 3-6, ЗО-бО С в течение 1/24 ч, после чего полученный промежуточный продукт подвергают реакции сочетания с немодифицированным полипептидом при рН 7-11, предпочтительно 8-10, в течение около 1/4-2 ч при температуре 15-80°С, предпочтительно 20бО С. Полученное вызывающее иммунитет вещество выделяют вышеуказанными приемами.

Модифицирующие группы поддаются присоединению только к определенным аминокислотным частям, в частности они образуют химическую связь только с гистидиновыми/аргининови и, триозиновьми и лизиновыми частями. Таким образом, в зависимости от требую1Щ1Хся величины и химического вида данного модифицированного полипептида специалисту не составит трудности вычислить максимальное число модифицирующих групп, поддающихся соединению с полипептидсм, Несколько модифицирующих групп могут соединиться друг с другом и затем присоединиться к одной аминокислотной части.

Полипептиды, обладающие противозачаточным действием вводят в организм животного или пациента предпочтительно с физиологически совместимым напол нителем, поддаюишмся инъецированию. Их можно вводить с обычными наполнителями или средствами, содержащими в соответствующем случае другие стандартные вспомогательные вещества, в I виде инъецируемых растворов или взвесей предпочтительно для внутримышечного применения.

Количество вводимого модифицированного полипептида зависит от це- . лого ряда фактором, однако удовлетворительных результатов достигают при введении крупным млекопитающим стандартных доз 0,1-50 мг от одного до 5 раз через интервалы от 1 до 5 недель.

Пример 1.В течение по меньшей мере одного менструального цикла взрослые самки бабуины изучались в целях получения образцов и проб мочевых эстрогенов, плазмы, прогестина и, в некоторых случаях, мочевого гормона передней доли гипофиза ГПДР. Имг унизации подвергались только животные, давшие нормальные образцы этих гормонов .

Биологическую активность гормона передней доли гипофиза и возбуждающего деятельность фолликул яичника у женщины хориального гормона определяют с помощью теста истощения . яичника аскорбиновой кислотой, а препарат фолликулостимулирующего гормона испытывают с помощью теста увеличения яичника.

Гормоны видоизменяют в антигены путем соединения с г аптеном при различных соотношениях гаптена и гормона При этом процессе протеиновый гормон служит в качестве носителя, а гаптен соединяется с ним через диазо-связи. Хотя к различным гормонам был присоединен целый ряд гаптеновых групп, для любой комбинации применяют один и тот же основной процесс. Для получения игФ унизирующих антигенов наилучшим числом гаптеновых групп на гормоновую молекулу является 15-35.

Основная реакция состоит в диазотировании гаптена (сульфамильной кислотой) путем добавления его в раствор 0,11 н. соляной кислоты с последующим медленным добавлением этого раствора по каплям в 1%-ный раствор NaNOa при постоянном размешивании при 4°С. Диазотирование считается законченным при обнаружении свободной HNO в реакционной смеси. Реакция проводится при +4°С, оптимальными температурами являются приблизительно 0-6°С.

Гаптено-протеиновое соединение осуществляют путем растворения протеинового гормона в щелочном буфере, рН . Диазотированный гаптен медленно добавляют в раствор гормона при постоянном размешивании при 4°С. По добавлении всего гаптена рН окончательно устанавливают 8,0, 1-2 ч,размешивают и выдерживают в течение ночи при 4°с. Смесь осторожно диализуют 6-8 дней в дистиллированную воду в целях удаления непрореагировавшего гаптена.

Хотя число диазогрупп на гормональную молекулу можно регулировать числом взаимодействовавших молей гаптена и гормона, одновременно с каждым диазотированием проводят параллельное контрольное испытание с сулфанильной кислотой с меченым атомом S в целях уточнения состава гаптен-протеиновых проб. В контрольном испытании применяют тот же препарат гормона, что и для иммунизации. По окончании реакции из реакционной смеси отбирают аликвоту, остаток осторожно диализуют. Одинаковые объемы диализованного и недиализованного растворов измеряют путем жидкостной сцинтилляции. После сравнения диализованных и недиализованных проб подсчитывают молекулы гаптена, связанного с каждой молекулой гормона; непрореагировавший гаптен удаляют диализом. В соответствии с этим подсчетом для всех гонадотропиновых препаратов определяют молекулярный вес 30,00.

После диализа гаптеновые гормоны лиофилизируют и сохраняют при 4°С. Диазо-ХГ(35 групп на молекулу) и гормон передней доли гипофиза человека (26 групп на молекулу) испытывают биологическим путем с применением способа истощения яичника аскорбиновой кислотой; при этом было обнаружено, что 62% и 85% соответственно .активности невидоизмененных гормонов,из которых они были получены, осталось,. Ни один из других гормонов не был испытан на биологическую активность.

