Способ получения иммобилизованной эндонуклеазы Советский патент 1980 года по МПК C07G7/02 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММСЖИЛЮОВАННСЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ SERll.PkTI К fA/k CESCEW 5

1 . Изобретение относится к обпастн био технологии в чаетноста к способам получения иммс влизованнык ({ рмёнтов, а именно к способу получения иммобилизованной эндонуклеазы Serralia таг-сезсеп и может использоваться в биохимии для гидролвЕза нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) в прсяессах получения олиго-.и 5 -мононуклеотндов. Использование этото пр тарата перспективно в медицине дл лечения гнойных абсцессов и ран. Известен способ получения иммобил&зованньк нуклеаз, в котором нуклеазы к« валентно связывают с гндроксилсодержашими носителями активированными предварвтелЬно бромистым цианом, В качестве носителя чаще всего применяется агароза И. Низкая механическая, термическая cTo kocTB и сильное набухание в воде агаро зы ограничивают область применения ферментного препарата в технологических пр цессах,а применение бромистого циана для- активации агарозы делает недопустимым использомпне этих препаратов в . Наиболее близким по технической су«д ностн к изобретению 1шляется скособ получения иммобилизованной нуклеазы Зе«та «л «агсе-ас«пь. Фермент ковалентво связывают с органич.еским гид роке клсодержаидам полимером - j«. - минобензшюксиме- тилдекстраном при помощи реакции даазосочетаний. Активированный носитель П€шучают из коммерческого препарата декстраjua - попиглюкяна с мол. весом 6ОООО. Способ иммобилизации фермента В8ШЮ чает обработку полиглюки на хлористым Jau -нитробензилоксиметилпиридинием; выделение из полученной смесв -нитробензилоксиметнлполиглюкина{ восстановление последнего до .Л -амйнобензилоксйметшшолиглюкина} диализ, переосажденне и высушивание последнего; диазотирование JU -амйнобензилоксиметипполнглюкина| связывание фермента с диазотированным Л аминобеизилокснметилполиглюкином; отцеленме иммобилизованной нуклеазы от неГ1ро|звагнроваЕшего полйглюкина при помошй гепь-фильтрапии. Полученный ферментный препарат растворим в вопе, при хранении при 12- 5 С и рН 7,0 в течение двух месянев сохраняет СБОЮ активность 2j. , - . ;, 0днако, получение препаративньк количеств иммобилизованной эндонуклеазы вэбестным способом требует специальных методов очистки, таких как гель-фильтрация и диал$5з. Способ трудоемок .многостадкйности. Применетге иммобкля;аованной эндонуклеазы в медицинских не:лях предполагает использование высокоочишенного исходного фермента. Но даже в этом случае возможность ее использо, вания сомнительна, так как нет сведений об антигенных свойствахиммобилизованной нуклеазы. При созданий нйТрерывных технологических процессов получения олигоркбо-, олигодезокси-рибо 5 -нуклеотидов н нонуклеотидов с использованием рас творк мых ферментных препаратов возникает сложная задача отйвления юс от продуктов реакнин. Кроме того, данный способ кммобйлиза ции эндонуклеазы t arcSstens не представляет возможность регулировать и РНК азную активности ферментного препарата, т.е. влиять на спе цифичность эндонуклеазы к одному из суб стратов. . Цель изобретения - упрощение процесса йммобйлйзацийГ расширение. 6(бласти применения иммобилизованной эндонукле азы и увеличение специфичности эндонуклеазы к одному из субстратов. Указанная цель достигается за счет тбго, что процесс получения иммобилизованной эндонуклеазы проводят в присутст- ВИИ субстрата (РНК или ДНК) в качестве полимера используют аминоэтялцедлюлозуф предварительно активированную глутаровым альдегидом, причем обычно количество используемого субстрат С{ ставля9т ,4 вес.%. Процесс осушестёляется следующим образом. Проводят активирование АЭ- еллюлозы раствором глутаровогр альдегида. Затем производят связывание |юрмента с активированной матрицей в присутствии субгстратов {ДНК или РНК) в концентра:нни не менее 2 мг/мл. Полученный пре™ парат обрабатывают раствором NoGH.CTa бплгзироваиный таким образом иммобилв-

