Способ получения иммобилизованных нуклеофильных лигандов Советский патент 1985 года по МПК C12N11/00 

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам получения иммобилизованных на нерас.твори.мых носителях белков и других лигандов, Известен способ иммобилизации ферментов и других биологически важных веществ на нерастворимых носителях (целлюлозе) с использованием 2-амино-4,6-дихлортриазина. Активацию проводят в среде ацетонвода (2:1) при 1,5-3-кратном избыткё модификатора по отношению к сухой массе целлюлозы l. Однако способ характеризуется необходимостью использования больших избытков 2-амино-4,6-дихлортриазина и органических растворителей в больших количествах (500 мл ацетона на 5-10 г целлюлозы). Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту являетс способ получения иммобилизованных нуклеофильных лигандов путем активации, содержащих гидроксильные группы носителей 2,4,6-трихлор-1, 3,5-триазином (ТТ) с последующей иммобилизацией лигандов. В данном .способе тщательно обезвоженный носитель обрабатывают ТТ в органическом растворителе (диоксан, ацетонитрил) в присутствии третичного ам на (N,Н-диазопропилэтиламина,М,Ы-ди метиланилина) для связывания выделя щегося HCl. Активированный носитель мньгократно промывают тем не органи ческим растворителем и применяют для иммобилизации лигандов. Допуска ется хранение активированного носителя после высушивания 2 . Однако способ характеризуется сл дующими недостатками стадия актива ции носителя является сложной и про до47жительной, в больших количествах используются токсичные, легко восп.ламеняюащеся органические раствори тели и третичные амины (например, для получения 4 г активированной се фарозы нужно 3-4 л оргашгческих рас воритеяей), что требует специального оборудования помещений и других мер по обеспечению безопасности труда , ввиду трудоемкости процесса и использования больших количеств органических растворителей и других реагентов стоимость активированного носителя весьма высокая. Цель изобретения - упрощение и удешевление процесса. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилизованных нуклеофильных лигандов путем активации, содержащих гидроксильные группы носителей 2,4,6-трихлор-1,3,5-триазином с последующей иммобилизацией лигандов, активацию носителя проводят в водном растворе, при рН 7,5-9,5, а 2,4,6-трихлор-1,3,5-триазин используют в виде концентрированного раствора в водорастворимых апротонных органических растворителях в количестве 5-50% от сухой массы носителя. Сущность изобретения заключается в том, что взаимодействие ТТ сносителями происходит в водном буферном растворе при рН 7,5-9,5 при минимальном внесении органического апротонного растворителя, растворимого в воде. Количества ТТ, используемые при активации, низки (5-50% от сухой массы носителя) по сравнению с известными способами. Активированный носитель может храниться в сухом виде, но предпочтительно иммобилизацию лигандов проводить сразу же после активации. Если лиганд не подвергается нежелательному воздействию ТТ (например, инактивации в случае ферментов),иммобилизацию можно проводить в той же реакционной смеси, в которой проводится активация носителя (т.е. не отделяя непрореагировавшего ТТ и продуктов его гидролиза). Это сокращает число технологических операций и продолжительность процесса. Предлагаемый способ иммобилизации можно применять с любыми носителями, содержащими нуклеофильные функциональные группы, но наиболее эффективен он для носителей, содержащих гидроксильные группы (нерастворимые в воде полисахариды целлюлоза, сефароза. синтетические гидроксилсодержащие - поливиниловый спирт). В пределах рН и температуры, предлагаемых в изобретении, гидроксильные группы являются менее активными нуклеофилами по сравнению с аминогруппами или с сульфгидршхьными группами, которые обычно содержатся на лигандах. Позтому связывание, лигандов по этим группам на активированном носителе протекает быстрее по сравнению с побочными реакциями гидролиза активных групп и поперечной сшивки цепей носителя Иммобилизация по предлагаемому способу проводится двумя путями: реакционная смесь фильтруется, активированный носитель промывается используется для иммобилизации лигандов или хранится в сухом виде при иммобилизация проводитс без отделения активированного носи теля - после активации температура и рН реакционной смеси доводится до необходимых д.