Способы иммунизации. Самок бабуинов подвергают первой иммунизации в течение 3-5 дней менструального цикла, второе и третье впрыскивание через неделю. Четвертое впрыскивание осуществляют через 2-3 недели после третьего. Несколько животных получаю пятое впрыскивание через 70-80 дней после первого. Все антигены вводят подкожно в суспензии манолеата манни да или арахидного масла. Длякаждой инъекции дозы антигена колеблются в пределах 3-5 мг. Последствия инъекций контролируют ежедневно в течение 5 дней после каждой и Ф1унизации на местные реакции. Контрольное действие иммунизации В течение по меньшей мере одного мен струального цикла перед иммунизацией и в течение всего периода иммунизации до появления действия обработки каждый день собирают круглосуточно пробы мочи и непрерьтно - пробы сыворотки. Измеряют мочевой гормон передней доли гипофиза ГПДГ, мочевые эстрогены и прогестины плазмы. Антитела были обнаружены в полученных по ле иммунизации пробах сыворотки путе взаимодействия 0,2 мл разбавленной сыворотки (1:1000) в забуференном фосфатном рассоле {рН 7,4) и 0,5% обычной бабуиновой сыворотки с 250 п гормона с мечеными атомами . Сы воротки подвергают взаимодействию с немодифицированным иммунизирующим гормоном и с немодифицированным гор моном передней доли гипофиза бабуин в целях обнаружения антител. В качестве антигена-индикатора применяю очищенный препарат гормона передней доли гипофиза бабуина. Комплексы из антигенов-антител осаждают с помощью овечьего антибабуинового гамма-глобу лина через 24 ч после инкубации при 4°С. Уровень антител выражается в виде связи гормона с мечеными атомам Значительные уровни антител являютс способными присоединить 5,0 мг или больше антигена с мечеными атомами . Иммунные сыворотки фракционируют гель-фильтрацией на Sephadex G-200 для определения соотношения антител ЗдМ и 3gG в сыворотке бабуина. Поскольку фракция 3gG содержит опреде ленное количество антител ОдА и 3gD определяют только TlgM и общий титр. Фракцию ЗдМ из колонны подвергают взаимодействию с 3 -гормонами и определяют способность образования связи. Объемы фракционированных сыворото отрегул 1рованы так, чтобы уровни ан тител можно было сравнивать с уровнями всей сыворотки. Получение антитела. На местах впрыскивания никаких заметных реакций после любой иммунизации заметно не было. В 4-х случаях наблюдалось легкое затвердевание ткани (2-3 см в диаметре) , когда в качестве носител применяли манолеат маннида, но крас нота и опухоль исчезали в течение 4-5 дней. В течение 3-5 недель у всех животных были обнаружены антитела против иммунизирующего антигена. Размер, продолжительность и перекрестность реакции этих антител зафиксированы. В общей сложности при чужеродной гонадотропиновой иммунизации наблюдались более высокие уровни, чем при гомологических. Перекрес.ность введенных антител с ГПДГ бабуина изучалась на каждом животном. Перекрестность иммунных сывороток при пиках уровней фиксировалась. Хотя наблюдалась относительно высокая активность антител против человеческого ГПДГ, реакция на ГПДГ бабуина была относительно малой. Была замечена промежуточная перекрестная реакция с антиовечьим ГПДГ, а также высокая степень перекрестной реакционной способности с антиобезьяньим ГПДГ. Диазо-человеческий фолликуле-стимулирующий гормон ФСГ оказался слг-,бо антигенным в бабуине. Продолжительность образования антител была выше при иммунизации чёловеческим и овечьим гонадотропином, чем при использовании обезьяньего. Пики уровня антител как правило наблюдались, когда антитела перемещались принципиально к типу 3gG.-Ранние антитела обладали большим количеством типа DgM и, как правило, большей перекрестной реакционной способностью относительно овечьего ГПДГ. Изменение количества всех антител дМ записывалось с самого начала обнаружения антител. Значительная перекрестная реакционная способность к бабуиновому ГПДГ наблюдалась в античеловеческих гонадотропинах, когда ЭдМ был в изобилии, но быстро спадала, когда им iyнныe сыворотки перемещались к почти . Этот перепад перекрестной реакционной способности не происходил при иммунизации обезьяньими и бабуиновы- и гормонами Иммунизации ;овечьим ГПДГ вызывали временное изменение реакционной способности при перемещении от к DgG. Действие на менструальный цикл. Действие иммунизации на менструальный цикл определяют с помощью наблюдения за изменениями набуханий кожи половых органов и изменением уровня гормонов гипофиза и/или яичников. Определяют запаздывание овуляции относительно ожидаемого срока, полученного по контрольному циклу. Одно животное,иммунизированное человеческим ХГ, не показало запаздывания овуляции; у другого, иммунизированного человеческим ФСГ, запаздывание