Способ получения рибо- и дезоксирибонуклеозид-5 @ -трифосфатов Советский патент 1989 года по МПК C07H19/10 C12N11/06 

стран, полиэтиленгликоль (ПЭГ),в концентрациях 1,0-1,5 и 5-10 мас.% соответственно .

Полученный после центрифу ирова- ния смеси супернатант, содержащий ПЭГ, используют в качестве комплексного ферментного препарата, содержащего ацетокиназу и оптимальный набор нуклеотидилкиназ , позволяющий полу- ю чать рибо- и дезоксирибо11уклеозид-5 - трифосфаты с высоким выходом, а именно выход в синтезе всех НФТ составля- ет 95-98% или 350-400 г/кг биомассы.

Пример 1. Операции по очи- 15 стке комплексного ферментного препарата нуклеотидилкиназ проводят при 0-4°С.

100 г замороженных клеток E.coli MRE-600 суспендируют в 300 мл 0,1 М 20 калийфосфатного буфера рИ 7,8. В суспензию добавляют 200 мг лизоцима, предварительно растворенного в 40 мл буфера, выдерживают в течение 45 мин при постоянном перемешивании. После 25 зтого суспензию озвучивают в ледяной бане на ультразвуковом дезинтеграторе (18 кГц) в три сеанса по 1 мин с минутными перерывами. Затем в полученную клеточную суспензию добавляют 30 0,1 М калийфосфатный буфер рН 7,8, содержащий 20%-ный раствор декстрана (м.в. 500000) и 40%-ный pacTirop ПЭГ (м.в. 6000), до конечных концентраций 1,2 и 7,0% соответственно. Смесь пе- з5 ремешивают в течение 20 мин, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин. Верхнюю фазу, содержащую ПЭГ, сливают . и используют как комплексный ферментный препарат. Ферментный препарат им-дО мобилт - уют на аминопропилсилохроме, активированном глутаровым альдегидом. Для активации 100 г (вл.мас.) АПС используют реакционную смесь следующего tcстава: 90 мл 25%-ного глутаро-45 вого апьдегида, 540 мл 1 М калийфосфатного буфера рН 7,8. Реакцию активации проводят в течение 3 ч при ком- .натной температуре при перемешивании реакционной смеси вращением колбы. --. По окончании реакции сорбент отмывают от глутарового альдегида водой. Иммобилизацию проводят при нагрузке по белку на матрицу 50 мг/г вл.мас. и концентрации белка в реакционной смеси 5 мг/мл в 0,1 М калийфосфатном буфере рН 7,8 при комнатной температуре в течение 3 ч при перемешивании реакционной смеси вращением колбы.

Затем иммобилизованный ферментный препарат обрабатывают при перемешивании двойным объемом 0,2%-ного раствора боргидрида натрия в течение 1 ч при 2-4°С. После этого ИФП про- мьшают 0,5 М раствором хлористого калия в 0,5 М калийфосфатном буфере рН 7,5, затем 0,05 М калийфосфатным буфером рН 7,5. Количество иммобилизованного белка в 1 г готового ИФП 25 мг.

Реакционную смесь, содержащую в 1 л 0,05 М калийфосфатного буфера (рН 7,5)5 г гуанозин-монофосфата (ГМФ), 18,41 г ацетилфосфата, 16,24 г MgCl, .,10 г АТФ, 150 мкм р-меркап- тоэтанола, 100 г ИФП, инкубируют при 37°С при перемешивании вращением колбы. Полноту синтеза ГТФ определяют ионообменной хроматографией на микроколонке с анионообменником Дауэкс 1x2. Выход ГТФ в синтезе составляет 98%,

