Способ получения левулозы из крахмала Советский патент 1979 года по МПК C13K11/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕВУЛОЗЫ ИЗ КРАХМАЛА 0,005 молей кобальта на 1 л, в виде ионов. Эти ионы в таких концентрациях обеспечивают активность изомеразы и не оказывают отрицательного действия на активность других энзимов. Хотя известно, что ионы кальция облегчают действие сб-амилазы, нет необходимости добавлять их в конвер сионную смесь, а в некоторых случая лучше их вообще не добавлять, так как возможно, они оказывают отрицательное действие на активность изомеразы, и соответственно на конечны выход левулозы. Устанавливают рН исходной суспензии равным от 5,0 до 7,0, Выбор рН зависит от типа применяемого в способе энзима. Идеально разжижающие, осахаривающие и изомеризующие энзимы должны показывать свою оптимальную активность при одном и том же рН, но практически это не происходит. Глюкоамилаза является осахаривающим энзимом и его оптимальная активность достигается при рН в диапазоне 3,5-5,0. Оптимал ная активность для cd-амилазы находится при рН в диапазоне 5,5 7,0 и она недостаточна для облегчения нужной солюбилизации крахмала при рН ниже 5,0. Изомеразы обычно наиболее активны при ее больших рН, например порядка 7,0-9,0. Поэтому явилось неожиданным, что все три энзима действуют совместно при одно и том же рН, как это происходит на самом деле. Соответствующим рН по изобретению является диапазон рН от 5,0 до 7,0. Температура реакционной смеси должна составлять 40-70 0. Обычно . температуру держат на верхнем пределе указанного интервала, потому 4ix она должна быть ниже температуры желатинизации крахмала. Этот спо соб дает возможнорть избежать высок температуры, что позволяет экономит на подаче тепла и сводить к минимум образование окрашенных веществ и, следовательно, экономить на последу щей очистке. В водную суспензию крахмала непо редственно вводят комплекс, ферменто состоящий из al-амилазы, глюкоамила зы и ийомеразы монозы. Предпочтительно использовать бак териальную oi -амилазу,-которая сохр няет активность при сравнительно низком значении рН, т.е. в диапазоне 5,0-7,0, а также при сравнительн низкой температуре, т.е. ниже темпе ратуры желатинизации крахмала. К лучшим источникам такой oi-амилазы относятся некоторые виды микроорга.низма;,Вас1гЕи5, . например Botciteue so fciEis,B. eic1iemforrms,B-coa ru6ans и B-am-yC 2igu aciens.Особенно хорошими являютс «: -амилазы( полученные из B.icheniforw штаг-5М С 1 В 8061. К другим специфичньм микроорганизмам относятся В. Eictienifor-mis штаммы. NC1B 8059, АТСС 6598, АТСС 6634, АТСС 8480, АТСС 9945А и АТСС 11945. Один такой d- -амилаз ный препарат имеет торговое наименование Термамил, фирны Ново Терапевтик Лабореториум, Копенгаген, Дания. Термамил термически стоек, имеет широкий диапазон действия при разных рН, а) его активность и термостойкость не зависят от наличия ионов кальция. Ниже приведен анализ этого препарата. Сухое вещество,% Активность oi-амилазы, ед/г Протеин,% (сухое вещество) Зольность, % (сухое вещество) Каль ций,% (сухое ве- , щество) К другим пригодным 0 -амилазам относятся Термамил 60 (жидкость) и Термамил 120 (твердое вещество). Ниже приведен их анализ. Термамил 60 Термамил 120 те1й,е-во, Ак -.явность об-амилазы, ед/г Протеин,% (сухое вещество) Зольность, % (сухое вещество) Кальций, % (сухое вещество) Натрий, % (сухое вещество) Количество используемой бактериальной с -амилазы составляет от около 1,0 до около 25 единиц на 1 г крахмала (на сухое вещество). Применение больших количеств не дает практической выгоды; увеличенная солюбилизация крахмала при использовании более 25 единиц на 1 г не .оправдывает дополнительной стоимости энзима. «:;-Амилазную активность энзима определяют следующим образом. Энзиму дают реагировать со стандартным раствором крахмала при регулируемых условиях. Актив-ность энзима определяют

по степени гидролиза крахмала, определяемой по уменьшению окрашивания иодом и измеряемой спектрофотометрически. Единицей активности бактериальной об-амилазы является количество энзима, требующееся для гидролиза 10 мг крахмала в при условиях опыта. Этот метод применим к бактериальной oi-амилазе, включая промышленные препараты, кроме вещестр, обладающих значительной осахаривающей способностью.