равнялось только одному циклу. У двух животных, иммунизированных человеческим ГПДГ, и у двух, иммунизированных человеческим ХГ, эапаэдьшание овуляции равнялось двум менструальным циклам. У третьего животного, иммунизированного человеческим ГПДГ, овуляция эапаэдала на рассчитанные 86 дней. Овечий ГПДГ вызывал запаздывание на 88 дней. Иммунизация с помощью диазообезьяньего или бабуинового ГПДГ вызывает длительное прерывание менструального цикла. Запаздывания овуляг ции у двух животных, иммунизированных обезьяньим ГПДГ,равняются 146 и 122 дням, а у животных, иммунизированных видоизмененные бабуиновьм ГПДГ, овуляция наблюдается на 224 и 210 дней позже. Действия на специфические свойства гормона после иммунизации человеческим ГПДГ одного животного были .зарегистрированы. Интервал между мен струациями считался циклом. Образцы и пробы мочевых астрогенов и прогестина плазмы показали, что во время цикла иг-1мунизации длительность 85 дней никакой овуляции не произошло. Уровень мочевых эстрогенов поднимался в течение периода обработки, но эстрогены не давали типичной реак ции. Прогестины плазмы не увеличивались приблизительно до 19-го дня пер вого цикла после обработки. Реакции эстрогенов и прогестинов не выходили за рамки нормального в течение второ го цикла после обработки. Уровни антител повы1иались приблизительно, с 35-го дня цикла обработки до 289-го дня, начиная с первого обнаружения антител. Во время исследования этого животного пробы ГПДГ получить было нельзя, как и не было получено никаких данных относительно уровня этого гормона в плазме или моче. Образцы гормона, были зафиксирован после иммунизации с помощью диазобабуинового ГПДГ. В этом животном уровни антител были ниже и существовали, как правило, более короткий пе риод времени, чем при иммунизациях с псяиощью человеческих гонадотропинов . Во время цикла обработки уровни эстрогенов в моче и .прогестинов в плазме соответствовали нормальным образцам, но были количественно ниже нормы, образцы ГПДГ в моче заметно изменялись за счет инъекций диазо-ГПДГ В течение этого периода не было каких-либо признаков овуляции. Первый цикл после обработки .длился 246 дней Во время этого цикла уровни ГПДГ и эстрогенов в моче повышались в течение 35-41 дней, но не наблюдалось по следующего повышения уровня прогести нов плазмы, что означало бы овуляцию В течение следующих 42-х дней этого цикла не наблюдалось существенного повышения уровня какого-либо из трех гормонов до 231-го дня, когда было Згамечено сильное повышение уровней эстрогена и ГПДГ в моче. Через три дня после этого повысился уровень прогестинов плазмы, что указывало на наличие функционирующего желтого тела яичника. Второй менструальный цикл после иммунизации длился нopv aльнo, эндокриновые образцы были нормальными . Антитела против немодифицированного бабуинового ГПДГ достигали максимального уровня окло 70-го дня цикла после обработки; этот уровень оставался относительно постоянным до 190-го дня, когда было замечено устойчивое отклонение. На 215-й день этого цикла антител почти нельзя было обнаружить. Через 16 дней после этого срока был обнаружен пик ГПДГ, соответствовавший нормальному повышению уровня в середине цикла. Начиная с этого момента, функция гипофизарно-яичниковой оси животного была нормальной.Гормональные образцы животных с другими гетерологовыми гонадотропиновыми иммунизациями были сходны с таковыми у жи-вотных,иммунизированных человеческим ГПДГ, а другие животные, иммунизированные обезьяньим или бабуиновым ГПДГ, реагировали сходно с животными, иммунизированными бабуиновым ГПДГ. Полученные на бабуинах результаты показьшают, что модификацией гормона размножения путем вышеизложенных процессов ему придается антигенность и что полученные таким образом антитела нейтрализуют натуральные эндогенные ,гормоны, если натуральный гормон получен от вида животного, иммунизируемого модифицированным гормоном. Пример 2. Человеческий ХГгормон присутствует только в организме беременной женщины, гормон ГПДГ иммунологически и биологически идентичен с гормоном ХГ человека, хотя между ними существуют химические различия. Поскольку они являются биологически идентичными, эффективность этого иммунологического процесса можно оценить nyTSvi инъецированиямодифицированного человеческого ХГ в организм небеременной женщины, контролируя уровни ГПДГ в -крови. Образующиеся антитела нейтрализуют как ГПДГ, так и модифицированный человеческий ХГ. Существует образец уровней ГПДГ у женщин, он в основном постоянен до середины периода между менструацияMtj, непосредственно перед овуляцией; в медлен т овуляции уровень ГПДГ сильно возрастает, помогая вызвать ову-. лядию. При контроле уровня