Способ получения ферментного препарата глюкоизомеразы Советский патент 1983 года по МПК C12N9/92 

Изобретение относится к ферментной промышленности и касается получения препарата глюкозоиэомеразы, используемого для переработки глюкозосодержащего сырья во фруктозосодержащие продукты.

Переработка глюкозы во фруктозу (изомеризация) обеспечивает получение продукта, который практически представляет собой заменитель торгового сахара. В данном случае исходным продуктом является глюкоза, моносахаридный сахар (примерно 70% сладости сахарозы) , который наполовину перерабатывается в сахар,с примерно сладости сахарозы или инвертного сахара. Высокая сладость представляет интерес для получения кукурузной патоки, содержащей фруктозу.

При изготовлении кукурузной патоки с высоким содержанием фруктозы энзиматическая изомеризация глюкозы предпочтительно должна производиться на непрерывной основе для того, чтобы зкономично получать коммерчески пригодную кукурузную патоку с высоким содержанием фруктозы. Обычно глкозный сироп контактирует с большим количеством препарата изомеразы, который размещается на инертном веществе, например на препарате иммобилизованного энзима изомеразы глюкозы.- Особенностью такого способа является использование препарата иммобилизованного энзима изомеразы глкозы, который обладает высокой концентрацией изомеразной активности на единицу объема, делая энзим пригодным для процесса непрерывной энзиматической изомеризации.

Глюкозоимеразу обычно получают внутриклеточным путем, т.е. большая часть энзима изомеразы глюкозы размёщается в пределах и/или на оболочках клетки микроорганизмов, из которых его получают. В некоторых процессах непрерывной изомеризации предполагается использование целых клеток, содержащих изомеразу глюкозы. Такие процессы обычно требуют специальной обработки клеток для предупреждения экстракции изомеразы глюкозы из клеток, так что энзим фактически иммобилизуется в самих клетках, и/или специального оборудования для решения гидравлических проблем при прохождении со- держащего глюкозу раствора через

СЛОЙ клеток, содержащих энзим изомеразы глюкозы 11 3 и t2j.

Недостатки способов в которых используются целые клетки, содержащие изомеразу, включают гидравлические проблемы, образование загрязняющих примесей из-за неиаомеразных энзимов, нуклеиновой кислоты и других материалов в оболочках клеток и более длительного времени контакта глюкозного раствора с препаратом клеточного энзима в щелочных условиях вызывает образование нежелательных продуктов, таких как псикоза и гидроксиметилфурфурол. Это приводит к повышению стоимости производства из-за необходимости рафинирования для удаления образующихся загрязняющих примесей и/или получению низкокачественного продукта.

Известны способы, при которых изомеразу глюкозы выделяют из клеток, получают ее в растворимой форме, затем иммобилизуют на водорастворимом инертном носителе. Иммобилизованный энзим становится пригодным Для использования в непрерывной переработке глюкозы в кукурузную патоку, содержащую большое количество фруктозы.

Например, известен способ, в кото РОМ внутриклеточная изомераза глюкозы, полученная из Streptomyces sp. АТСС 21175, выращенного на ксилозе и гидрозате ксилана, обрабатывается катионным детергентом, с последующей обработкой диэтиламиноэ1тилцеллюлозой для удаления примесей. Содержащий изомеразу глюкозы фильтрат затем иммобилизуют на ДЭАЭ целлюлозе или синтетической анионообмен- ной смоле для получения биокатализатора для непрерывной изомеризации глюкозы во фруктозу

Однако способы, основанные нЬ иммобилизации фермента, предусматривают использование выделенной из клеток растворимой глюкозоизомеразы. Способы придания растворимости изомеразе глюкозы известны. Однако необходимо получить не содержащую клеток и растворимую изомеразу глюкозы высокой степени чистоты, которая будет обладать высоким уровнем изомеразной активности на единицу объема. Использование высокоочищенного и концентрированного энзима повышает эффективность, с которой энзим может быть иммобилизован на нерастворимом носителе.

Известен способ получения ферменного препарата глюкозоизомеразы Путрм обработки клеток Bacillus соаgulans HN-68 этилендиаминтетрауксусной кислотой, затем лизоцимом в количестве /v 0,01 мг/мг сухого веса клеток с последующим отделением полученного бесклеточного экстракта и обработкой его О,Т М сульфата марганца для получения преципитата нежелательных материалов. Супермагант несколько раз обрабатывают сульфатом аммония при степени насьицения 0,j-0, для осаждения белковой фрации изомеразы глюкозы, которую затем очищают диализом и хроматографией на диэтиламиноэтил-Сефадексе А-50. Процесс ведут при охлаждении (SC) i.

Недостатком способа является его .ложность, многостадийность, при этом получаемый продукт не обладает достаточно высокой стабильностью и выходом по активности (50).

Таким образом, остается необходимость в экономичном способе, пр годном для крупномасштабных операций, для получения растворимого и очищенного препарата изомеразы глюкозы с высоким уровнем активности на единицу объема и высоким уровнем стабильности, пригодного для связывания с водонерастворимыми носителями для использования в непрерывных процессах в производстве кукурузных паток с высоким содержанием фруктозы, но также пригодного для других процессов изомеризации.

Цель изобретения - упрощение процесса, а также повышение активности и стабильности препарата.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения ферментного препарата глюкозоизомердзы, предусматривающему обработку биомассы продуцента лизоцимом, отделение бесклеточного экстракта и выделение иЗ него фермента осаждением, в качестве продуцента используют Streptomyces olivochromogenes АТСС Vf 21.713, АТСС W 21715, биомассу продуцента предварительно обрабатывают водным раствором 2-пропанола при.концентрации последнего в смеси А- 5 мае,, лизоцим используют в количестве 6,8 ед/мг сухого

веса клеток, а осаждение фермента осуществляют сульфатом магния, взятым в количестве 0,02-0,3 М на общий объем смеси.

При этом обычно концентрацию 2пропанола на всех стадиях процесса поддерживают постоянной и равной fl-43 мас.%.

Способ проще известного,включает меньше стадий, может осуществляться при комнатной температуре, позволяет достичь высокого уровня активности ( при высокой стабильности препарата.

Получают водорастворимый стабилизированный концентрат энзима глюкозо изомеразы, состоящий из l энзима изомеразы глюкозы, не содержащей клеток, который не содержит нуклеино вой кислоты, и 2 3 , водорастворимой соли магния, причем характеризуется следующими константами: содержание протеина 50-80 по весу на сухое вещество; содержанием З-+Б «г Ид на миллилитр концентрата энзима; соотношение Mg qpoтеин 0,02-0,75; удельная изомеразная активность, по крайней мере 10 МЕИГ/мг протеина; стабильность, заключающаяся в том, что он сохраняет до 95 своей первоначальной изомеразной активности при хранении при комнатной температуре(2бС) до 30 дней и до 80i10% своей первоначальной изомеразной активности при хранениипри 180 С до 12 мес.

