Способ иммобилизации нуклеиновых кислот Советский патент 1984 года по МПК C12N11/12 

Изобретение относится к области биохимии, а именно к способам ШФюбилизации нуклеиновых кислот. Способ может быть применен для полу.чения эффективных сорбентов для аффинной хроматографии белков.

Известен способ иммобилизации нуклеиновых кислот путем включения их в гранулы полиакриламидного геля tlj.

Недостатками этого способа являйтся низкое содержание нуклеиновой кислоты в препаратах, неустойчи.вость препаратов к действию нуклеаз невозможность иммобилизации низкомолекулярных нуклеиновых кислот и плохие гидродинамические свойства hperiapaTOB.

Известен ряд способов иммобилизации нуклеиновых кислот посредством связывания их с активированной матрицей С2-4 . Эти Способы сводятся к |следую1цему:: гидрофильную матрицу, чаще всего агарозу, обрабатывают бромистым цианом с целью активации, затем промывают водными растворами солей (NaCl или.КС1) и водой. К активированной матрице приливают раствор нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) и Инкубируют смесь. Затем промывают препараты водными растворами солей (NaCl .С) для удаления несвязавшихся нуклеиновых кислот.

Таким образом, получают препараты иммобилизованных нуклеиновых кислот с содержанием ДНК или РНК 0,3-0,6 мг/г матрицы (0,050,1 мг/мЛ геля}. Полученные преhapaTH подвержены действию нуклеаз и период их полужизнй составляет 5-10 дней натийную ДНК таким способом иммобилизовать невозможно.

Недостатками этих способов являются использование токсичного вещества, бромистого циана, низкое содержание нуклеиновых кислот в продукте, нестабильность препаратбв Ьри взаимодействии с нуклеазами, невозможность иммобилизации натизвной ДНК.

Р1звестен также способ иммобилизации нуклеиновых кислот, ДНК и РНК С5 , заключающийся в той, что порошок целлюлозы пропитывают растворами нуклеиновых Кислот, смесь размазывают тонким слоем и сушат в токе вОзду са в течение 16-24 ч. Затем сухой продукт суспендирует в спирте и суспензию облучают ртутной лампой мощностью 100000 эрг/г в течение l5-ЗО МИН. Спирт отфильтровывают, готовьй продукт промывают водным раствором NaCl и водой. Выход по связыванию ДНК 90%, по связыванию РНК 23-25%. Этим способом получают препараты, содержащие

13 мг ДНК/г матрицы и 1 мг РНК/г матрицы.

Недостатками этого способа являются длительность получения препарата (2 сут), низкое содержание нуклеиновых кислот в готовом продукте, низкий выход по связыва- , нию РНК и низкая устойчивость продукта к воздействию . нуклеаз. Цель изобретения - упрощение

0 процесса иммобилизации, увеличение содержания нуклеиновых кислот в готовом продукте, увеличение выхода по связыванию РНК и повышение устойчивости продукта к действию

5 нуклеаз.

Цель достигается за счет того, что сорбцию нуклеиновых кислот производят на аминоэтилцеллюлозе при 60--100°С в течение 15-40 мин с поQ следующим введением в реакционную смесь глутарового альдегида до содержания его в смеси, равного 0,254%, и выдерживанием смеси при 20ЮО С в течение 120-10 мин.

5 Процесс проводят следующим образом.

В качестве носителя берут АЭ-целлюлозу отечественного производства (Биохимпрепарат, г.Олайне) или производства Реанал (Венгрия),

0 Иммобилизации подвергают ДНК из тимуса и молок лососевых рыб (СКТБ БАБ и Koch-Light и РНК из печени и E.coli MRE-600 (СКТБ ВДВ).

Способ включает следующие стадии.