Целевой продукт ГТФ из реакционной смеси вьщеляют известным способом. Для этого реакционную смесь с целью разделения ее компонентов хроматогра- фируют на колонке объемом 1 л, заполненной анионообменником АВ 17x2. Элю- цию проводят линейным градиентом хлористого натрия (0-0,5 М) в 3 мМ НС1 Элюат ГТФ собирают фракциями по 0,5 л нейтрализуют до рН 7,0, затем концентрируют упариванием при 37°С до концентрации соли в нем 1 ,5 М. Продукт выделяют осаждением из сконцентрированного элюата предварительно охлаж,- денной до -15-20°С смесью 2М НС1 - 96%-ный этиловый спирт при соотношении концентрат ГТФ-2М НС1 - этиловый спирт 1:1/10:10, приливая вначале при перемешивании раствор кислоты, затем этиловый спирт. Для формирования осадка ГТФ смесь вьщерживают при 15-20 С в течение 1 ч. Осадок отделяют центрифугированием при 3 тыс.об/ /мин в течение 15 мин при 2-4°С. Затем аналогичным образом проводят очистку ГТФ переосаждением, при этом осадок ГТФ предварительно растворяют в воде. Полученный осадок ГТФ промывают этанолом и лиофильно сушит. Выход готового продукта составляет 4,6 г.

Препарат идентифицируют методом тонкослойной хроматографии, используя пластины силуфола или кизельгеля 60 F 254 в системе диоксан-изопропиПример 10. Ферментный препарат выделяют из 200 г клеток E.coli MRE-600 аналогично примеру 1. Ферментный препарат иммобилизуют на ами- нопропилсилохроме, активированном глутаровым альдеподом, В реакционную смесь, содержащую 5 г уридинмонофос- фата, загружают 180 г ИФП. Выход УТФ составляет 96%.

Пример 11. Ферментный препарат выделяют из 50 г клеток E.coli В, инфицированных фагом Т4 am № 82, и иммобилизуют на аминопропипсилохроме, активированном глутаровым альдегидом, аналогично примеру 1.

В реакционную смесь, содержащую 5 г аденозинмонофосфата, загружают 50 г HdiFl. Выход АТФ в синтезе составляет 98%, выход готового продукта 6,0 г,

Выходы АТФ в синтезе и выходы готовых препаратов АТФ при дальнейшем использовании указанного ИФП приведены в табл.2.

Пример 12. Ферментный препарат выделяют из 50 г клеток E.coli В, инфицированных r iaroM Т4 am № 82, аналогично примеру 1, за исключением того, что использу:эт 0,1 М натрийборатный буфер рН 7,8. Ферментный препарат иммобилизуют на АПС аналогично примеру 1, за исключением того, что на стадии иммобилизации ис- пользувот 0,1 М натрийборатный буфер рН 7,8.

В реакционную смесь, содержащую 5 г дезокситим1щи1шонофосфата, загружают 60 г ИФП. Выход дТТФ в синтезе составляет 97%, выход готового препарата ;7ТТФ 5,3г.

Пример 13. Ферментный препарат выделяют из 50 г клеток E.coli MRE-600 аналогично примеру 1. Фер- . ментньй препарат иммобилизуют на аль- дегидосилохроме, полученном модификацией силохрома с помощью (3,3-ди- этоксипропил)триэтоксисилана, в лабораторных условиях НИКТИ БАБ.

Иммобилизацию проводят при нагрузке по белку на матрицу 50 мг/г вл.мас. и концентрации белка в реакционной смеси 5 мг/мл в 0,1 М калий- фосфатном буфере рН 7,8 при комнатной температуре в течение 3 ч при перемешивании реакционной смеси вращением колбы. Дальнейшую обработку иммобилизованного фермента препарата проводят аналогично примеру 1. Коли

0

5

0

5

0

5

0

5

чество иммобилизованного белка в 1 г готового ИФП 30 мг.

В реакционную смесь, содержащую 5 г дезоксицитидинмонофорфата, загружают 55 г ИФП. Выход дЦТФ в синтезе составляет 98%, выход готового препарата 3,0 г.