Концентрат энзима предпочтительно содержит смешивающийся с водой органический растворитель, в частности, 2-пропанол, и обладает изомеразной активностью А5006-8000 МЕИГ на сухое вещество. Способ осуществляется контактированием водной смеси, содержащей энзим изомеразы глюкозы, не содержащей клеток, и смешивающегося с водой органического растворителя с небольшим, но эффективным количеством водорастворимой соли магния (сульфата магния ) для эффективного осаждения энзима изомеразы глюкозы. Эта обработка солью магния вызывает образование преципитата энзима изомеразы глюкозы-магния, который извлекается обычными способами, например центрифугированием. Извлеченный стабилизированный концентрат энзима (который -имеет вид толстого слоя шлама} предпочтительно разбавляют небольшим количеством воды для облегчения его сорбции на.водонерас воримых носителях с образованием высокостабильного, иммобилизованног биокатализатора с высоким уровнем йзомеразной активности на единицу объема носителя. Концентрирование, очистка и стабилизация дают более чем 7о-кратное увеличение концентрации энзима сравнительно с его первоначальной бродильной разводкой и предпочтительно более чем 100-кра ное увеличение концентрации. Концентрат энзима также в 10-15 раз чище, чем первоначальный энзим. Способ, в частности , включает: обработку водной смеси, состоящей и изомеразы глюкозы, не содержащей клеток, и смешивающегося с водой ор ганического растворителя, по сущест ву .водорастворимой солью магния,в количестве достаточном для обеспечения смеси с концентрацией пример.но 0,02-0,3 моль относительно соли магния, считая на общий объем смеси, для обеспечения получения стабилизированного концентрата энзима, содержащего преципитат энзима магни в смеси: извлечение стабилизированного концентрата энзима, содержащег энзим изомеразл 1 глюкозы, который со держит магний примерно, 0,1-2 моль, в расчете на Мд, воду и водорастворимый органический растворитель. Стабилизированный концентрат энзима получают первой обработкой кле ток, содержащих внутриклеточную изо неразу глюкозы, родорастворимым органическим растворителем и литическим препаратом энзима - лизоцимом в течение времени, достаточного для дигерирования клеточного материала и для того, чтобы энзим изомеразы глюкозы выделился из клеток в раствор. Остатки клеток и нуклеиновые кис лоты затем удаляют, например, центрифугированием, и остается раствор, содержащий энзим изомеразы глюкозь не содержащей клеток, смешивающийся с водой органический растворитель и воду. Смешивающийся с водой органический растворитель, используемый при осуществлении данного способа, представляет собой предпочтительно органическую жидкость, или ее смеси имеющую водорастворимость по крайней мере 30 и предпочтительно по крайней мере примерно tO в воде комнатной температуре. Смешивающийся с водой органический растворитель должен быть растворителем, который уменьшает растворимость протеинов и нулеиновых кислот в водных растворах. Типичные водорастворимые органические растворители, пригодные для осуществления данного способа, включают метанол, этанол, пропанол, 2-пропанол; трет-бутиловый спирт, ацетон, метилацетат и парадиоксан. Предпочтительным смешивающимся с водой органическим растворителем является 2-пропанол. Обычно используют такое количество смешивающегося с водой органического растворителя,которое достаточно для обеспечения водной смеси по крайней мере 30 вес. и предпочтительно по крайней мере примерно kQ% по весу относительно смешивающегося с водой органического растворителя. Однако количество используемого смешивающегося с водой органического растворителя должно быть таким, чтобы значительная часть неизомеразных протеиновых материалов и нуклеиновых кислот осаждались из раствора до добавления соли. Когда в качестве смешивающегося с водой органического растворителя используется 2-пропанол, то водный раствор изомеразы глюкозы, не содержащей клеток, должен содержать вес. 2-пропанола. Смешивающийся с водой органический растворитель действует как предохраняющее средство для энзима во время обработки (и во время хранения, если растворитель не полностью удален.) и уменьшает,растворимость энзима во время добавления соли. Он также действует как осадитель нуклеиновых кислот и других Неизомеразных протеиновых материалов из приведенной в состояние растворимости изомеразы глюкозы до -обработки сульфатом магния. Способ, которым смешивающийся с водой органический растворитель добавляется в раствор, содержащий изомеразу глюкозы, не содержащую клеток может меняться. Один из способов включает первую обработку центрифугированной пасты из клеток, которая содержит внутриклеточную изомеразу глюкозы, частью используемого смешивающегося с водой растворителя. Водный шламм из клеток и раст ворителя затем обрабатывают таким способом, чтобы высвободить изомеразу из клеток. Такие обработки включают звуковую обработку, обработку повторным замораживанием и оттаиванием, или обработку поверхностно-активными веществами, и/или литичёскйми препаратами энзима, та кими как лизоцим. Использование литическйх энзимов предпочтительно с точки зрения крупномасштабных операций. После 1зысвобождения энзима из клеток: в раствор добавляют до полнительное количество растворителя вплоть до момента, когда происходит осаждение нуклеиновых кислот и посторонних протеинов, но энзим изомеразы остается растворимым. Затем удаляют остатки клеток и осажденные посторонние материалы. В этот момент производится добавление водорастворимой соли магния сульфата магния с образованием преципита.та стабилизированного концент рата энзима. Другой способ использования раст ворителя включает добавление всего предварительно.определенного количества растворителя в клеточную пас ту изомеразы глюкозы. Клеточную пас ту, получаемую центрифугирование разводки клеток, содержащей внутриклеточную изомеразу глюкозы, обраба тывают полным .количеством смешивающегося: с водой органического раство рителя с водой для получения клеточ ного шлама из растворителя и воды. Шлам, содержащий смешивающийся с во дои органический растворитель, обрабатывают для выделения из клеток энзима изомеразы глюкозы. При последующем удалении нерастворимого материала, кotopый содержит остатки клеток и нуклеиновые кислоты, осветленный раствор, содержащий изоме азу глюкозы, не содержащую клеток, растворитель иводу, обрабатывают водорастворимой солью магния д осаждеНия стабилизированного концен рата энзима. Условия в отношении температуры рН во время этой обработки должны быть такими, что энзим не инактиаировался. Обычно рН находится в пределах примерно 6-9 и предпочтительн 7-7,5 во время каждой стадии процесса. Температура может быть примерно , предпочтительно 15 35С, наиболее предпочтительно 25 . Типичной пригодной солью ма1- иия для осаждения является сульфат магния (гептгидратная форма. Количество водорастворимой соли магния должно быть по крайней мере достаточным для обеспечения получения жидкости, содержащей водный шлам смешивающегося с водой органического растворителя и энзим изомеразы глюкозы, не содержащей клеток по крайней мере примерно 0,02 моль по отношению к иону магния. Верхний предел концентрации соли магния изменяется в зависимости от используемой соли. Соль магния не должна добавляться в такой степени, чтобы происходил общий эффект высаливания или отделения водносолевой фазы. Максимальное количество соли магния в растворе примерно 0,3 моль.. Предпочтительно кoнцeнtpau :я соли мае. ния в растворе примерно 0,02-0,2 моль, считая на содержание иона магния. Наилучшие результаты получают при добавлении соли магния в количестве, обеспечивающем получение раствора примерно 0,05 по отношению к иону магния. Продуцентамиi для получения энзимами изомеразы глюкозы, препарата . глюкозоизомеразы,является Streptomyces,о1ivochromogenes АТСС № 21713 и АТСС № 21715 (последний представ- . ляет собой простой иэолят колоний АТСС № 21713)5l. Ниже приведены определения для упрощения текста. Выражение декстрозный элемент (ДЭ) применяете для обозначения снижения содержания сахг.ра в материале, рассчитанного на декстрозу, и выраженного в процентах общего содержания твердых веществ. Выражение крахмальный гидролизат обычно используется для обозначения сиропа или сухого продукта, которнй. получен гидролизом крахмала. Такой продукт может быть получен гидролизом в кислой среде или энзиматическим гидролизом или комбинацией кислотного гидролиза и энзиматйческого гидролиза. Предпочтительный типа крахмального гидролизата Для использования в изомеризации в соответствии с данным способом получают кислотным или энзимным разбавлением до ДЭ 10 или меньше с п,оследующим эн иматическим осахариванием до ДЭ примерно 90, предпочтительно 95. Термин декстроза обычно применяется в практике производства для обозначения рафинированного кристаллического сахара ( моносахарида), т.е извлеченного из переработанного в вы .сокой степени крахмального гидролизата. Термин глюкоза в контексте применяется как в обычном производственном значении, так и охватывает моносахаридную декстрозу в любой фор мё, в растворе или в рафинированной кристаллической форме. Выражения фруктоза и левулоза обычно применяются как равнозначные для обозначения левовращающегося изо мера глюкозы, который слаще декстрозы. Этот изомер обнаружен в натураль ном виде в меде и инвертном сахаре вместе с глюкозой, и представляет определенную ценность вследствие своей сладости. Выражение фруктоза используется для обозначения этого моносахарида. Выражение IGIU (Inter national Glucose Isomerase Unit) является сокращением выражения Международная единица изомеразы глюкозы (МЕИО. Одна МЕИГпредставляет собой количество энзима изомеразы глюкозы, которое образует один микромоль фрук тозы в минутз- в 0,8 М растворе глюкозы при рН 7,5 и 60 С при использовании методики анализа изомеразной активности. Последний включает проведение спектрофотометрического определения кетозы, полученной из раствора глюкозы в стандартной совокупности условий. Исходный раствор приготовляется следующим образом. Содержание компонентов:0,1 М 7 1 мл 0,01 М СоСЕ. 1 мл 1,0 М фосфатный буфер, рН 7,5 0,5 мл Безводная D-глюкоза1, г Дистиллированная До получения водаполного объе ма 7,5 мл Препарат энзима для анализа сначала разбавляется до содержания 1-6 МЕИГ/мл. « Энзиматимеская изомеризация производится путем добавления 1 мл препарата энзима в 3 мл исходного растрора и выдерживания в „термостате в течение 30 мин при . В конце периода выдержки берут аликвотную долю 1 мл и резко охлаждают в 9-миллилитровом объеме, 0,5 N хлорной кислоты. Охлажденную аликвотную долю затем разбавляют до общего объема 250 мл. Для контроля и сравнения производят также слепую глюкозную пробу путем замены 1 мл воды 1 мл препарата энзима в форме раствора в начале периода выдержки в термостате. Затем производят определение кетозы методом цистеина и серной кислоты. Для этого МЕИГ определяется как количество энзиматической активности, которое необходимо для получения одного микромоля фруктозы в минуту в описанных условиях изомеризации. Приготовление энзима лизозима. Энзим лизозима (ЕС 3.2.1.17) представляет собой энзим, который гидролизует бета -1 ,k- связи между N-ацетил-мурамовой кислотой ( или 2-ацетоамидо-2-деокси-О-глюкозой остатками и 2-ацетамидо-2-деокси-0-глюкозы в мукополисахариде, мукополипептиде или в хитине). Лизозим обычно получают из яичного белка. Он катализирует гидролиз (лизис) оболочек клеток многих микроорганизмов. П р и М е р 1 А. Приготовление внутриклеточной изомеразы глюкозы. Препарат энзима внутриклеточной изомеразы глюкозы, используемый Для приготовления стабилизированного концентрата энзима, получают в течение четырех стадий развития посева, начиная с 1-литровой встряхивающей колбы и кончая 1000-галонными (3785,4-литровыми) посевными баками и 20000-галлонными(75708-литровыми ) ферментаторами. На каждой последующей стадии развития и 20000-галонные (75708-литровые) ферментаторы инокулируют с помощью объема посева, равного 5 объема инокулированного сосуда. Состав среды для развития посева и рабочих методик приводится .1. Среду для каждой стадии стерилизуют в течение 30 мин при . Время инокуляционного развития 8 ч для первой стадии, 2 ч для второй стадии,- 22 ч для третьей стадии и ч для четвертой стадии. На первой стадии клетки из спорового штамма мутанта микроорганизма, определенного как Streptomyces

