Способ получения иммобилизованной рибозофосфатизомеразы Советский патент 1987 года по МПК C12N11/00 C12N9/90 

Изобретение относится к способам получения иммобилизованных ферментов, которые могут найти применение в производстве химических реактивов и для биотехнологических исследований.

Цель изобретения - увеличение стабильности и удельной активности им- мобилизрванной рибозофосфатизомера- зы, а также ускорение процесса.

Изобретение заключается в том, что при иммобилизации фермента на аминоэтнл-целлюлозе (АЕ-целлюлоза) используют в качестве попёречно-сши вающего реагента глутаровый альдегид, is Эту смесь инкубируют в течение 1 ч

20

5

35

который добавляют не к ферменту, а к носителю. Подбор условий иммобилизации (глутарового альдегида, натрий- Фосфатного буфера в концентрации 0,008-0,012 М с рН 7,0-7,2, времени инкубации 50-60 мин) позволяет по сравнению с известным способом в два раза увеличить удельную активность иммобилизованного фермента, в 9 раз повысить стабильность препарата и в 4 раза ускорить процесс иммобилизации .

Способ иллюстрируется следующими примерами осуществления.

Пример I.Kir АЕ-целлюлозы зо приливают 50 мл 0,5 н. NaOH, перемешивают и через 5 мин сливают. Затем АЁ-целлюлозу отмывают дистиллированной водой 8-10 раз по 50-100 мл до рН 7-8. Далее к АЕ-целлюлозе приливают 50 мл 0,5 н. НС1, перемешивают и через 2 мин сливают. АЕ-целлюлозу отмывают дистиллированной водой до рН 4-5 (6-8 раз по 50-100 мл). После этого к АЕ-целлюлозе приливают 50 мл 0,5 н. NaOH, перемешивают и выдерживают 30 мин при комнатной температуре (18-20t) . Затем отмьшают АЕ-целлюлозу дистиллированной водой до нейтральной рН (10 раз по 100 мл). Далее к АЕ-целлюло зе приливают 50 мл 0,5 М натрий-фосфатного буфера с рН 7,0. Через 10 мин раствор сливают.

Активирование АЕ-целлюлозы проводит следующим образом.

К АЕ-целлюлозе приливают 10 мл 2,5%-ного раствора глутаральдегида в О,-5 М натрий-фосфатном буфере с рН 7,0 (к 1 мл 25%-ногб водного раствора глутаральдегида добавляют 9 мл . 0,5 М натрий-фосфатного буфера с рН 7,0) и вьщерживают в течение 1 ч при комнатной температуре при слабом периодическом встряхивании. После чего

40

45

50

55

при комнатной температуре, периодически слабо перемешивая или встряхи вая. Затем раствор сливают и иммоби лизованную рибозофо.сфатизомеразу от мывают 2-3 раза по 50 мл 0,01 М нат рий-фосфатным буфером с рН 7,0. При этом конечный буфер (которым промыв ют препарат)не содержит белка, что определяют по поглощению раствора при 280 нм.

Затем иммобилизованную рибозофос фатизомеразу отмывают 2 раза по 50 м 0,5 М раствором NaCI в 0,01 М натри фосфатном буфере с рН 7,0. Такая пр цедура позволяет определить количес во фермента, ковалентно связанного носителем. Этот способ позволяет св зывать до 7-8 мг фермента на 1 г ак тивированной АЕ-целлюлозы. При этом удельная активность иммобилизованно рибозофосфатизомеразы составляет 50

60% от удельной активности исходног ферментного препарата рибозофосфатизомеразы. Удельная активность преп рата составляет 16 ед./1 мг белка.

Пример 2. Способ осуществл ли как описано в примере 1, но рН буфера для иммобилизации составлял 6,5; 6,8; 7,2; 7,5. Удельная активность иммобилизованного фермента пр этих значениях рН была .равна соотве ственно 6, 12, 15 и 8 ед./мг белка. Следовательно, оптимальная величина рН буфера равна 7,0-7,2.

Пример 3. Способ осуществл ли как описано в примере 1, варьиру концентрацию буфера - 0,015; 0,012; 0,008; 0,005 и 0,001 М. Удельная ак тивность фермента в этих условиях составлял а соответственно 10, 13, 1 8 и 6 ед./мг белка, оптимальная кон центрация буфера 0,08-0,012 М.

При мер 4. Способ осуществл ли как описано в примере 1, варьиру

носитель промывают 10 раз дистиллированной водой (по 100 мл) для удаления избытка глутдральдегида. Отмытую дистиллированной водой АЕ-целлюлозу забуферивают 0,01 М натрий-фосфатным буфером с рН 7,0 добавлением 50 мл буфера. Буфер сливают и АЕ-целлюлозу еще дважды промывают новыми порциями того же буфера.