Пример 14. Ферментный препарат вьщеляют из 50 г клеток E.coli MRE-600, инфицированных фагон Т4 am № 82, аналогично примеру I. Затем ферментный препарат иммобилизуют на аминопропилсилохроме, активированном глутаровым альдегидом.

В реакционную смесь, содержащую 5 г дезоксигуанозинмонофосфата, загружают 50 г ИФП. Выход дГТФ в синте- |3е составляет 96%, выход целевого продукта 4,6 г.

Условия получения НТФ и выход продуктов приведены в табл.З.

Формула изобретения

1.Способ получения рибо- и дез- оксирибонуклеозид-5 -трифосфатов,, включающий разругаение клеток биомассы Escherichia coli В или E.coli MRE-600, инфицирован№ Х фагом Т4 am

№ 82, выделение из полученной клеточной суспензии комплексного ферментного препарата, содержащего нуклеоти- дилк1Л1азу и ацетокиназу, иммобилизацию последнего на активированной матрице и последующее фосфорилирование соответствующих рибо- и дезоксирибо- нуклеозид-5 -монофосфатов с помощью полученного иммобилизованного ферментного препарата с добавлением в реакциоиную смесь ионов Mg, ацетил- фосфата, АТФ или дАТФ в случае синтеза дАТФ и фосфатного буфера, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода целевых продуктов, комплексный ферментный препарат выделяют путем обработки клеточной суспензии буферным раствором, содержащим декстран, полизтиленгликоль в концентрациях 1,0-1,5 и 5-10 мас.% соответственно, а. фосфорнлирование соответствующих нуклеозид-5 -монофосфатов иммобилн- /зованным комплексным ферментным препаратом проводят при соотношении 1: (10-20) соответственно.

2.Способ ПОП.1, о тлич аю- щ и и с я тем, что в качестве буферного раствора используют калийфосфатловый спирт - 5М аммиак - 1 М ацетат аммония - 30:18:49:3. Содержание УФ- поглощающих примесей в препарате 2%, содержание основного вещества 99%.

Пример 2, Ферментный препарат выделяют из 50 г кпеток E.coli В инфицированньпс фагом 14 am № 82, аналогично примеру 1, за исключением того, что используют декстран и ПЭГ в концентрациях I и 5% соответственно. Ферментный препарат иммобилизуют на аминоэтилцеллюлозе, активированной глутаровым альдегидом, аналогично примеру I, за исключением того, что иммобилизацию проводят при в течение 14 ч.

Хроматографию и выделение дТТФ проводят аналогично примеру 1, за исключением того, что для 1люации ком- понентов реакционной смеси используют хлористый литий, а осаждение продукта проводят смесью метанол-ацетон при соотношении концентрат дТТФ - метанол - ацетон 1:1:10, приливая вначале при перемешивании метанол, затем ацетон.

Препарат идентифицируют тонкослойной хроматографией, используя пластины силуфола или кизельгеля 60 F 254 в системе дкоксан - изопропиловый Спирт - 2М аммиак - 1М ацетат аммония 30:20:47:3. Содержание УФ-пог- лощающих примесей в препарате 2%, содержание основного вещества 97%.

Условия препаративного выделения продуктов НТФ, их иденти икация, степень чистоты представлены в табл.1.

Пример 3; Ферментный препа- рат выделяют из 50 г клеток E.coli В, инфицированных фагом Т4 am № 82, аналогично примеру 1, за исключением того что используют декстран, ПЭГ в концентрациях 1 и 5% соответственно, ферментный препарат иммобилизуют на аминоэтилцеллюлозе, активированной глутаровым альдегидом.

В реакционную смесь, содержащую 5 г дезокситимидинмонофосфата, загружают 60 г ИФП. Выход дТТФ составляет 96%.