ГПД1 и уровня антител видно, вызвал ли процесс или не вызвал образование анти-. тел, способных нейтрализовать эндогенный гормон размножения, а именно ГПДГ. . Опыт производили на 27-летней жен щине. Гормон бьол получен, очищен, модифицирован. В организм этой женщины был затем введен модифицированный человеческий гормоч ХГ, Общеизвестно, что антитела против человеческого ХГ реагируют идентично ГПДГ. Действие иммунизации было увеличено, в основном, контролем уровней гормона ГПДГ в крови. Затем результаты обрабатывали. Получение гормона. Клинический человеческий ХГ, полученный из мочи беременной женщины, обладает иммунологической степенью разведения 2600 иммунных единиц/мг. В этом препарате были обнаружены вещества, вызьшающие заражение. Очистку производят хроматографией и элюированием. Фракцию дйализуют и лиофилизируют. Наиболее сильная фракция содержит л 7600 иммунных единиц/мг, однако он дает гетерогенную реакцию при гельэлектрофорезе на олеилакриламиде. Фракцию очищают дальше гель-фильтрацией. Элюирование показало два основных протеиновых пика. Самый сильный чело веческий ХГ обнаружен в первом пике и отличается иммунологической степенью разведения 13,670 иммунологиче ких единиц/мг. Фракцию подвергают по лиакриламидному гель-электрофорезу. Дальнейшая очистка с гельфильтрации показывает отсутствие гетерогенности человеческого ХГ на это ступени. Материалы для исследований обрабатывают согласно вышеприведенно му способу. Вызывающие заражение вещества это го очищенного человеческого ХГ испытывают с помощью , применявшегося для идентификации, один образец подвергают взаимодействию с шлмунными сьшоротками против некоторых протеинов, дающих сильное загрязнение. К этим протеинам относятся ФСГ, чело веческий гормон роста, полная человеческая сыворотка, человеческий белок, трансферин, альфа-1-глобулин, альфа-2-глобулин и орозомукоид. Не было обнаружено ни одной связи очищенного человеческого ХГ с какой-либо иммунной сывороткой при разбавлении каждой 1:50. Эти отрицательные р зультаты показывают, что загрязнение любым из них было ниже 0,005%. Видоизменение гормона. Гормон видоизменяют путет связывания с гаптеном (сульфанилазо). В соответствии с этим способом молекулы гаптена свя зывают с протеином череэ аминогруппу алифатической или ароматической част гаптена. Число молекул гаптена, соединенных с каждой молекулой человеческого ХГ (га-ЧХГ) может регулироваться; в настоящем случае для получения иммунизирующего антигена используют 40 гаптеновых групп на молекулу ЧХГ. После процесса связывания гаптена га-ЧХГ стерилизуют и испытывают. Пациентка уже родила несколько детей; свойства размножения были прекращены добровольным двусторонним удалением фаллопиевой трубы. Пациентка бЕзша здорова, менструация была регулярной. Она была подвергнута полному медицинскому осмотру с последующей лабораторной оценкой полученных данных, включая гемограмму, анализ мочи, латексную фиксацию и мазок Папаниколау (Р. smear). Аллергией никогда не страдала. В целях демонстрации нормальной функции гипофизарно-яичниковой оси до иммунизации, начиная с первого дня менструации, в течение 10-ти дней каждый второй день брали кровь, затем каждый день в течение дней и, наконец, каждый второй день до начала следующей менструации. Были осуществлены качественные анализы сывороток ФСГ, ГПДГ, эстрона, экстрадиола и прогестерона. Эти исследования показали наличие овуляции. 10 мг га-ЧХГ антигена растворяют в 1,0 мл раствора и эмульгируют тем же количеством масла. Перед инъекцией берут кожные пробы с насечками относительно антигена и носителя. Иммунизацию проводят в фазе образования желтого тела яичника в целях предупреждения сверховуляции из-за введенного ЧХГ. Пациентке проводят четыре впрыскивания через кахщые две недели. Первые два вводят в масле подкожным путем (1,0 мл в верхнюю часть каждой руки); последние два впрыскивания вводят в растворе только через кишечник. После каждого впрыскивания проверяют давление крови, а также возможную аллергическую реакцию пациентки. Через две недели после первого впрыскивания начинают каждую неделю брать кровь в целях определения наличия гуморальных и клеточных антител. После окончания процесса иммунизации отбирают кровь аналогично способу в контрольном цикле в целях подтверждения действия иммунизации на гормональное распределение менструального цикла. Поскольку антитела против ЧХГ реагируют идентично ГПДГ, то их подвергают контролю в качестве показателя эффективности процесса. Третий цикл исследуют аналогично через 6 месяцев после первой иммунизации. По окончании исследований лабораторные оценки были повторены. Пробы сыворотки контрольного цикла и цикла после обработки были испытаны