oUvochr-onragenes ATCC N 21715, добавляют питательной среде. Четыре стадии развития посева осуществляют при и при рН (с доведением до этой величины.до стерилизации с помощью ТО N гидроокиси натрия). Во время второй, третьей и четвертой стадии развития колбы и чаны подвергают продуванию воздухом и перемешиванию в течение ферментации.

Конечные ферментации проводят в 20000-гаЛонных (75708-литровых ферментаторах). Ингредиенты среды без ксилозы и декстрозы единовременно помещают в ЙОО галлонов (52996) конденсата. После приготовления среду нагревают примерно до и доводят рН до 5,Ь-5,8 с помощью кальцинированной соды 16 Боме. Разводку нагревают, доводя рН для отделения двуокиси углерода, которая выделяется после добавления кальцинированной соды. После того, как рИ среды достигнет нужной величины, добавляют пеноудалитель и ферментатор и его содержимое стерилизуют в течение 30 мин при . После стерилизации температуру среды снижают до . Сахары, ксилоза и декстроза единовременно помещаются в 000 галлонов (15Н л) конденсата в ЮОО галлонном(3785-литровый) посевной чан. Сахарный раствор стерилизуют в течение 30 мин при 120С и после охлаждения сливают по шлангу в 20&00-галонныё V 75708-литровые) ферментаторы. После добавления сахара температуру ферментатора стабилизируют на рабочей величине З2с, а затем ферментатор инокулируют посевной культурой. Начиная с 20 ч после инокуляции каждые 2 ч отбирают и анализируют на изомеразную активность, вес клеток, уменьшение сахара и всех карбогидратов образцы разводки ферментатора. Ферментация считается законченной, когда производство энзима йзомеразы достигает пиковой величины. Во время ферментации рН удерживают 5,-5,6 автоматически или вручную добавлением газообразного аммиака через барботджные воздушные /1Инии ферментатора в условиях предварительной стерилизации.

Добавок кобальта не производится ни на одной стадии ферментации или стадии развития посева.

Энзим внутриклеточной йзомеразы глюкозы, извлеченный из разводки.

имеет 19.5 МЕИГ/мг. Порцию разводки в галлонов-( 8857,9 л) отбирают для использования при приготовлении стабилизированного концентрата йзомеразы глюкозы. Другую порцию разводки извлекают в виде целых клеток с помощью Мд(ОН)5, вспомогательного фильтрующего материала Slt-Flo 332 и 2-пропанола. Извлеченные целые клетки затем используют для энзиматической переработки глюкозы во фруктозу в конверторе периодического действия.,

Состав среды для развития посева

11риведен в табл.1.

Состав Среды дл 20000-галонных (75708-литровых) ферментаторов приведен в табл.2. Объем состава 17000 галлонов л).

Б. Приготовление концентрированного концентрата энзима йзомеразы глю козы. 23 0-галонную (8857,9-литровую порцию разводки энзима внутриклеточной йзомеразы глюкозы из

20000-галонного (75708-литрового ферментатора с активностью примерно 19,5 МЕИГ/мл при общей величине 173x10 МЕИГ обрабатывают на центрифуге, отбрасывающей твердые частицы. Де Лаваль ВРПХ-207. Подачу материала на машину производят при

скорости 5 галлонов (18,9 л) в минуту с 2-минутным циклоном выброса частиц. Промывочную и заливочную воfly добавляют в течение 1 с до и после выброса из ротора центрифуги. 2023 фунта (917,.6 кг) клеточной пасты с активностью 187 МЕИГ/г, полу« ченной из ротора центрифуги помещают в 225-галлонный (851,6-литровый) чан с круглым днищe вместе с л воды. Когда собирается 650700 фунтов (29,8-317,5 г) клеточной пасты ее обрабатывают 8 г препарата энзима лизозйма (2-х кристаллический, высушенный хохгодом порошок, приготовленный компанией Майлс Сирэвок из яичного белка с активностью 23000 ед/мг материала) для того, чтобы разрушить оболочки клеток и высвободить внутриклеточную изомердзу глюкозы в растворимой форме. В клеточную пасту добавляют раствор из 2-пропанола (851 по объему) и воды из расчета 5,6 галлона