0,3-0,5 г твердого образца или .2,0-1,0 мл жидкого образца растворяют в достаточном количестве 0,0025 М водного раствора хлористого кальция и получа энзимный раствор, содержащий (жоло 0,25 единиц активности на 1 мл.

Смесь 10 мл 1%-ного раствора крахмала Линтнера, уравновешенная до 60 С, и 1 мл образца знзима, подлежащего испытанию/ смешивают и держат при постоянной температуре в ванне в течение 10 мин. Отбирают пробу в 1 мл и добавляют к смеси 1 мл 1 М водного раствора соляной кислоты и около 50 мл дистиллированной воды. Способность к окрашиванию иодом такого подкисленного образца определяют затем добавлением .3,0 мл 0,05 %-ного водного раствора иода, разбавлением до 1-00 мл дистиллированной водой. Смесь хорошо перемешивают. Спектр поглощения раствора, по сравнению с дистиллированной водой, измеряется при 620 нм в кювете на 2 см. Такое же измерение ведут для стандартного крахмального раствора (к которому добавлена вода вместо энзимного раствора) для создания холостого поглощения.

Активность энзима в ед/г или ед/мл равна: (холостое поглощение- поглощение пробы) - к коэффициенту разбавления х50/холостое поглощение

X 10x10.

В качестве глюкоамилазы можHO применять известные препараты амилазы, особенно полученные из членов рода Asperg ieeus, рода Endonrsces и рола Rtiizopus. Особенно глюкоамилазой является глюкоамилаза, получаемая по способу,по которому грибковый амилазный препарат очищают от нежелательной трансглюкозидазной активности путем обработки в .водной среде глиной.Количество применяемой глюкоамилазы колеблется от 0,1 единицы до 5,0 на 1г крахмала (сухое вещество).Лучше,исходя из стоимости энзима и работы,применять 0,25 единицы глюкоамилазы на 1г крахмала (сухое вещество).

Единицы активности глюкоамилазы определяют следующим образом.

Субстратом является- кислый гидролизат 15-18 ДЕ кукурузного крахма ла в воде, разбавленный до 4,0 г .сухого вещества на 1000 мл раствора. Пипеткой отбирают точно -50 мл раствора в объемную колбу на 100 мл. В колбу добавляют 5,0 мл 1 М кислого буфера ацетат натрий - уксусная кислота (рН 4,3), Колбу помещают в водяную ванну при 60с и через 10 мин добавляют нужное количество энзимного препарата. Точно через

120 мин после добавления энзимного препарата раствор доводят по фенолфталеину IN раствором едкого натрия. Затем раствор охлаждают до комнатной температуры и разбавляют до полного объема.На разбавленном образце определяют величину редуцирующего сахара в.пересчете на декстрозу и на контрольном образце без добавления энзимного препарата. Глюкоамилазную активность рассчитывают следующим

образом;

S - В

А . 2 X Е

где ЙГ - глюкоамилазная активность в единицах на мл (или на

грамм) энзимного препарата;

S - редуцирующие сахара в пробе конвертированного энзима в граммах на 100 мл;

30

В - редуцирующие сахара в контрольном образце, граммы . на 100 мл;

Е - количество использованного

энзимного препарата, мл

(или грамм).

S не должно превышать 1,0 г на 100 мл.

Изомераза может быть любой,

например энзим, способный конвертировать декстрозу в левулозу. Известно много изомераз, включая, в основном, те, которые получены -с помощью микроорганизмов вида Streptornvces.