Пример 4. Ферментный препарат выделяют из 50 г клеток E.coli MRE-600 аналогично примеру 1, за ис- ключением того, что используют декстран- и ПЭГ в концентрациях 1,5 и 10% соответственно. Ферментный препарат иммобилизуют на аминопропилсилохроме,

активированном глутаровым альдегидом В реакционную смесь, содержащую 5 г дезоксицит динмонофосфата, загружают 65 г ИФП. Выход дЦТФ составляет 97%. Пример 5. Ферментный препарат выделяют из 100 г клеток E.coli MRE-600 аналогично примеру 2, па исключением того, что используют декстран и ПЭГ в концентрациях 2 и 12% соответственно. Ферментный препарат иммобилизуют на амгио-этилцеллюлозе, активированной альдегидом. В реакционную смесь, содержащую 5 г уридинмонофосфата, загружают 90 г ИФП. Выход УТФ составляет 89%.

Пример 6. Ферментный препарат выделяют из 100 г клеток E.coli MRE-600 аналогично примеру I, за исключением того, что использ Ьот декст ран и ПЭГ в концентрациях 1,4 и 9% соответственно. Ферментный препарат иммобилизуют на аминоэтилцеллюлозе, активированной глутаровым альдегидом В реакционную смесь, содержащую 5 г уридинмонофосфата, загружают 100 г ИФП. Выход УТФ составляет 98%.

П р и м е р 7. Ферментный препарат выделяют из 50 г клеток E.coli В, инфицированных фагом Т4 am № 82, аналогично примеру 1, за исключением того что используют декстран и ПЭГ в концентрациях 0,8 и 4% соответственно. Ферментный препарат иммобилизуют на аминопропилсилохроме, активированном глутаровым альдегидом. В реакционную смесь, содержащую 5 г дезоксиадено- зинмонофосфата, 0,81 г дАТФ, загружают 60 г ИФП. Выход дАТФ составляет 92%.

Пример 8. Ферментный препарат выделяют из 30 г клеток E.coli MRE-600 аналогично примеру 1. Ферментный препарат иммобилизуют на аминопропилсилохроме, активированном глутаровым альдегидом.

В реакционную смесь, содержащую 5 г цитидинмонофосфата, загружают 30 г ИФП. Выход ЦТФ составляет 65%.

Пример 9. Ферментный препарат выделяют из 30 г клеток E.coli В, инфицированных г фагом Т4 am № 82, аналогично примеру I, иммобилизуют КФП на аминоэтилцеллюлозе, активированной глутаровым альдегидом.

В реакционную смесь, содержащую 5 г дезоксигуанозинмонофосфата, загружают 25 г ИФП. Выход дГТФ составляет 85%.

91493644 О

ный или натрийборатный буфер рН 7,5- вированиой матрицы используют ами-

7,8.

3. Способ ПОП.1, о тлич аю- щ и и с я тем, что в качестве актинопропилсилохром или aминoэtилцeллю- лозу, активированные глутаровым альдегидом .

нопропилсилохром или aминoэtилцeллю- лозу, активированные глутаровым альдегидом .

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии и может быть использовано в биохимической промышленности для производства рибо- и дезоксирибонуклеозид-5¹-трифосфатов. Цель изобретения - упрощение способа и повышение выхода целевых продуктов. Исходную биомассу E.COLI разрушают, полученную клеточную суспензию обрабатывают калийфосфатным буферным раствором рН 7,5, содержащим декстран, полиэтиленгликоль (ПЭГ) в концентрациях 1,0-1,5 и 5-10 мас.% соответственно. Смесь центрифугируют, супернатант, содержащий ПЭГ, иммобилизуют на аминопропилсилохроме или аминоэтилцеллюлозе и используют для фосфорилирования соответствующих нуклеозид-5¹-монофосфатов с добавлением в реакционную смесь ионов MG²⁺, ацетилфосфата, АТФ или дАТФ в случае синтеза дАТФ и калийфосфатного буфера рН 7,5. Выход всех рибо- и дезоксирибонуклеозид-5¹-трифосфатов составляет 95-98%. Способ прост в технологическом отношении и может без дальнейшей доработки использоваться в промышленности. 2 з.п.ф-лы, 3 табл.