пя иммобилизации значений и добавляется раст .вор ли ганда. I Пример 1. Иммобилизация нейтральной протеазы В. subtilis на активированной порошкообразной целлюлозе. Целлюлозный порошок (100 г) суспендируют в 100 мл 0,1 М боратного буфера рН 9.,О, охлаждают до , добавляют 5 г ТТ, растворе.нного в ацетоне, и перемешивают to мин. Смесь фильтруют, промывают ацетоном с водой (1:1), суспендиру ют в 800 мл 0,.1 М фосфатного буфера рН 7,2, добавляют 400 мл раст,вора протосубтилина Г10х (содержание белка 3 мг/мл) и перемешиваю 10 ч при . Полученный продукт промывают 1 М раствором NaCE- до Ис чезновения белка в промывных водах и 1 л смеси этанол: 1 М NaCL (1:1) Получаются 250 г влажного препарат иммобилизованной протеазы В. subti Eis с активностью 1,8 ед/г сухого веса и содержанием белка 5 мг/г су хого носителя. За единицу протеолитической активности принимают (Количество фермента, которое за 1 мин при 37,OtO, превращает в неохпаждаемое трихлоруксусной ки лотой состояние казеинат натрия в количестве, соответствующем 1 мкмо тирозина. Пример 2. Иммобилизация щ лочной протеазы В. subtitis на мел дисперсной целлюлозе. Готовят 1000 мл 10%-ной суспенз мелкодисперсной целлюлозы в 0,1 М универсальном буфере рН 7,5, При перемешивании добавляют 10 г ТТ,ра воренного в диоксане. Активацию пр дят 80 мин при 0°С. Смесь фильтрую промывают смесью ацетона с водой (1:1), суспендируют в 1000 мл 0,1 универсального буфера рН 9,5. до524бавляют 500 мл раств.ора щелочной протеазы (содержание белка 3,9 мг/мл) . иперемешивают в течение 7 ч при . Полученный продукт промывают 1 М NaCt, смесью этанол : 1 М NaCE(1:1). Получают 500 г влажного препарата , который хранится в виде 50%-ной суспензии в 0,1 М NaCE. .Протеолитическая активность 13,2 ед/т сухого веса препарата, содержание белка 18 мг/г. Пример 3. Иммобилизация уреазы на сефарозе. 100 мл сефарозы 6Б (сухая масса 6 г) суспендируют в 1000 мл 0,1 М боратного буфера рН 8,5, добавляют 3 г ТТ, растворенного в диоксане, и перемешивают при 20 мин. Реакционную смесь фильтруют, промывают смесью ацетона с водой и активированную сефарозу суспендируют в 1000 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,0. Добавляют 200 мл водного раствора уреазы (содержание белка 5 мг/мл, активность 180 ед/мл) и перемешивают 5 ч при .-Продукт промывают 1 М раствором NaC &. Полу- чают 24 г влажного препарата иммобилизованной уреазы с активностью 300 ед/г и содержанием белка 2.8,5 мг/г препарата. За единицу уреазной активности принимают такое количество фермента, в результате взаимодействия которого с субстратом (мочевиной) вьщеляется t мкмоль аммиака за 1 мин при . Пример 4. Иммобилизащ1я липопротеида на хитине, 100 г хитина, суспендируют в 1000 мл 0,1 М универсального буфера рН 8,5, Добавляют 20 г ТТ, растворенного в диоксаке, и перемешивают 20 мин при . После активации рН реакционной смеси доводят до 9,5, добавляют 10 г липопротеида яичного желтка, растворенного в этаноле. Смесь перемешивают 7 ч при 20 С, после чего фильтруют промывают 1 М NaC.lP и 50%-ным водным этанолом. Продукт содержит белка 32 мг/г сухого носителя. Пример 5, Иммобилизация 1,6-диаминогексана на сефарозе. 100 мл сефарозы 4В (сухая масса 4 г) суспендируют в 50 мл боратного буфера рН 9,5. Добавляю-г t г ТТ, растворённого в тетрагидрофуране, и перемешивают 10 fflн при . AK-mBKpoBaHtryra сефарозу про

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НУКЛЕОФИЛЬНЫХ ЛИГАНДОВ путем активации, содержащих гидроксильные группы носителей 2,4,б-трихлор-1,3,5-триазином с последующей иммобилизацией лигандов, о т л ичающийся тем, что, с целью упрощения и удешевления процесса, активацию носителя проводят в водном буферном растворе при рН 7,59,5, а 2,4,6-трихлор-1,3,5-триазин используют в виде концентрированного раствора в водорастворимых апротонных органических растворителях в количестве 5-50% от сухой массы носителя.