Предпочтительным видом является S,aEbus (АТСС 21132).

К ДЕ)угим относятся S-faobiEiaejS.fra diqe,S.vif)acens,S.Mrq,iniae .S-oeivochromogfenes и s.phaeoclirohiog-eneeИзомеразы, полученные с помощью микроорганизмов вида Arttirobacter также можно применять, например, A-tiOv.Sp-NRRL В 3724; А hOV.Sp-NRRL B-3725;A.nov.sp-NRRUВ-3726;

A.nov.ep.NRRU В 3727 И A.nov-sp NRRL

В-3728.А также изомеразы, полученные с помощью микроорганизмов вида Lactobacietus , например L-Brevis, Ьтапnitcpens и 1 - buctineri , а также -АегоЬасte cti€oacdie М Aiaerog-enes.

Количество применяемой изомеразы колеблется от 0,1 единицы до около 20 единиц на 1 г крахмала (сухое вещество). Обычно в предпочтительных случаях это количество составляет

0,2-2,0.

Едуницы изомераэной активности определяются следуюшим образом.

Ведут спектрофотометрическое определение кетонов,образующихся из раствора глюкозы при стандартных условиях. Подлежащий анализу энзимный препарат .сначала разбавляют до содержания 1-6 единиц изомеразы в 1 мл. Затем готовят раствор: Количество Компонент, 0,1 М 1 мл 0,01 М 1 мл 1М фосфатный буфер рН 7,5 0,5 мл 1,44 г Безводная Д-глюкоза До общего Дистиллированная вода объема 7,5 м Энзимную изомеризацию ведут добавлением 1 мл энзимного препарата к 3 мл раствора. Затем ведут инкуба цию его-в течение 30 мин при . В конце инкубационного периода отби рают пробу 1 мл и быстро прекращают реакцию добавлением 9 мл 0,5 надхлорной кислоты. Затем эту проб разбавляют до объема 250 мл. Для сравнения в качестве контрольного опыта эту процедуру повторяют,но вместо 1 мл энзимного препарата в виде раствора берут 1 мл воды в начале инкубационного периода. Затем кетозу определяют методом цистеин серная кислота. Для этого анализа изомеразную единицу определяют как количество энзимной активности, требующееся для получения 1 лшкромоля левулозы в 1 мин при описанных условиях изо меризации. В процессе гидролиза крахмалаг температуру реакции поддерживают ни же температуры желатинизации исход ного крахмала для того, чтобы сохр нить крахмал в. гранулированном, нежелатинизированном состоянии в тече ние всего процесса, что приводит к увеличению выхода целевого продукта Непрореагировавший крахмал удаляют из гидролиза путем фильтрации и возврал ают его в процессе. П р,и М е р 1. К 32,7% (18,4 Боме) годной суспензии гранулирован ного кукурузного крахмала добавляют 0,01 моля ионов магния (в виде гекс гидрата сульфата магния) и 0,001 мо ионов кобальта (в виде гептагидрата хлористого кобальта), рН доводят до 5,7. Для поддержания рН на этом уро не при необходимости добавляют IN водный раствор карбоната натрия. Т пературу держат при 60°С и добавляю 6,075% (6,8 единиц активности ма 1

