Способ получения препарата иммобилизованной протеазы BACILLUS SUBTILIS Советский патент 1993 года по МПК C12N11/12 A61K37/48 

Настоящее изобретение относится к битехнологии и, 8 частности, к способам полчения иммобилизованных ферментных репаратов, а именно к способу получения репарата иммобилизованной протеазы 5 Bacillus subtltls.

Препарат иммобилизованной протеазы Bacillus subtllis может быть использован в медицине для лечения гнойных абсцессов и ран,. Р(.биохимии для гидролиза белков в 0 абораторных дёяях, а также в промышленности /yifl гидролиза белковых смесей.

В литературе описан ряд способов полчения иммобилизованных протеаз Bacillus subtllis. 15

Известен способ получения препарата иммобилизованной субтйлопептидазы А Вас. subtllis на пара-аминобензилцеллюлозе, который включает две стадии: актива-, цию матрицы путем диазотирования и 20 иммобилизацию фермента на активированной матрице.

Недостатком способа является низкая протеолитичеСкая активность препаратов мене« 10% от исходной.25

Известен также способ получения препарата иммобилизованной протеазы Вас. subtllis на силохроме С-80, включающий активирование матрицы с помощью глутарового альдегида с последующей 30 иммобилизацией фермента. Источником протеазы служит раствор протосубтилина Г 10 X, представляющий собой сложную смесь белков, включающую фермент протеазу, полученную после осаждения балласт- 35 ных белков из культуральной жидкости Bacillus subtllis ацетоном, центрифугирования и сублимационной сушки супернатанта. Способ получения препаратов иммобилизованной протеазы заключается в следую- 40 щем. Силохром С-8.0 обрабатывают амино.пропилэтоксисиланом, а затем глутаровым альдегидом. К влажному активированному носителю добавляют 30%-ный раствор протосубтилина Г10Х в количестве 45 27-30% ед.ПС/МГ / носителя. (За единицу ПС принимается такое количество фермента, которое в течение 1 ч при 38°С катализирует гидролиз казеина в такой степени, что способность его связывать HCI падает на 50 величину, эквивалентную 1 мл 0,1 н раствора NaOH). Процесс иммобилизации осуществляют при перемешивании на ледяной бане при рН 7,4-7,5. После чего препарат отделяют на пористом фильтре от жидкости. 55 Иммобилизованный препарат промывают до исчезновения следов белка в промывных водах. Процент сохранения активности препаратов составляет 12.9-14%.

Недостатком этого способа является низкий процент сохранения активности и ограниченность применения. Так. например, получаемый препарат невозможно использовать в медицине.

Целью описанного способа является устранение недостатков известного способа, а именно, увеличение процента сохранения активности протеаа1ы при иммобилизации. Указанная цель достигается за счет того, что в качестве матрицы для иммобилизации используют аминоэтилцеллюлозу (АЕ-целлюлозу), а активацию матрицы проводят в 0,1-Ш фосфатном буфере при рН 6-9 в течение не менее 2 ч.

Согласно изобретению описывается способ получения препарата иммобилизованной протеазы Вас. subtills с высоким процентом сохранения активности, заключающийся в активации АЕ-цеялюлозы глутаровым альдегидом в 0,1-1М фосфатном буфере при рН 6-9 в течение не менее 2 ч с последующей иммобилизацией фермента на активированном носителе.

Процесс проводят следующим образом.

В качестве аминоэтилцеллюлозы (АЭцеллюлоза) используют препарат отечественного производства (завод химреактивов в г, Олайне) и фирмы Реанал (Венгрия). Протеазу Вас. subtlUs берут в виде водного раствора.

В качестве источника протеаз используют протосубтилин ГЗХ, очищенный по методу, который заключается в осаждении балластных белков раствором CaCl2, удалении осажденных белков центрифугированием и осаждении протеаз из надосадочной жидкости этиловым спиртом. За единицу активности протеаз принимают такое количество фермента, которое переводит в кислоторастворимую фракцию 1 мг тирозина за 15 мин при 37°С.

Описываемый способ состоит из следующих стадий:

-активирование АЭ-целлюлозы глутаровым альдегидом в 0,1-1 М калий-фосфатном буфере при рН 6-9 в течение не менее 2 ч при комнатной температуре, при уменьшении времени активации снижается протеолитическая активность конечного продукта.

-иммобилизация протеазы на активированной АЭ-целлюлозе при 4-5°С и перемешивании в 0,1-1 М растворе калий-фосфатного буфера рН 7,3-7,7.

Вносят 40-50 ед. акт. фермента на 1 кг сухого веса активированной матрицы.

При уменьшении концемграции фосфорнокислых сопей в активации

и иммобилизации снижается активность конечного продукта.

Полученные препараты иммобилизованной протеазы имеют активность 32-40 ед.акт./г сух. препарата и сохранение активнссти составляет 17-30% от исходной активности.

При гидролизе альбумина в проточной колонке с иммобилизованной протеазой сохраняется 100% активности в течение 4-х сут при 25°С. В течение 3-4 сут в гнойной ране также сохраняется 100% активности.

Преимуществом описываемого способа, по сравнению с прототипом, является использование активированной целлюлозной матрицы для иммобилизации протеазы. В связи с этим получен высокий процент сохранения активности препарата иммобилизованной протеазы и высокая стабильность препаратов при гидролизе белков.

Приведенный ниже пример служит иллюстрацией описываемого способа.

ПрА1мер. 100 г влажной АЭ-целлюлозы (сухой вес 50 г) суспендируют в 230 мл 1 М калий-фосфатного буфера, рН 7,5; добавляют к полученной суспензии 75 мл 25%-ного водного раствора глутарового альдегида. Смесь перемешивают в течение двух ч.

Формула изобретения

СПОСОБ. ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ИММОБИЛИЗОВАННОЙПРОТЕАЗЫ

BACILLUS SUBTILIS, включающий активирование матрицы с помощью глутарового . альдегида и последующую иммобилизацию протеазы, отличающийся тем, что, с целью

фильтруют. Осадок на фильтре промывают водой 1 М водным раствором NaCI и вновь водой.

К активированной АЭ-целлюлозе приливают 250 мл раствора, содержащего 1375 мг белка с удельной активностью 2 ед. акт/мг в 0,1 М калий-фосфатном буфере. Смесь инкубируют при непрерывном перемещивании в течение 10-12 ч при 5°С. Полученный продукт отфильтровывают, промывают 1 М водным раствором NaCf до отсутствия оптической плотности в смывах, измеренной при 280 нм, и затем промывают водой-. В результате получают 100 г иммобилизованной протеазы с удельной активностью 32-40 ед. акт/г сухого веса с сохранением активности 17-30% от активности протосубтилина, взятого для иммобилизации при использовании казеина в качестве субстрата.

(56) Goidstefn L. Water Insoluble enzymes Biochemistry 9, 2322, 1970.

Калашникова A.M. Термо-и рН-стабильность растворимой и иммобилизованной на силохроме С-80 протеазы Вас. subtllls. Прикладная биохимия и микробиология 11(6)842, 1975.

увеличения процента сохранения активно2g сти протеазы, в качестве матрицы используют аминоэтилцеллюлозу, а ее активацию проводят в 0,1 - 1 М фосфатном буфере при рН б - 9 в течение не (енее 2 ч.