735594 зованный препарат промывают солевым раствором. Полученные препараты иммобилизова кой эндонуклеазы обладают высокой удельной активностью, около 140ОО ед./г матрвды. Препарат сохраняет60% активности в течение года при хранении 5-1 и рН 7,0. При гидролизе РНК в проточной колонке в течение 15 дней ферментный препарат полностью сохраняет свою перво- 5шчапьную активность, а при гидролизе Дик в реакторе с перемешиванием за это же время активность препарата падает , незначите-.льно, на 1О%. Пример 1, К5Ог влажной АЭн 1еллюлозы добавляют 150 мл 25%-ного глутарового альдегида и 2ВО мл дистиллированной воды. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2--Х ч Затем активированную АЭ- 1еллюлозу промывают 0,2 М раствором NaCft. К Би г влажной активированной АЭ-целлюлозы. добавляют НО мл водного рас.твора эндонуклеазы, содержащего 1740ЬОО ед.акт. (за единицу эндонуклеазной активности принимают количество фермента, вызывающее увеличение поглощения кислоторастворимых продуктов при 260 нм на 1 о.е. за 2.0 мин при стандартное-опредеneiffie эндонуклеазной активности проводят по РНК) и 0,22 г ДНК. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 ч. Полученный пре- парат иммобилизованной эндонуклеазы отжимают, на стеклянном фильтре и суспендируют в 500 мл 0,1%-ного раствора боргидркда натрия в О,1 М Na-фосфатном буфере (рН 8,0) в течение ЗО мин при 6°С, Стабилизированный таким образом иммобилизованньсй фермент промывают 1 М раствором HciCfi. Препарат иммобилизованной эндонуклеазы гидролизует как ДНК,так и РНК. Удельная активность препаратов, ед.акт/г сухой матрицы: РНКазы 7980; ДНК-азы 14l40. Активность ДНК-азы в 1,8 раз превышает активность РНК-азы. Выход по активности составляет 20%. Пример 2. К5г влажной АЭцеллюлозы добавляют 15 мл 25%-ного глутарового альдегида н 25 мл дистиллированной води; эту смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2-х ч. Затем активированную АЭ-иеллюлозу промывают 0,2 М раствором HaCft. К 5 г влажной активированной АЭнхеллюлог зы добавляют 24 мл водного раствора эндонуклеазы, содержащего 5800ОО ед. акт. и 0,096 г т-РНК. Реакционную сме перемешивают при комнатной температур в течение 5 ч. Полученный препарат имм билизованной эндокукпеазы отжимают на стеклянном фильтре и суспендируют в 50 мл 0,1%-ного раствора боргидрида натрия в 0,1 М Ыо-фосфатном буфере рН 8fO в течение ЗО мин при 6°С. Ста-янэированный таким образом иммобилизованный фермент промывают 1 М раст вором NoCU. Препарат иммобилизованной эндонуклеазы гидролизует как ДНК, так и РНК, Удельная активность препаратов, ед,акт/г сухой матрицы: РНК-азы 14063 ДНК-азы 7050. Активность РНК-азы в 2 раза превышает активность ДНК-азы. Выход по активности составляет 10%. Как видно из примеров, связывание эн донуклеазы в присутствий одного из субстратов приводит к избирательному повышению удельной активности по оДному из субстратов в 1,5-2 раза. Это позволяет применять иммобилизованную эндонуклеазу для преимущественного гидролиза ои ного из субстратов (ДНК и РНК), если они оба содержатся в реакционной смеси. К преимуществам во до нерастворимой . иммобилизованной эндонуклеазы относятся высокая стабильность, простота отделения нерастворимого ферментного препарата от продуктов реакции,возможность многократного использования в периодических твехнологических процессах и длительного использования в непрерывных процессах для получения олигорибо-, олигодезокси-р о-5-нуклеотидов и 5 -мойонуклеотидов. Кроме того, способ не тре бует высокоочищенного исходного фермента, а нерастворнмьш производные нуклеаз перспективны как фармацевтические препараты для местного лечения гнойных ран. Фор М у ла изобретения 1,Способ получения иммобилизованной эндонуклеазы S,erro1ia тагев&свпа путем ковалентного связывания с органическим гйдроксилсодержащим полимером, о тлич ающийся тем, что, с целью упрощения пррцесса иммобилизации, расширения области применения иммобилизованной ёндонуклеазы и увеличения специфичности эндонуклеазы к одному из субстратов {РНК или ДНК) в качестве органического гидроксйлсодержащего полимера используют аминоэтшщеллюлозу, предварительно активированную глутаровым альдегидом, и процесс осуществляют в присутствии соответствующего субстрата. 2. Способ по п.-1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что субстрат применяют в количестве 0,2-0,4 вес,%. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе l.Omenn G.S., tl.A., ЛпГтйеп; С-ft,, FracVioncaVion oi nllhoo tes ag-o n t Sicjphy ococcoi6 on Sephc«rc)9,e ImrnunoacisorHenis (Halur-e 225 189, 197O. 2.Куряненко Б. М, Калачова И. В,, Габдуллина Г, К. Стабилизация нуклеаз ковалеятиым связыванкем с растворимым декстраном. - Виоорганическая химия , 1(4), 483, 1975 (прототип).