на наличие ФСГ, ГПДГ, эстррна, эстрадиола и прогестерона.

Результаты. Соотношения зо времени между гипофизарной сывороткой и гонадальными гормонами в контральных циклах пациентки фиксировались. После двух впрыскиваний в организме пациентки были обнаружены титры антител против ЧХГ. Во время проведения иммунизации менструация проходила через определенные интервалы времени.

После первого впрыскивания в манрлеате маннида на месте впрыскивания наблкдались зуд и опухание. Последующие введения через кишечник в растворе не вызьшали никаких реакций, из чего было заключено, что местные реакции обусловлены манолеатом маннида. Тесты лимфоцитной трансформации на образцах плазмы давали отрицательные результаты.

В течение цикла после обработки фолликулярная нулевая линия и уровни ГПДГ. фазы образования желтого тела яичника сильно не изменялись. По сравнению с обычным большим повышением в середине цикла наблюдались лишь очень незначительные повышения уровня ГПДГ Распределение ФСГ в цикле после обработки было нормальHiiM. Это указывает на то, что антитела нейтрализовалидействие эндогенного ГПД1.

Пациентку исследовали в течение еще одного цикла приблизительно через б месяцев после первой иммунизации. Были обнаружены значительные титры антител, указывающие на незначительное повышение ГПДГ в середине цикла, тогда как ФСГ в основном были нормальны. Таким образом была доказана специфичность анти ЧХГ-антител к ГПДГ, но не к ФСГ.

Пример 3. Дополнительно исследовали 29-летнюю женщину. Аналогично примеру 2 гормон был получен, очищен, модифицирован и введен пациентке, которая находилась под конт ролем и подвергалась исследованию, как описано в примере 2.

Результаты не отличались от полученных в примере 2, за исключением того, что уровни эстрона и эстрадиола в основном были нормальными. У пациентки вырабатьпзались значительные титры антител в последнем отрезке послеиммунизационного цикла; в цикле исследованном через б месяцев, у пациентки не было значительных повышений уровней ГПД1 в серединецикла .

Пример 4 о Исследовали 29-ленюю женщину. Гормон получают, очищают и модифицируют и вводят (аналогично примеру 2) пациентке, которую наблюдают и исследуют, как и в примере 2 .

Результаты не отличаются от полученных в примере 2, за исключением того, что фолликулярная нулевая и уровни ГПДГ фазы образования желтого тела яичка в послеиьмунизационном цикле были в значительной степени понижены не наблюдается повышения уровней ГПДГ в середине цикла; эстроновые уровни повышены в течение фолликулярной фазы послеиммунизационного цикла; в течение шести месяцев исследований не было замечено значительного повышения уровней ГПДГ в середине цикла.

Пример 5. Исследуют 35-летнюю женщину. Гормон получают, очищают модифицируют и аналогично примеру 2 вводят пациентке, которую контролируют и исследуют как в примере 2.

Результаты не отличаются от полученных в примере 2, за исключением того, что в послеиммунизационном периоде фолликулярная нулевая линия и уровни ГПДГ в фазе образования желтого тела яичка были заметно снижены; наблюдается очень незначительное повышение уровней ГПДГ в середине цикла уровни ФСГ в послеиммунизационнсм периоде снижены, уровни эстрона и эстрадиола уме.ньшены в течение фолликулярной фазы послеиммунизационного периода.

Пример 6. Дополнительно исследуют женщину 28 лет. Гормон получают, очищают, модифицируют и аналогично примеру 2 вводят пациентке, которую контролируют и исследуют как примере 2.

Результаты не отличаются от полученных в примере 2, за исключением того, что в послеиммунизационном цикле фолликулярная нулевая линия и уровни ГПДГ в фазе образования желтого тела яичка заметно снижены; в середине цикла не замечено пиков ГПДГ; в фолликулярной фазе послеиммунизационного цикла уровни эстрона повышены; в шестимесячном послеиммунизационннсм цикле не обнаружено значительного повышения уровня ГПДГ в середине цикла. - Пример 7. Дополнительно исследуют еще одну 28-летнюю женщину. Гормон получают, очищают, модифицируют и аналогично примеру 2 вводят в организм пациентки, которую контролируют и исследуют как в примере 2.

Результаты не отличаются от полученных в примере 2, за исключением того, что до трех первых впрыскиваний не было обнаружено титров антител против ЧХГ, в послеиммунизационном цикле фолликулярная нулевая линия и уровни ГПДГ фазы образования желтого тела яичка; не наблюдается ни пиков, ни повышений в середине цикла ГПДГ, во время фолликулярной фазы повышены уровни эстрона; в шестимесячном цикле не обнаружено значительных титров антител.

Все вышеописанные примеры показывают целесообразность введения модифицированных гормонов для нейтрализации эндогенного гормона размножения.

Пример 8. Модифицированный натуральная гормон размножения при введении его в организм животного того вида, из которого гормон был получен, вызывает образование антител, нейтрализующих действие немодифицированного эндогенного натурального гормона в организме животного, В примерах 1-7 применяют ФСГ, ЧХГ, ГПДГ.

Очищенный препарат плацентарного лактогена получают из плацент бабуинов. Плаценты экстрагируют, очищают хроматографией на колонне, чистоту контролируют полиакриламидным гелем, электрофорезом и методом испытания радиоактивными изотопами на иммунитет. Полученный материал отличается высокой степенью чистоты, а метод испытания радиоактивными изотопами показал отсутствие загрязнения другими плацентарными гормонами.

Плацентарный лактоген бабуина (ПЛБ) модифицируют путем присоединения к диазониевой соли сульфанильной кислоты аналогично примеру 1. В этом случае число диазомолекул на ПЛБ равH ieTCH 15. Процессы иммунизации не отличаются от таковых в примере 1.