К активированной таким образом АЕ-целлюлозе приливают 3-5 мл ферментного препарата рибозофосфатизоме- разы (концентрация белка 4-10 мг/мл).

0

5

5

о

0

5

0

5

при комнатной температуре, периодически слабо перемешивая или встряхивая. Затем раствор сливают и иммобилизованную рибозофо.сфатизомеразу отмывают 2-3 раза по 50 мл 0,01 М натрий-фосфатным буфером с рН 7,0. При этом конечный буфер (которым промывают препарат)не содержит белка, что определяют по поглощению раствора . при 280 нм.

Затем иммобилизованную рибозофос- фатизомеразу отмывают 2 раза по 50 мл 0,5 М раствором NaCI в 0,01 М натрий- фосфатном буфере с рН 7,0. Такая процедура позволяет определить количество фермента, ковалентно связанного с носителем. Этот способ позволяет связывать до 7-8 мг фермента на 1 г активированной АЕ-целлюлозы. При этом удельная активность иммобилизованной рибозофосфатизомеразы составляет 5060% от удельной активности исходного ферментного препарата рибозофосфатизомеразы. Удельная активность препарата составляет 16 ед./1 мг белка.

Пример 2. Способ осуществляли как описано в примере 1, но рН буфера для иммобилизации составлял 6,5; 6,8; 7,2; 7,5. Удельная активность иммобилизованного фермента при этих значениях рН была .равна соответственно 6, 12, 15 и 8 ед./мг белка. Следовательно, оптимальная величина рН буфера равна 7,0-7,2.

Пример 3. Способ осуществля-- ли как описано в примере 1, варьируя концентрацию буфера - 0,015; 0,012;, 0,008; 0,005 и 0,001 М. Удельная активность фермента в этих условиях составлял а соответственно 10, 13, 14, 8 и 6 ед./мг белка, оптимальная концентрация буфера 0,08-0,012 М.

При мер 4. Способ осуществляли как описано в примере 1, варьируя .

ремя иммобилизации 45-70 мин. При времени инкубации 50 и 55 мин активность фермента составляет 15 ед/мг белка, а при 45 и 60 и выше - 13 и 16 ед./мг белка. Оптимальное время . инкубации 50-60 мин, так как увеличение длительности инкубации нецелесообразно, поскольку оно не приводит к повышению активности фермента.

Стабильность полученного препарата при хранении4 определенная как время, в течение которого теряется 50% активности, составляет 60 дней (Т 60 дней). Время, необходимое для проведения иммобилизации 7 ч.

Таким образом, по сравнению с известным способом предлагаемый позволяет увеличить стабильность и удельную активность иммобилизованного фермента соответственно в 9 и 2 раза, а также в 4 раза ускорить процесс иммобилизаций.

Предлагаемый способ позволяет получить -иммобилизованный ферментный

препарат рибозофосфатизомеразы, пригодный для использования его при создании модельных систем фиксации углекислоты, что имеет важное практическое значение.

Формула изобретения Способ получения иммобилизованной

рибозофосфатизомеразы, заключающийся в иммобилизации фермента на амино- этил-целлюлозе с помощью поперечно- сшивающего реагента в буферном растворе и последующем отмывании несвязанного белка, отличающий- с я тем, что, с целью увеличения . стабильности и удельной активности целевого продукта, а также ускорения процесса, в качестве поперечно-сшивающего реагента используют глутаровый альдегид, который добавляют к амино- этил-целлюлозе до внесения фермента, а иммобилизацию проводят в 0,008- 0,012 М натрий-фосфатном буфере при РН 7,0-7,2 в течение 50-60 мин.

Изобретение относится к технологии получения иммобилизованных ферментных препаратов. Оно может быть использовано в производстве химических реактивов, для биотехнологических целей при создании модельных систем, фиксирующих углекислоту. Цель изобретения - увеличение стабильности и удельной активности иммобилизованной рибозофосфатизомеразы, а также ускорение процесса. Сущность способа заключается в том, что проводят иммобилизацию данного фермента на амино- этил-целлюлозе, которую предварительно активируют глутаровым альдегидом, причем связывание фермента осуществляют в 0,008-0,012 М натрий-фосфатном буфере с рН 7,0-7,2 в течение 50-60 мин. Способ позволяет получить фермент с повьшенной (в 2 раза) удельной активностью и стабильностью. (Л СлЭ to 05 05