5 1. Нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК) собирают из водного раствора на ЛЭ-целлюлозе в течение 15-40 мин. Содержание нуклеиновых кислот в водном растворе составляет до 60 мг/мл;

0 Увеличение времени сорбции от 15 до 40 мин позволяет получить препарат с более высоким содержанием нуклеиновых кислот. Дальнейшее увеличение времени сорбции практически не приводит к увеличению связывания нуклеиновых кислот. Уменьшение времени (менее 15 мин) приводит к получению препарата с низким содержанием нуклеиновых кислот, что нежелательно.

2, Обрабатывают получаенную суспензию нерастворимого комплекса АЭ-целлюлоза - нуклеиновая кислота водным раствором глутарового альдегида при 20-100°С в течение 12010 мин. Концентрацию глутарового аль дегида в реакционной смеси поддерживают равной объемным 0,25-4,0%. Указанные концентрации глутарового альде гида оптимальны и свойства полученных препаратов идентичны. Уменьшение

0 концентраций приводит к увеличению рабочих объемов, а увеличение концентрации создает неудобства при перемешивании массы. Перемешивание необходимо Для равномерного распреде5 .ления глутарового альдегида по

объему. Увеличение температуры nr iMOбилиэации приводит к сокращению времени обработки.

3, Полученную суспензию отфильтро Бывают на фильтре водным раствором ЫаС1 и водой для удаления несвязавшихся нуклеиновых кислот,

Таким образом, иммобилизуется 80-90% нуклеиновы5 кислот, внесенных в реакционную смесь. Содержание нуклеиновых кислот в препаратах составляет до 130 мг/г сорбента. Способ позволяет получать rtjJenapaTbi, содержавшие заданное коли 1ество нуклеиновых кислот. Длительность процесса тгоЛу 1ений иммйбйлизованных иуклёиновь х кислот составляет 0,53 ч в зависимости от условий реакЦии, .. ,,..,. -; Препараты йммобилиэованнйх нуклей Новйх кйслот на Аэ-целлюлозе устойчивй к действию нуклеаз как в условиях хроматйграфии, так и в жёстких УСЛОВИЯХ, при йсчерпывакедём гйдролйЭе йз« Му1{Леаэой Serratia marcescens (20 ч при температуре ). В условиях хроматографии сродства на колонке иммббилйзбванной ДНК препаратов терйииальной дезоксинуклеотидйлтрнасфераэы КЗ тимуса, содержащий принеси нуклеаз, иммобилизованмай ДНК пбЛйЪстьй стабильна и получаемый прёпарйт феЕмента не содержит примесей иуклейновых кислот,

При ис ерпыёагощем Гидролизе иммобилизованных ДНК и РНК нуклеазой Serratla marcescens от препаратов, срдерясащйх денатурировайные ДНК и РНК б.тщёпляется 10-18% нуклеЬтидного материала, а от препаратов,содержащих активную ДНК - 41%. В то же , аналогичная обработка нуклеазой препаратов, не обработанных глу таровым альдегидом, приводит к отщеплению 65% нуклеотидного материала. Препараты иммобилизованных нуклеиновых кислот на АЭ-целлюлозе стабильны в. течение года при многократном использовании и хранении, Использование им юбилизoвaннoй ДНК в качейтйе сорбента для хроматографии средства терминальной дезоксинуклеотидилтрансфераэы из тимуса позволяет провести очистку фермента по белку в 3-5 раз с выходом активности 6075%, очистку от нуклеаз в 15-30 раз, очистку от фосфодиэстераз в 50200 раз.

Пример 1, 25 мл водного раствора денатурированной ДНК или РНК с концентрацией 10 мг/мл (200 об, е,/мл, измеренные при 260 им на приборе СФ-16), погружают в воду, имеющую температуру кипящей водяной бани, на 10 мин и всыпают в нее 10 г влажной АЭ-целлюлозы (4 г суЗсого веса). Смесь выдерживают в течение 15 мин на кипящей водяной

бане при постоянном перемемиваНий, Затем добавляют 6Мп3%-ного водного раствора глутарового альдегида до концентрации его в реакционной смеси 0,5 Об,% и инкубируют смесь еще в течение 10 мин на кипящей водяной ёане. Полученный осадок, представляющий сОбоЙ иммобилизованную нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК), переносят на стеклянный порис0тый фильтр, промывают водным раствором 1м NaCl до Отсутствия оптиШской плотности ДНк в промывных водах и водой,

Связывание нуклеиновых кислот с

5 ДЭ-целлюлозой 80-90%, содержание нуклеиновых кйслОт 50-60 мг/г матрицы.