В течение 4-6 недель в пробирке после первого впрыскивания диазо-ПЛБ обнаружены у 6-ти самок бабуинов уровни антител против натурального немодифицированного ПЛБ. Уровни поднялись до определенной высоты в течение 8-10 недель и оставались в таком положении несколько месяцев. Гормональные измерения показали, что иммунизация не вызвала изменений в нормальном менструальном цикле. Поскольку ПЛБ обычно вьоделяется только в состоянии беременности, этот факт не был неожиданным.

i

Все 6 самок спаривают с самцотл,

исследованным на плодовитость, 3 раза .(по одному разу во время трех разных циклов в течение периода плодовитое;ти). После каждого спаривания проводят диагноз на зачатие путем гормонального измерения. Из Хв-ти случаев спаривания в 13-ти случаях произошло зачатие, доказанное соответствующим тестом. У оплодотворенных саимок менструация появляется на 7-12 дней позже по сравнению с нормальньм сроком. Последующие гормональные измерения показали, что у всех 6-ти самок 13 оплодотворений закончились выкидышами приблизительно через неделю после ожидавшегося менструального течения.

Эти результаты показывают, что выработанные в организме животного пос ле иммунизации антитела не оказывают

действия на менструальный цикл у неоплодотворенных самок, но при оплодотворении они нейтрализуют бабуиновый плацентарный лактоген в плаценте бабуина с последующим выкидышем очень скоро после зачатия.

При модификации ФСГ, самотомедиана, гормона роста или angiotension II с применением диаэосульфанильной кислоты или трйнитрофенола результаты, получаемые при введении очищенного модифицированного полипептида в организм самца, указывают на стимуляцию антител, ;нейтрализующих все модифицированные полипептиды или часть

их, как и соответствующий эндогенный

полипептид.

Пример 9. Всеприведенные в вышеописанных при.мерах опыты и исследования проводились на бабуинах, ЖиiBOTHHe были взрослыми и способными

к размножению. При исследовании подопытных организмов применяют высокоочищенные р -суб-единицы ЧХГ в виде препарата биологической активности меньше 1,0 иммунных единиц/мг. Животных иммунизируют 14-26 молей/моль

полипептида, связанного с диазасульфанильной кислотой субединиц манолеата маннида.

Уровни антител определяют путем

связей разбавленных сывороток с D антигеном с меченым атомом. Перекрестную реакционную способность и iмунных сывороток измеряют посредством прямого присоединения антигенов

с меченым атомом и испытанием на иммунитет с помощью способа смещения методом радиоактивных изотопов. Противозачаточное действие в активно иммунизированных животных определяют

спариванием самок с самцами, способными к размножению. Действие на организм беременных бабуинов, пассивно иммунизированных либо овечьим, либо бабуиновьм анти-(Ь-ЧХГ определяют путем контроля уровней сыворотки го45на дотропиновых и стероидных половых .гормонов до и после иммунизации.

8 самок бабуинов подвергают иммунизации модифицированной р-суб-едини 50 цей ЧХГ. У всех животных были обнаружены значительные уровни антител.

Результатом иммунизации бабуинов модифицированной Ь-суб-единицей ЧХГ

55 были высокие уровни антител, реагирующих, на ЧХГ, человеческий ГПДГ и бабуиновый ХГ, но не на бабуиновый ГПДГ. Все животные остаются способными к овуляции, но после целого ряда

60 спариваний не происходит оплодотворения. Пассивная иммунизация не иммунизированных беременных бабуи юв сывороткой овечьего анти- -ЧГХ вызывает нарушение беременности (аборты)

65 в течение 36-44 ч.

Пример 10. Изготовляют раствор из гемоцианина из Keyhole limpet (KHL) (7 мг/мл) в 0,05 моля натрийфосфатного буфера в 0,2 моля хлористого натрия, рН 7,5. Нерастворимые частицы удаляют центрифугированием. К 1 мл этого раствора добавляют 20 мкл толуолдиизоцианатного реактива, разбавленного диоксаном (1/30), причем количество, в основном, экви.валентно в пересчете на количество молей остатков лизила в молекулах KLH-пептида.

Через 40 мин при активированный толуолдиизоцианатом раствор KHL соединяют с 0,5 мг синтетического (Ь-НСС-пептида, который до этого растворяют в 25 мкл 0,05 М натрийфосфатного буфера в 0,02 М хлористом натрии, рН 7,5. Смесь инкубируют при в течение 4 ч. Полученный продукт очищают гельной фильтрацией.

Пример 11. 1г 70 растворяют в 1 мл обычного раствора и 1 мл 2 М этилендиамина (рН доводят до 10 хлористоводородной кислотой). Раствор вьщерх ИБают при комнатной температуре в водяной бане, размешивают магнитной мешалкой, добавляют

4г цианогенбромида, растворенного в 8 мл диоксана. Кислотность смеси выдерживают при рН 10-10,.5 в течение 8 мин, добавляя капли 2 в, раствора гидроокиси натрия, За7:ем добавляют еще 2 мл 2 М раствора этилендиамина, рН 10, продолжая -размешивание при комнатной те тературе в течение

30 мин.,Продукт очищают пропусканием через колонку из биогеля .