(21,2 л) раствора на 100 фунтов (3,36 кг) пасты. Дополнительно в смесь добавляют 11 галлонов (1,6 л) 2-пропанола и иоды для доведения содержания спирта в жидкости до 30% по . Затем смесь, состоящую из пасты, 2-пропанола и воды, перекачивают в 1000-галяониый (3,785ЛИТ ровый) варочный аппарат и процесс ведут в течение Z ч. Температуру жидкости в варочном аппарате поддерживают примерно 2бС. После Zl-Ma срвого дигидрирования смесь модифицирована добавлением 85%- 2-пропанола до содержания 2-пропанола до 52% по объему, где нуклеиновые кислоты нерастворимы, а протеиновый энзимный материал растворим. Роторный ваку мный фильтр загружают предварительно наносимым фильтровальным материалом Дайкэлайт 200 в количестве 200 фунтов (90,7 кг). Когда предварительно нанесен слой фильтрующего материала, то в воду предварительного слоя добавляют 2-пропамол для доведения содержания спирта примерно до 52% по объему с тем, чтобу снова удерживать нуклеиновые кислоты в нерастворимой форме, т.е. для предупреждения приборостроения растворимости нуклеиновыми кислотами. В роторном фильтре с предварительно нанесенным слоем фильтрующего материала неосуществляют никакой промывки, но пред- варительно нанесенный слой смеси во- да - спирт пропускают через фильтр после окончаний фильтрации шлама пас ты. Шлам пасты, оставшийся в слое предварительно нанесенного фильтрующего материала, перекачивают на нугч фильтр для удержания нэ минимальной величине .потерь энзима. Производят добавление фильтрующего материала Дайкелайт 4200, чтобы способствовать фильтрации на нутч-фильтре. Фильтрат из обоих фильтров роторного фильтра с предварительно нанесенным слоем фильтрующего материал и нутч-фильтра перекачивают в 1000 галонный 079-литровый ) чан, используемый в качестве хранилищной емкости для Подачи в питательный чан, куда добавляют 15 галлонов (56,78 л) 1,0 раствора молярного сульфата аммония (М (NH4)) и 13 галлонов (49,2 л) 85% по объему 2-пропахола. Смесь подают на центрифугу. Де Лаваль БРПХ-207 при расходе .подами 16,6 галлонов ( л) в минуту при 5 минутном цикле выброса. После окончания центрифугирования роТор пять раз прочищают 1-секундным добавлением заливочной воды и прокручивают. Остаток, содержащий стабилизированный концентрат энзима, оставшийся в роторе и выбрасывающей камере, счищают и ротор и камеру промывают некоторым количеством легкой фазы, выгруженной из центрифуги. Остаток и промывочная жидкость переходят в продукт - стабйлизированный концентрат энзима. Продукт перемеи(ивают с .помощью лабораторной мешалки и помещают в 1-галонные (3785-литровые) пластиковые контейнеры для оценки и дальнейшего использования для энзиматического преобразования глюкозы во фруктозу. Общий выход стабилизированного концентрата энзима изомеразы глюкозы (загрузка №1)11 галлонов(+1 , я в виде концентрированной .жидкости,, со держащей 109x10 МЕИГ или примерно 11,2б1 МЕИГ/г на сухое вещество. Это Составляет 63% извлечение общей активност, присутствующей в разводке целых клеток, использовавшейся в качестве исходного материала. Более полный анализ стабилизированного концентрата энзима изомеразы глюкозы Приводится ниже. Загрузка № 1 Изомеразная активность 11,261 МЕИГ/г, сухое вещество Удельная активность, ИЕИГ/г,протеин р , о, ° ® ство,« Влажность (Карл Фишер) % Протеин(Къельдаль),% на сухое вещество Зольная окись, сухое вещество Нерастворимое,сухое вещество, % на сухой основе Wg, мг/мл Мд /протеин, соотношение2-пропанол, по разнице,%14 П РИМ ер 2. Несколько загрузок энзима внутриклеточной изомеразы глюкозы, полученного из Streptomyces oUvochrogenes АТСС № 21715 приготавливают как в примере 1(А с использованием 7,5 литрового, 40литрового и 400-литрового ферментаторов для развития посевов и в 000-литровом ферментаторе для окончательной стадии выращивания. После ферментации температуру каждой из загрузок, содержащей целые клетки энзима внутриклеточной изомеразы глюкозы, снижают с 32 до для задержки дальнейшего роста микробов и возможного автолиза клеток. Загрузки разводки затем подвергают центрифугированию для концентрирования клеток с целью образования кле точной пасты. Тяжелофазную клеточную пасту собирают в 10-галлонных t37,8-литровых) емкостях, взвешивают и затем перекачивают в 1000-гал лонный (,3785-литровый варочный чан для дигерирования клеток. В клеточную пасту добавляют при перемешивании препарат энзима (2-х кристалличе кий высушенный вымораживанием порошок, изготовляемый компанией МайлсСирэйвок из яичного белка и имею.щий активность 23300 ед/мг материала (для дигерирования оболочек клеток 1 высобождения внутриклеточной изомеразы глюкозы в растворимой форме. Дозировка лизоцима для каждой из загрузок 6,8 ед/мг клеток (на сухое вещество). Общий вес клеток (на сухое вещество), присутствующих в лето чной пасте, рассчитывают с использованием конечного веса ;Сухих клеток всей разводки ферментатора и объ ема разводки ферментатора. Это предполагэет извлечение клеток на сухое вещество на стадии начальной концентрации. Лизоцин добавляют в клеточную пасту после центрифугирования всей целой разводки и перед добавлением какого-либо спирта к клеточной пасте. После добавления лизоцима добавляют 2-пропанол для получения концентрации по весу. Первоначальное добавление 2-пр панола рассчитывается на основе веса клеточной пасты минус 8% на нерастворимые вещества (на сухой вес и свойства подаваемого спирта. В четырех загрузках осаждение про изводят периодически с использование питающего чана для отстойника. Освет ленные фильтраты периодически помещают в чан (в каждом орыте) объемом примерно 170 галлонов (бЗЗ,5 л). К этому добавляют 1,0 М раствор МдЗОл при дозировке 0,05 галлона (0,189 л на галлон (3,785 л) осветленного лизата и объем азеотропического 2-про1416 панола для поддержания общего уровня пропанола примерно 2% по весу. Во время добавления растворы перемеши- ,1 вают и .рециркулируют питательным насосом для облегчения перемешивания. Осажденный энзим выдерживают в течение 10-15 мин, чтобы дать ему агломерироваться в крупные хлопья, а за--. тем извлекают центрифугированием с использованием центрифуги Де Лаваль БРПХ-207. Раствор подают на центрифугу при расходе подачи 6-10 г/мин. В одной загрузке (загрузка If 10) осаждение проводят непрерывно с использованием питательного чана в качестве реактора с непрерывным перемешиванием. Осветленный лизат и раствор MgSO непрерывно подают дозой в питатель через смесительный тройник. Концентрацию 2-пропанола осветленного лизата доводят до по весу для компенсации при растворений раствором MgSOi,T.e. поддерживая во время осаждения содержание спирта ii1l. Поток осветленного лизата регулируют с помощью регулятора расхода. 1 М ра-, створ MgSO подают при расходе подачи 0,05 галлона (0,189 л) на галлон (3,785 л) осветленного лизата с использованием для этого небольшого диафрагменного насоса. Осуществляют перекачку обоих растворов и в питательном чане создают нужный уровень. После окончания центрифугированиясоответствующих загрузок остаточный энзим удаляют с поверхности центрифуги дистиллированной водой и смешивают с продуктом стабилизированным концентратом энзима. Каждую из извлеченных загрузок стабилизированного концентрата энзима перемешивают до гомогенной, разливают в бутылки и хранят при С. В табл. 3 и 1 приводятся данные об эффективности извлечения энзима на каждой стадии процесса. В табл. приводится анализ стабилизированных концентратов энзима. П р и М е р 3 Загрузку энзима внутриклеточной изомеразыглюкозы, полученного из Streptomyces о1 ivoch- romogenes АТСС К 21715. приготавливают по примеру 1(Л) с использованием 1-литрового, Й-литрового, 50-галонного (189 литрового и 1000галонного (3785-литрового) ферментаторов для высевки и развития посева и 20000-галлонного (75708-литрового| ферментатора лля окончательной стадии выращивания. После завершения ферментации разводку в 20000-галон ном 75708-литровом) ферментаторе охлаждают до . Ее выдерживают без продувания воздухом и перемеши вания в течение коротких периодов времени перед концентрацией клеточ ных твердых частиц. Конечная разводка (16000 галлонов или 60565 л) имеет активность 21,0;МЕИГ грамм разводки)максимальный выход по сухим клеткам 16,5 г/л и общую.активность 1270,. Всю разводку, содержащую внутриклеточную изомеразу глюкозы, концентрируют центрифугированием на центрифуге Де Лаваль БРПХ-207 для концентрирования клеточных твер дых частиц при рабочем расходе подачи примерно 5,0 галлонов I 19 я ) в минуту при коротком времени выбрасывания 1,75 мин. Легкофазный переливающийся продукт периодически анализируют и выбрасывают. Выбросы тяжёлофазной клеточной пасты собирают в приемном бачке, а затем непрерывно перекачивают в один из трех чанов, которые используют для дегидрирования, Стадия концентрирования дает в результате примерно 6,-кратную концентрацию клеточных твердых частиц (в расчете на объем) Общее количество извлеченной клеточ ной пасты 2500 галлонов (,3 л) весом 20709 фунтов (9393 и кг) при общем весе сухого вещества фун (1102,6 кп). Анализ клеточной пасты показывает наличие 289 фунтов (131,09кг) золы, фунта 6 9,99 протеина, 18278 фунтов (8290,76 кг) воды,.