крахмала) ст -амилазы, 0,1% (02 единиц активности на 1 г крахмала) глюкоамилазы и 0,8% (0,33 единиц активности , на 1 г крахмала ) изомеразы (Strep to nrsсеэ aCbus УТ-5). Результаты приведены в таблице. 26,4. 29,8: ДЗ в фильтрате, % Д.Е. фильтрата, % 29,,5 38,,9 Декстрозы 57,4 53,8 в фильтрате, % в пересчете на твердое вещество. Растворимая фракция находится в фильтрате, полученном после фильтрования конверсионной смеси. Фильтрация идет легко, так как в конверсионной смеси нет желатинизированного крахмала. Количество гранулированного крахмала, полученного после окончания реакции, составило 4% от всего количества. 73% крахмала солюбилизируются за 18 ч с выходом 29,3% (из .расчета на солюбилизированный крахмал) левулезы. По прошествии 42 ч соответствующие цифры составляют 81% солюбилизированного крахмала и 36,3% левулозы. По прошествии 67 ч соответствуюцие цифры составляют 91% и 38,9%. Пример 2.К 40,9% (23 Боме) вс . ой суспензии гранулированного кукурузного крахмала добавляют ионы кобальта и ионы магния, как в примере 1. рН доводят до 5,7 и держат на этом уровне во время конверсии добавлением IN водного раствора карбоната натрия по необходимости. Температуру поддерживают 60°С и добавляют 0,15% (13,7 единиц активности на 1 г крахмала) ot-амилазы Термамил, 0,1% (0,2 единиц активности на 1 г крахмала) глюкоамилазы и 0,8% (0,33 единиц активности на 1 г крахмала) изомеразы (Stf-eptomvces oEbus УТ-5) . Суспензию держат при в течение 48 ч, затем фильтруют. Ниже приведен анализ фильтрата. ДЗ40,22% 40,7% Левулоза 51,0% Декстроза Зола {% сульфата d.e.) Крахмальная проба отрицательная в пересчете на твердое вещество.

Свыше 98% крахмала солюбилизируют в течение 48 ч и 40,7% этого солюбилзированного крахмала превращается .в левулозу.

Пример 3. Готовят 25 вес.% водную суспензию гранулированного кукурузного крахмала, которая содержит следующие .ингредиенты: 125 г кукурузного крахмала; 250 мл 1,0 N водного фосфатно-калиевого буфера, рН 7,5, 5 МП 1,0 N раствора гекса.гидрата сульфатамагния, 5 мл 0,1 N раствора гептагидрата хлорида кобальта и достаточное количество водного -хлорида кальция;

ot-амилазу (Bac-iP.Eus bictiemforfnis ) , 5 единиц активности- на 1 г крахмала (сухое вещество), глюкоамилазы 1 единица активности на 1 г крахмала (сухое вещество) ; изомеразу (StreptoniMces oEivochromogrenes) 10 единиц активности на 1 г крахмала в пересчете на сухое вещество.

Эту водную суспензию держат при в течение 24 ч рН доводят до 6,0 и по Необходимости поддерживают на этом уровне добавлением водного, раствора едкого калия. Конверсионную смесь фильтруют, фильтрат доводят до рН 4,5 добавлением соляной кислоты, затем кипятят для дезактивации энзимов. В твердом веществе содержится 44,9% исходного гранулированного крахмала, что означает, что 55,1% гранулированного крахмала солюбилизировалось. В солюбилизированном крахмальном продукте содержится 51,2% декстрозы и 20,6%

левулозы в пересчете на на твердое

вещестнтэ.

Формула изобретения

1.Способ получения левулозы из крахмала, предусматривающий приготовление водной суспензии крахмала, введение комплекса ферментов, состоящего из сС-амилазы, глюкоамилазы

и изомеразы глюкозы при рН 5-7 и 40-70 с и гидролиз до образования

0 растворимого гидролизата, о т л ичающийс я тем, -что, с целью повышения эффективности процесса и выхода целевого продукта, комплекс ферментов вводят непосредственно в

5 водную суспензию нежелатизированного крахмала и температуру реакции поддерживают в процессе гидролиза ниже температуры желатинизации исходного крахмала.

0

2.Способ ПОП.1, отлич ающ и и с я тем, что концентрация крахмала в суспензии составляет от 10 до 70 вес.%;

3.Способ ПОП.1, отлич аю5щ и и с я тем, что используют бактериальную амилазу в количестве 1,0-25 единиц активности на 1 г сухого крахмала, глюкоамилазу в количестве 0,1-5,0 единиц активности

0 на 1 г сухого крахмала и изомераэу 0,1-20 единиц активности на 1 г сухого крахмала.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Франции 2215467, . :.

5 кл, с 13 К 1/06,опублик.1974,прототип.