Пример 12. 2 мг соединения, содержащего пикограммовое количество 3 -меченого адцукта, и 1,6 мг KLH растворяют в 1 мл 1 М глицинметилового сложного эфира в 5 М гуанидингидрохлориде, В раствор затем добавляют 19,1 мг этилдиметиламинопропилкарбодиимида. Кислотность доводят до. рН 4,75 и выдерживают при этом значении в течение 5 ч при комнатной температуре при помощи 1 и. хлористого натрия. Сопряженный KLH-пептид очищают пропусканием через колонну (2,2x28 см) из биогеля , уравновешенную 0,2 М хлористым натри&л,

Пример 13. При комнатной температуре в непрерывно размешиваемый раствор 1 моля полипептида (1- 20 мг/мл) в 0,1 М натрийфосфате порциями по 2 г добавляют через каждые

5мин 3 моля твердого бифункционального дигидрохлорида сложного имидоэфира, Для поддерживания рН 10,5 добавляют 0,1 н. гидроокись, натрия. Через 1 ч по завершении добавления сложного диимидоэфира получают полимеризовакный продукт согласно изобретению.

Пример 14. К раствору (20 мг/мл) гомологового альбумина сыворотки в 0,1 М боратном буфере, рН 8,5, 1000%-ного молярного избытка 25%-ного водного раствора глутарового диальдегида добавляют при комнатной температуре. Избыток диальдегида удаляют гельной фильтрацией в воде с применением биогеля рг2. Материал, собранный в пустом пространстве, лиофИЛИЗИруЮТ, сухой ПрОДУКТ ПОВТОРНО

растворяют в 0,1 М боратном буфере, рН 8,5 (20 мг/мл), смешивают с надлежащим количеством полипептида (20 мг/мл) в том же буфере при комнатной температуре. Через 20 мин добавляют натрийборгидрид в 250%-ном молярном избытке полипептида-1Х. Реакция заканчивается через 1 ч. Сопряженный продукт очищают гельной фильтрацией на колонне из биогеля 0 р-60, диализуют до удаления соли и лиофилизируют.

Пример 15. При TeMnepatype ниже 16°С в течение 2 ч размешивают

1г Fico 11 70, 500 мг NaHCO, 3 г 5 хлористого циакура, 20 мл воды и

80 мл диметилформамида. Продукт перегоняют против дистиллированной воды до удаления хлора, затем лиофилизируют. Полипептид (2 мг), содержащий

0 минимальное количество 3 -меченого аналога, инкубируют с 1 мг этого продукта в 0,25 мл 0,2 М натрийборатного буфера, рН 9,5, в течение 1 ч при 20°С, после чего продукт выделяют на

5 колонне из биогеля (2,2 х 28 см).

При осуществлении вышеописанной реакции с применением декстрана Т 70 вместо фиколла 70 получают соответствующий модифицированный полипептид,

« пригодный согласно настоящему изобретению.

Пример 16.1г фиколла 70, 1,2 г натрийперйодата, 0,42 г хлористого калия растворяют в 1,5 мл 1 М натрийаиетатного буфера, рН 4,5, и

инкубируют при 37°С в течение 1 ч.

2 мг (588 молей) полипептида, смешанного с минимальным количеством 3 -меченого аналога, инкубируют с

2мг вышеполучекного продукта в

0 0,3 мл 0,2 М боратного буфера, рН 9,5, при 55°С в течение1 ч. Реакционную смесь затем резко охлаждают на ледяной бане, после чего добавляют 1 мг натрийборгидрида. Реакцию восстанай5 ления прекравдот пропусканием продукта через колонну из биогеля р-60 (2,2 X 28 см), уравновешенной и элюированной 0,2 М хлористым натрием. Пример 17. Несколько кроли0 иммунизируют различнЕлми синтетическими пептидами, сопряженными с образованием разных модифицирующих групп. После двух или трех приемов иммунизации через интервалы от 3 до

5 5 недель сыворотки от подопытных животных оценивают путем определения их способности свяэьшать в пробирке радиоактивно меченный HCG. Специфику этой связи исследуют по реакции этих же сывороток относительно дугих протеиновых гормонов, меченных обычным способом, в частности LH-придатка мозга. Сыворотку далее оценивают путем определения ее способности ингибировать биологическое действие HCG, экзогенно введенного в организм животных в биологическом тесте. Так, увеличение веса матки беременных крыс, как реакция на -предписанную дозу HCG, подвергается регистрации. Дозу HCG вводят подкожно в физиологическсм растворе поваренной соли 5 впрыскиваний в течение 3-х дней, затем животное убивают с целью удаления матки на четвертый день. Вес матки увеличивается в соответствии с увеличением количества впрыскиваНИИ гормона. При оценке действия антисывороток независимо от подкожного введения гормона также вводят разные количества опытной сыворотки внутрибрюшинным путём. Это способствует быстрому поглощению антисьшоротки к 5овяным потоком крысы и позволяет взаимодействовать ему с гормоном, когда последний поступает в кровь. Если антисыворотка способна взаимодействовать с гормоном, для предупреждения стимуляции матки, сьторотк считают эффективным биологическим ингибитором действия гормона.

Пример 18. Йодбензойную кис лоту, растворенную в слабом избытке 1 н. гидроокиси натрия добавляют в пептид в фосфатном буфере с обычньм раствором при рН 7,0. По истечении 30 мин при комнатной температуре полипептидный димер очищают гельной фильтрацией.