активность 132 МЕИГ/г и общую активность 12АО, МЕИГ (98 от общей активности). Когда объем клеточной пасты в ва рочном чане достигает 200 галлонов (757 л) производят добавление в шла 200-230 галлонов (757-870,6 л) 91,5 -ного 2-пропанола до заполнения варочно.го аппарата. После каждого добавления спирта проверяют рН получаемого шлама в соответствующем варочном аппарате и доводят до 7,0-7,2 при необходимости с помощью безводного первичного кислотного фосфата натрия. После первоначального добавления спирта в соответствующие чаны производят добавление в возрастающих количествах энзима лизоцима по всему балансу пе-, риода заполнения при дозировке примерно 6,8 ед/мг клеток (на сухое вещество) . Использовавшийся лизоцим представляет собой 2-х кристаллический высушенный замораживанием порошок, изготовляемый компанией Майлс-Сирэйвэк из яичного белка с указанной активностью 23000 единиц лизоцима на миллиграмм препарата энзима . После того, как каждый чан заполнен , производят окончательное регулирование для доведения концентрации спирта в шламе до по весу. Лизат (шлам, состоящий из спирта, клеточной пасты и лизоцима постоянно перемешивают и рециркулируют через наружные теплообменники для поддержания нужной температуры. В межтрубную зону теплообменников подают охлажденную воду для поддержания температуры Лизата в пределах 28-30 С. Степень растворимости энзима проверяют сравнительным анализом энзима всего образца лизата и части того же образца, из которого центрифугированием удаляют клеточные твердые частицы. Когда дигерирование данного аппарата достигает примерно 100% сольватации, шлам лизата легко осветлить для удаления остатков клетбк. Время дигерирования составляет примерно 52-73 «. считая со стадии заполнения. Весь шлам лизата из трех варочных аппаратов имеет общий объем 5138 галлонов(199,9 л; вес 39590 фунтов (17957,72 кг) и общее количество сухого вещества фунтов (1019,2 кг). Анализ шлама лизата показал наличие фунтов(187,78 кг) золы, Й31 фунта (,09 кг) протеина, 15920 кг (7221,2 кг) 2-пропанола и 19717.3 кг) воды. Лизат имеет единичную активность 66,6 МЕИГ/г и общую активность 1178, что составляет 93% первоначальной общей активности разводки ферментации. Шлам лизата осветляют с помощью фильтра с предварительно нанесенным слоем фильтрующего материала Дайкэлайт Спидфлоу (производимый компанией Грефко Инкорп толщиной 2,252j5 дюйма. Для осветления шлама лизата используют в целом 600 фунтов (272,16 кг I фильтрующего материала. В шлам для предварительного слоя добавляют 50-ный раствор 2-пропанола при концентрации 5%. Для сохранения свежего раствора для нанесения пред варительного слоя, когда предварите ный слой нанесен, нижнюю «jiactb пред варительного слоя по капле сливают обратно в резервуар для свежего материала для предварительного слоя. Немедленно после слива нижней части предварительного слоя дигерированный шлам лизата направляют на фильт Скорость фильтрации для стадии осветления изменяется от 2,6 галлонов фут до 3,9 галлонов/ч-фут(9,8 л/4 0, 093 ,76 л/ч -0,093 средней скорости пропускания материала 2,9 галлона/ч-фут (10,97 /Ч 0,093 м). После фильтрации осветленный фильтрат перекачивают в 1000-галлонные (,3785-литровые) хранилищные емкости. Вырезки фильтровальной Лепешкой из фильтра периодически подвергают анализу и выбрасывают . Вес лизат имеет объем ,638 галлона (17556,7 л), вес 35716 фунтов (16200,5 кг) при общем весе сухого вещества 77 фунта (351,об кг). Анализ осветленного лизата показал наличие 106 фунтов (48,08 кг)золы, Л92 фунта(223,17 кг протеина, 15798 фунтов (7165,9 кг) 2-пропанола и 19122 фунта (8673,59 воды. Единичная активность осветлеиного лизата 5,0 MEИГ/г, а об«ая активность 875,7x10 МЕИГ, что составляет 69 первоначальной актив ности из ферментационной разводки. После ctaдии осветления концент- рацию осветленного лизата в отдельных чанах увеличивают до по весу (определялась по удельному вес перед обработкой по всем стадиям осаждения ,и стабилизации). Осаждение и стабилизация энзима изомеразы глюкозы в растворе осветленного лизата осуществляется непрерывной дозированной подачей осветленного лизата и 2,2 Н раствором HgS04 и 9 1 фунта (426,6 кг) воды через сме сительный тройник (Т) в питающий чаи который соединен с центрифугой Де Лаваль БРПХ-207. 2,0 М раствор сульфата магния добавляют при расхо де подачи 0,025 галлона на галлон (0,0946 л на 3,785 л) осветленного лизата для обеспечения конечного раствора с 0,05 М концентрацией MgSO-. Пускают поток раствора HgSQ, раствора осветленного лизата и в питающем чане создают нужный уровень. Чан заполняют до объема, который при данных расходах подачи дал время пребывания в 15 мин.Затем смесь подают на центрифугу при расходе эквивалентном расходу подачи в питающий чан. Расход подачи на центрифугу регулируют таким образом, чтобы поддерживать уровень постоянным (и время пребывания также постоянным т.е. примерно 15 мин) в питающем чане Перетекающий из центрифуги продукт направляют на 8000-галлонный (30283-литровый) резервуар и дополнительно обрабатывают для извлечения 2-пропанола;для Повторного использования. Стабилизированный концентрат энзима собирают в 20-галлонных (75,7-литровых) емкостях из нержавеющей стали, а затем смешивают в 100галлонной (379-литровой) емкости с перемешиванием. Стабилизированный концентрат энзима имеет средне-коричневый цвет. Производят периодичес.кое добавление воды для стабилизации Концентрата энзима и для обеспечения повторной растворимости энзима, если это требуется (повторная растворимость определяется визуально). Когда добавляется дистиллированная вода и стабилизированный концентрат энзима растворяется, цвет его переходит в относительно светлый кофейный цвет и его консистенция соответствует консистенции светлого нефтепродукта. Извлеченный стабилизированный (в Повторно растворимой форме) концентрат энзима имеет объем. 73 галлона (276,3 л), вес 634-фунта 4287,57 кг и сухого вещества 1б9 фунтов (76,66кг) Анализ стабилизированного концентрата энзима показал наличие 19 фунтов (8,6 кг) золы, 126 фунтов (57,15 кг) протеина, 104 фунта (47,17 кг) 2-пропаиола и ЗбО фунтов (163,29 к.г) воды. Стабилизированный концентрат энзима Имеет единичную активность 11,654 МЕИГ/г (на сухое вещество и общую активность 892,8x10 МЕИГ/г, что представляет 70,3 выхода извлечения общей активности всей клеточной разводки, использовавшейся в ка честве исходного материала при максимуме потерь (23-24%), происходящих на осветления лизата. Из этого количества около половины (примерно 11,) может быть отнесено 21 на вырезки фильтровальной лепе ки. В табл. 5 (загрузка И) привед ны сведения об эффективностях изв чения энзима на всех стадиях обра ки. В табл. 6 приводятся результа анализа стабилизированного концен рата энзима. Пример k. Несколько образ цов извлеченных стабилизированных концентратов энзима изомеразы глю козы по примерам 1-3 и другие подобные образцы подвергают испытаниям для определения их стабильности при хранении при различных пературах. Образцы хранит при , 26 и и анализируют на изомера з но глюкоз ную активность с интер лами в kfB и 12 месяцев. Ниже приведен анализ стабилизи рованного концентрата энзима изом разы глюкозызагрузки WW 11-336 Йзомеразная активность, МЕИГ/г, сухой 1165 Удельная активность, МЕИГ/мг, протеин Сухое вещееTBo,t 26,6 Влажность(Карл Фишер Д56,9 Протеин, КьельдальД : сухое вещество Зольная окись, % сухое вещество Нерастворимое сухое вещеетво,%,.сухой вес0,53 Мд, мг/мл5,99 Мд, молярный 0,25 М 5протеин, COOT- Q QJ2 ношение 2-пропанолД (по разнице) 16,5 Конечный вес извлеченного энзима, кг на сухое вещество 28,58 Данные, приведенные в табл.6,у зывают на то, что стабилизированн концентраты энзима могут сохранят более чем 80±10% (и обычно больше чем 90-10 ;) своей перв1оначальной изомёразной активности до 2 мес хранении при и 18 С и способны ц ранять до 80±10| своей первонамаль ной изомёразной активности до 8 мес при хранении при , т.е. стабилизированные концентраты энзима проявляют в среднем менее чем 5 потерь перврначальной изомёразной активности при хранении при C в течение 12 мес, среднюю величину потери менее чем примерно 15% своей первоначальной активности при хранении в течение 12 мес при 18 и . Примерз. 17-галлонную ( б, 35-литровая ) загрузку разводки, содержащей внутриклеточную изомеразу глюкозы, приготовленную по примеру 1 (А), разбавляют водой и центрифугируют для получений клеточной пасты. 