Иммобилизованная РНК стабильна в условиях хрОйатрграфйи ферментных препаратов, содержащих нуклеазы.

0 При исчерпывающем гидролизе эндонук-, лeaзoйSerratia/merc.ecsceйs (20 ч При ) от матрицы отщепляется не более 18% нуклеотидного материала, Связанного с матрицей. Препара5ты стабильны в течение года при ЛерирдНЧёском использовании и хранении при 4°С.

П р и м е р 2, №1Мо(ЗйЛизат ;йю нуклеиновых кислОт проводят как в

0 примере 1, за исключением того, что для и fr1oбилизaции берут ВО мл водного раствора денатурированной нуклеиновой кислоты и инкубируют с :АЭ-целлюлозой в течение 30-мин. При

5 9ТОМ получают препараты иг««1обилизованных нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) с содержанием ДНК или РНК 100120 мг/г матрицы.

Пример 3, Иммобилизация

0 нативной ДНК,

К 2 г влажной АЭ-цёллюлозы (0,66 г сухого веса приливают 11 мЛ раствора ДНК с концентрацией 2,3 мг/мл. Инкубируют смесь в течение 20 мин при 60°С при непрерывном перемешивании.

5 Затем в смесь вливают 1 мл 3% глутарового альдегида до концентрации его в реакционной смеси 0,25 об,% и инкубируют в течение 2 ч при 25с при непрерывном перемешивании. После

0 окончания выдержки смесь переносят на стеклянный фильтр, промь вают водным раствором 1М NaCl до отсутствия оптической плотности ДНК в элюате и водой, .

5

Получают препарат, содержащий 30 мг (ДНК) г сухого веса препарата. Выход по иммобилизации ДНК составил 80%, При проведении исчерпывающего гидролиза энденуклеаэой от мат0рицы отщепляется 40% иммобилизованной ДНК, При аналогичной ,обработке образца, необработанного альдегидом, отщепляют 65% ДНК.

Пример 4. Иммобилйзаци нуклеиновых ки.слот проводят как в при5мере I, за исключением того, что в смесъ 1обавляют 5 мл 25%-ного йодйо )адтёо|зй глута ового альдегида (концентрация глутарового альг егида й реакционной сйеЪи сосгйвляе 4,0 O6.I). тСйяэвгоаНиё нуклеиновых кислот с АЭ-целлюлоэой 80-90%, сидержание нуклеиновых кислот 50 ,60 мг/г. При исчертывающем г идролизе эндонуклеазой Sefratla marcecscena от препарате отщепляется не 5 более 20% содержащейся в нем ДНК.

СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ НУ]КЛЁ. ИНОВЫХ КИСЛОТ, включающий сорбцию нуклеиновых кислот из водных растворов на целлюлозу, обр^абот'ку, приводящую к ковалентнс»1у связывания нуклеиновой кислоты с целлюлозой, и отмывку продукта водными растворами Had и. водой, отличаю?* . щ и и с я тем, что, с целью упрощения процесса, увеличения содержа- н^я нуклеиновых кислот в готовом продукте, увеличения выхода по связы ванию РНК и повышения устойчивости продукта к действию нуклеаз, сорбцию нуклеиновых' кислот проводят, на аминоэтилцеллюлозе при 60-100°С в течение 15-40 мин с последующим введением в' реакционную смесь глута- рового альдегида до содержания его;в смеси, равного 0,25-4%, и выдерживанием смеси при 20-100''с в те-.чение 120-10 мин.'(/)с сО)at) елСП)со ел