Пример 19.В охлажденный на ледяной бане и интенсивно перемешиваемый бараний ЗГ глобулин (0,23 мл) (Ю.мг/мл) в 0,05 М фосфатном буфере при рН 7,5 добавляют 50 мкл толуолдиизоцианата в диоксане (1:10). Через 40 мин избыток толуолдиизоцианата удаляют центрифугированием (0°С, 10 мин, 10 г) ,осадок дважды промыва- ют. Соединенные оставшиеся продукты добавляют к 7,7 мг пептида, раствореного в 0,8 мл PBS, рН 7,5. Смесь Размешивают при комнатной температуре 10 мин, а затем инкубируют при 37°С в течение 4 ч. Сопряженный продукт очищают диализом.

Предлагаемый способ позволяет получить полипептиды, которые могут быть использованы в качестве противо зачаточных средств.

Формула изобретения

Способ получения полипептидов, обладающих противозачаточным действием отличающийс я тем, что

полипептидный компонент, выделенный из фолликулостимулирующего гормона, лютеостимулирующего гормона или их 5-суб-единицы, человеческого плацентарного лактогена, человеческого пролактина, человеческого хориального гонадотропина, 20-30 или 30-39 аминопептид, состоящего из С-концевых остатков р -суЬ-единицы человеческого хориального гонадотропина, общей формулы

X-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Y, где X обозначает:

Ser-Lys-Glu-Pro-Leu-Arg-Pro-ArgioIt-Cys-Arg-Pro-Ile-Asn-Ala-Thr-Leu-Ala20

-Val-Glu-Lys-Glu-Gly-Cys-Pro-Val-Cys29-Ile-Thr-Val Asn-Thr-Thr-Ile- ;ys-Ala4C

-Gly-Try-Cys-Pro-Thr-Met-Thr-Arg-Val5-0

-Leu-Gln-Cly-Val-Leu-Pro-Ala-Leu-Pro60

-Gln-Val-Val-Cys-Asn-Try-Arg-Asp-Val70

-Arg-Phe-Glu-Ser-lle-Arg-Leu-Pro-Glyec

-Cys-Pro-Arg-Gly-Val-Asn-Pro-Val-Val -Ser-Tyr-Ala-Val-Ala-Leu-Ser-Cys-Gln9O

-Cys-Ala-Leu-Cys-Arg-Arg-Ser-Thr-Thr-(00

Asp-Cys-Gly-Gly-Pro-Lys-Asp- II i.s-Pro110

-Leu-Thr- :ys-Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser,

или Ser-Lys-Gin-Pro-Leu-Arg-Pro-

oif

-Arg-Cys-Arg-Pro-lle-Asn-Ala-Thr Leu20

-Ala-Val-Glu-Lys-Glu-Gly-Cys-Pro-Val-24 -«.

-Cys-lle-Thr-Val-Asn-Thr-Thr-Ile-Cys40

-Ala-Gly-Tyr-Cys-Pro-Thr-Met-Thr-Arg50

-Val-Leu-Cln-Gly-Val-Leu-Pro-Ala-Leubo-Pro-Glx-Leu-Val-Cys-Asn-Tyr-Arg-Asp10

-Val-Arg-Phe-Glu-Ser-lle-Arg-Leu-Pro-Gly-Cys-Pro-Arg-Gly-Val-Asn-Pro-ValBo

-Val-Ser-Tyr-Ala-Val-Ala-Leu-Ser-Oys-Gln-Cys-Ala-Leu-Cys-Arg-(Arg)-Ser100,

-Thr-Thr-Asp-Cys-Gly-Gly-Pro-Lys-Asp-Ills-Pro-Leu-Thr-Cys-Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp, или Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gin-Asp- Ч Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro -Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser, или Gin-Asp-Ser, или Thr, Cys-Asp-Asp-Pro-Arg-Phe -Gln-Asp, или Phe-Gln-Asp, или Phe-Gln-Asp-Ser, или Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp, или Aap-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Aspили Asp-Ilis-Pro-Leu-Thr-Cys-Asp -Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Ser, a Y обозначает: Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln, или Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Pro-Asx-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-Se147 -Leu-Pro, или Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln, или Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Prp-lle-Leu-Pro-Gln, j или Pro-Ser-Arg Leu-Pro-Gly-Pro-Pro-Asx-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-Ser-Leu-Pro, или Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Pro-Asx-Thr-Pro-lle-Leu-Pro-Gln-Ser-Leu-Pro, или Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro- -Ser-Asp-Thr-Pro-lle-Leu-Pro-Gln, или Gly , или Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Pro-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-Ser-Leu-Pro, Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Pro-Asp-Thr-Pro-lle-Leu-Pro-Gln-Ser-Leu-Pro, подвергают взаимодействию с соед1Гнением,содержащим диазогруппы,таким как диазосульфониловая кислота,декстран,динитрофенол,тринитрофенол,ангидрид S-ацетомеркаптоянтарная кислота, политирозин прямой или разветвленный, натуральные белки, сахароза сополимеризованная с эпихлоргидрином,полиглюкоза, гомологичный альбумин сыворотки, гемоцианин из Keyhole limpet или тироглобулин, которые вводят в положение 2-40 полипептидной структуры.