17-галлонная загрузка разводки взята из двух загрузок 10-галлонного (37,853-литрового) фермеитатрра с активностью 18,0 МЕИГ/мл и 16,8 МЕИГ/мл соответственно. Обе загрузки смешивают для использования при приготовлении клеточной пасты. Полученную при центрифугировании лепешку (клеточная паста ) помещают в 5,5-Литровый бродильный сосуд и разбавляют водой до получения общего объема шлама 4,5 л. Шлам, который хранился при С в течение двух дней обрабатывают 77 мг препарата энзима лизоцима (полученного из яичного белка имеющего примерно 8000 лизозимных ед/мг) и 1930 мг 2-пропанола. Шлам перемешивают в течение ч, послечего производят добавление 500 мг препарата энзима лизоцима. Шлам перемешивают в течение ночи с регулированием температуры до 20Jtfc (температура увеличивалась примерно на С после второго добавления лизоцима, которое вызвало некоторую дезактивацию энзима). После дигерирования 500-миллиметровый образец разбавляют 500 мл воды. 123-миллилитровые аликвотHbie доли разбавленного лизата доводят примерно до 50% 2-пропанола (в расчете на объем/объем) путем добавления 2-пропанОла. Одна аликвотная доля лизата используется для контроля. К каждому аликвотному образцу лизата добавляют указанные (в табл.7) количества хлористого натрия (для сравнения) и сульфат гептагидрата магния (MgSO 7НлО). После дoбaвЛJeния соли, суспензии, включа и контрольную центрифугируют и анализируют на изомеразноглюкозную активность и содержание протеина. Приведенные в табл.7 результаты показывают, что добавление соли сул фата магния в лизат спирт - вода приводит к снижению изомеразной активности во всплывающем слое без существенного ум.еньшения содержания нуклеиновой кислоты во всплывающем слое (нуклеиновые кислоты поглощают свет при 2бО нм). Этот эффек не имеет места при добавлении соли хлористого натрия. Следовательно, добавление соли сульфата магния в лизат из спирта и воды вызывает выделение изомеразы глюкозы из растворимых нуклеиновых к)слот. Наблюдавшееся явление очевидно не было типичным эффектом высалива ния, так как уровень сульфата магния был слишком низким, а результат при хлористом магнии был противоположным. Эксперименты с хлористым натрием не вызывали какого-либо су.щественного снижения изомеразной ак тивности во всплывающем слое. П р и м е р 6. Для сбалансирования k,S л сырого лизата (содержащего изомеразу глюкозы с приданной растворимостью) из примера 5 производят добавление вспомогательного фильтрующего материала и достаточно го количества 2-пропанола для того, чтобы превратить шлам в 501 по отношению к 2- пропанолу в объемном от ношении (объем/объем). Шлам медленно профильтровывают до осветления растворенной изомеразы глюкозы. Ана лиз 335-миллилитрового образца филь рата показывает б5,2 МЕИГ/мл (общее 21, МЕИГ). В этот образец добавляют 16,5 мл 2-пропанола и 16,5 мл одномолярного раствора сульфатгептагидрата магния (MgS047H2p} при рН 8. После добавления соли немедленно образуется маслянистый прецип тат. Раствор, содержащий преципитат центрифугируют и преципитат удаляют Преципитат повторно растворяют водой до общего объема 10,5 мл. Этот образец разбавляют водой до общего объема 10,5 мл. Образец paзбaвляюt водой до 4о2 к 1 и светопропускаемость разбавленного раствора при 260 и 280 нм составляет 0,28 и 0,350 соответственно. Анализ раствора показан МЕИГ/мл. Следовательно, его общая активность МЕИГ (98% начальной активности. t2 полученной из.осветленного лизата). Стабилизированный концентрат энзима, изомеразы глюкозы имеет удельную активность 15,3 МЕИГ/мг протеина.. Таким образом сульфат магния селективно осаждает и очищает энзим изомеразы. Пример. б7-миллилитровый образец повторно раствбренного фракционата спирта, содержащего растворенную, не содержащую клеток изомеразы глюкозу, перемешивают с б7 мл раствора 2-пропанола. Не наблюдается никакого преципитата . После этого производят доба1вление 2 мл одномолярного раствора сульфатгептагидрата магния и 2 мл раствора 2-пропанола для осветления водно-спиртового раствора, содержащего изомеразу. Немедленно после этого обр.азовался серо-белый твердый преципитат, который извлекают и растворяют в воде до объема 13,0 мл. Отабилизированный концентрат энзима повторно центрифугируют и разбавляют водой до 101 к 1 для .проведения количественного анализа. Светопропускаемость разбавленного раствора При 260 м и 280 нм 0,288 и 0,437 соответственно. Содержание протеина разбавленного раствора определяют в 0,6 мг/мл. Следовательно, неразбавленный раствор, включающий растворимый, стабилизированный концентрат энзима, со- держит 46,5 мг/мЛ протеина, анализ которого показал МЕИГ/мл и активность 10,А МЕИГ/мг протеина. Общая активность в 13,0 мл стабилизированного концентрата энзима 6,266 МЕИГ. Отцемтрифугированный материал содержит всего 150 МЕИГ. П р и м е р 8. 3250 мл осветленного лизата, содержащего растворенную изомеразу глюкозы, имеющую 109 МЕИГ/мл из первоначальной j,5литровой загрузки, указанной в примере 5, смешивают со 1б2 мл раствора 2-пропанола и 162 мл раствора одномолярного сульфатгептагидрата магния. Немедленно образуется маслянистый осадок, который собирают центрифугированием. Преципитат имеет объем 69 мл.его анализ показал 4, НЕИГ/мл при общей величине 278,760 МЕИГ. Для анализа производят 1-1000-кратное растворение небольшой части стабилизированного концентрата энзима. Его светопропус25кание при 260 и 280 им 0, и 0,3« соответственно. Содержание Протеина 0,299 мг/мя, удельная активность 13,5 МЕИГ/мг протеина. Балансовому количеству стабилизированного концентрата энзима дают отстояться-в течение 48 ч после чего образуется три слоя. Трехслойный шлам центрифугируют и подвергают анализу. 18,2-миллилитровый верхний (липоидный; слой имеет 5б5 МЕИГ/мл, лилитровый средний слой - 1970 МЕИГ/мл и Зб-миллилитровый слой - 50,80 МЕИГ/М Нижний слой обладает наиболее низкой светопропускаемостью при 2бО нм и наиболее высокой при 280 нМ. Верх ний слой имеет наиболее высокую сёе топропускаемость при 260 им. П р и м е р 9. 27,5 галлонную зй грузку разводки, содержащую. 17,5 МЕИГ/МЛ внутриклеточной изомеразы глюкозы, приготовленную по примеру 1 (А), смешивают -с равным к личеством воды и центрифугируют АО образования лепешки. Яепешку смешивают с водой до объёма 2б л при рН 7,5. К этому раствору добавляют 0,250 г лизоцима и И,5 Л 2-пропа нола при 27°С. Добавляют небольшое количество противопенного агента и шлам перемешивают. 37,5-литровая водная суспензия содержит 37 ijif МЕИГ/МЛ. После 20.,5 Ч извлекайт две 8 литровых аликвотных доли, пос ле чего добавляют 2-пропанол в таком количестве, чтобы довести d6ieM до 50% в .объемном соотношении объем на объем). .Производят добавление вспомогательного фильтрующего мате- риала Сил-Фро (3 г/г клеток) к шламмам, которые после этого фильтруют и промыбают 2 л 50%-ного 2-пр6 панола. Анализ фильтрата показал 15 МЕИГ/МЛ. Добавляют при перемешивании дополнительно 1 г яизоцима в 21,5-литровый баланс cbiporo ли зата с получением 2А,3 МЕИГ/мл|СЬДе жащийся в фильтрате энзим Немедленно осаждают в фильтрат с добавлением 1,1 одномолярного раствора сульфата магния и 1,1 Л 2-пропанола. Преципитат, содержащий стабилизированный концентрат энзима, извлекают центрифугированием и растворяют в небольшом количестве воды до получения объема 200мл, имеющих примерно МЕИГ/млили вцеJTOM 690000 ИЕИГ иудельную активность примерно 12,5МЕИГ/МЛ протеина 1i Два образца из 200-миллилитрового стабилизированного концентрата энзима подвергают испытаниям на стабильность при хранении при комнатной температуре (примерно ) с последующим проведением повторного анализа. В начале испытаний на стабильность при хранении оба имеют примерно 3300 МЕИГ/мл. Образцы периодически анализируют и на 31 день хранения образец вместе с добавленным предохранительным средством показал при анализе 3165 МЕИГ/МЛ, а другой образец (без предохраняющего средства) 31О МЕИГ/мл Таким образом, стабилизированные концентраты энзима (с предохраняющими средствами или без него) одинаково стабильны при хранении и способны сохранять до или больше 95 Своей первоначальной активности в течение более 30 дней при хранении при комнатной температуре. Прим е р 10. С1равнительные эксперименты. Цель экспериментов показать эффективность используемых различных водорастворимых солей магния в соответствии с изобретением в сравнении с другими слоями, спосо1 ыми осаждать протеины, такие как сульфат аммония, сульфат нат- , рия и хлористый натрий. В сравнительных экспериментах использбвались Тсмоке и другие двухвалентные соли. Крупный образец (pacteup ИЗ спирта, воды и изонеразы глюкозы/ Из sarpyakH Н 6 (пример 2 и Табл.З)/ центрифугируют на лабораторной центрифуге при скорости вращения iSOOO об/мин в течение 10 мин до использования; Содер)|(ание Спирта-определяют в 4l ,6% по весу или объем/объем). К каждому из нескольких ЗО-циллилитровЫх образцов, осеетленных лизатом (при комнатной температуре), после этого добавляют указанное количества 1 М раствора сол, приведенных в табл.8 вместе с эквивалентнъм объемом 2-пропанола. Лосле добавления сйли и спирта образцы смешивают и затем центрифугируют скорости вращения 18000 об/мин S течение 10 мин. Всплывающие слои удаляют и преципитаты промывают из трубок центрифуги и разбавляют до 25 мл кобальто-фосфатным буфером (1(. Со, рН 7,5) для анализа на изомеразно-глюкозную активность и определение протеина. Эффект различных солеи и концентрации, оказываемый на селективное осаждение и очистку растворимого энзима изомеразы, приведен в табл.8.

Результаты, приведенные в табл.8 показывают, что сульфат натрия и сульфат аммония не осаждает энзима изомеразы глюкозы из лизата так же эффективно и при такой же. низкой концентрации, как соли магния. Сульфат аммония не осаждает никакого энзима, а сульфат натрия обеспечил только извлечение энзима изомеразы глюкозы. Это извлечение не обязательно происходит за смет осаждения и может быть отнесено за счет фазового разделения ( фаза спиртвода и соль - вода). Протеин более растворим в соляно-водяной фазе, чем в фазе спирт - вода. Соляно-водяная фаза не дает специфического экстрагирования протеина из врдо-спиртовой фазы. Так как соляно-водяная фаза более плотная, то она собирается как продукт. Другая испытанная моновалентная соль, хлористый нат- , рий, также не дает осаждения энзима изомеразы глюкозы.

Двухвалентные соли, иные нежели соли магния, дают осажде14иё энзима изомеразы глюкозы, но степени извлечения и чистоты не эквивалентны степеням извлечения и чистоты, полученным при использовании солей магния. Соли бария и стронция дали лучшие , результаты из числа испытанных немагниее1ых солей, но использование этих солей нежелательно в кормах.

Из испытанных солей только соли магния эффективно осаждали энзим с высокой удельной активностью. Использовавшаяся концентрация солей магния представляет собой небольшую часть той, что требовалась для осаждения протеина из водного раствора с использованием обычных способов выщелачивания, т.е. с использованием сульфата аммония и натрия.

Из данных, приведенных в таблице 8, также видно, что при увеличении концентраций сульфата магния (выше 0,08 моль) удельная активность уменьшается, что указывает на более беспорядочное осаждение протеина энзимом изомеразы глюкозы. Наблюдалось что фазовое разделение происходило при использовании сульфата магния. Понижение удельной активности следовало за явным увеличением растворимости протеина в соляно-водяной фазе. При использовании хлористого магния и ацетата магния не происходит никакого разделения фаз и удельные активности остаются постоянными если происходило увеличения, как в случае хлористого магния.

Иммобилизация растворимой изомеразы глюкозы.

П р и м е р 11. В данном примере показано, что очищенный и стабилизированный концентрат энзима способен прО1 зводить иммобилизированную

5 изомеразу глюкозы с более высокой связующей способностью, чем известная изомераза.

Известный препарат изомера.зы глюкозы приготавливают из внутриклеточной изомеразы глюкозы, содержащей целые клетки, приготовленной способом по примеру 1(АЛ С тем, чтобы способствовать извлечению целых клеток, в разводку добавляют вспомогательный фильтрующий материал Sil-Flo и Ид{ОН),2 и смесь затем промывают 2-пропанолом, высушивают и измельчают на мельнице Уилея. Во время экстрагирования изомеразы

Q глюког ы из клеток смесь, содержа- , щую клетки, обрабатывают MgSO в количестве, достаточном для превращения шлама в 0,01 М относительно соли магния, а рН доводят до 8,0 с помощью 0,1 MI гидроокиси ка ЛИЯ (КОН). Сырой энзим изомеразы глюкозы экстрагируют из 6,5-граимового образца (как основы)препарата сухих клеток с помощью 50 мл экстрагирующего агента. Смесь перемешивают в течение k мин при комнатной температуре, а затем центрифугируют при . Получают экстракт, содержащий 2б-27 МЕИГ/мл. Раствор энзима изомеразы глюкозы, полученный этим способом и стабилизированный концентрат энзима, приготовленный в .соответствий с примером ifB/, сорбируют на разнообразных водонерастворимых носителях с использованием следующей методики.

В 150-миллилитровом химическом стакане 2 г (на сухое вещество) во донерастворимого носителя смешивают с 30 мл раствора, содержащего 0,1 М 55MgSQ 7H20 и рН доводят до 8,0 с помощью КОН. В эту смесь добавляют достаточное количество жидкой изомеразы (или изомеразы с нормально приданной растворимостью или кон- центрат нзима соответственно настоящему изобретению) для контактиро- , вания носителя с .1,000-3,000 МЕИГ изомеразы (в зависимости от емкости .носителя. После этого добавляют дополнительно 0,01 М раствор MgSOi для обеспечения получения жидкого объема 50 мл. Затем смесь, содержащую энзим и водонерастворимый носитель, тщательно пepeмeшивaюt в течение 30 минуфильтруют и промывают 0,01 М раствором . Смешанные фильтрат и жидкости помещают в 250-миллилитровую мерную колбу, разбавляют до нужного объема с помощью 0,01 М раствора MgS04УН О и снова производят анализ первоначального растворимого препарата энзима изомеразы на изомеразную активность с использованием анализатора Текнищэл Ото Эмэлизер (Techlcian Auto Analyzer) Связующая способ ность(.СС ) для соответствующих водонерастворимых носителей рассчитана по разнице с использованием следующей формулы СС, МЕИГ/г, сухое вещество - общее наличие МЕИГ - общее МЕИГ в фильтрате и промывках. В табл. 9 представлены результаты этого эксперимента, сравнивается связующая способность при различных носителях с изомеразой глюкозы с нормальной приданной активностью со стабилизированным концентратом энзима соответственно настоящему изобретению.. Данные, приведенные в таблице, пока зывают, что связующая способность ДЭАЭ-целлюлозы примерно в два раза больше для стабилизированного концентрата энзима, чем для энзима с Но мально приданной растворимостью э в случае синтетических анионообменных смол в 2-3 раза больше. Установлено/ что связующая способность ДЭАЭ-целлюлозы для стабилизированного концентрата энзмма увеличивается предва рительной обработкой носителя при более низком уровне рН. Напримерjпри рН 6,5 носитель связывает 3120 МЕИГ/ тогда как необработанный носитель .« .-..|||... . iM..j4-А .4.. связывает только 16,3 МЕИГ/г. При использовании данного стабилизированного концентрата стало возможным связать 10,9 млн МЕИГ/фут (0,028 м) на ДЭАЭ-целлюлозе типа 20. Этот &ио катализатор затем может использовать ся для переработки глюкозы в кукурузиую патоку с высоким содержанием фруктозы непрерывным пропусканием раствора глюкозы через биокатализатор, который может быть размещен в колоннах или в листовых (патронных фильтр-прессовых элементах. Из табл. 9 видно, что максимальная связывающая способность, достигнутая с использованием изомеразы глюкозы с Нормально приданной растворимостью, составляет 93б МЕИГ/г при Селектацеле типа kQ, который обладал обменной способностью 0,89 meg/r имел несколько более низкую связывающую способность, чем тип АО, тип 20 является более практичным для промышленного. использования так как имеет более крупный размер частиц и, следовательно, дает лучшие расходы потока. Пример 12. При проведении этих экспериментов стабилизированный концентрат энзима был иммобилизован на ряде водонерастворимых носителей и испытан на использование в непреРЫВНОЙ энзиматической переработке глюкозы в кукурузную патоку с высоким содержанием фруктозы. Используют колонки, приготовленные путем помещения в основании колонки набивки из стекловаты и частицног 9 заполнения колонки водой. В случае использования водорастворимых носителей в эту колон ку добавляют водорастворимые носители и накрывают набивкой из стекловолокна. Стабилизированный концентрат энзима загрузка 1 пример 1 В) затем медленно пропускают через колонку с последующей промывкой небольшим количеством дистиллированной воды. Промывная вода и выходящие из колонки потоки смешивают и подвергают анализу на изомеразоглюкозную активнс сть. Количество сорбированного энзима определяют по разнице. В случае иммобилизованных целых клеток (продукт примера 1 А, содержащий вспомогательный фильтрующий материал Сил-Флоу) в колонку соответственно добавляют 5 г препарата энзима, содержащего целые клетпато оиоыи oincinufaiiior-n tiAna.fO vnoT ки, со 100 мг Мд(ОН)2 и без таковой. Колонки покрывают сверху набивкой из стекловаты. Непрерывные переработки проводятся посредством непрерывного питания колонок 50 бесцветной как вода повторно растворенной кристаллической декстразой (600 г/л раствора) , содержащей О,,0055 сульфат магния при рН Р.,,6. В случае необходимости эти колонки уравновешивают, и непрерывная энзомеризация проводится при 60 С перекачкой воды при через рубашку колонны. Поток питания через колонку поддерживают сочетанием вакуума в основании колонки и газообразным азотом в питании. Расход потока регулируют изменением давления газа в питании. Кажущаяся энзимная активность (КЗ) определяется с помощью уравненияКЭ-ЬУНес Г eogr°/ e .1 , L%Le-%LJ, где BVH - скорость расхода в колон ке в объемистости слоя/ч, % Le величина равновесия декстроза-фруктоза, которая при 60 С составлг ёт 51,2; % L % кетозы в выходящих потоках колонки. Объёмы слоя/ч при левулозыу ВУН,,916. Тюлупериод, т.е. время, требуемое для уменьшения до половины ка)}(ущейся активности колонки, определяется отбором образцов в течение двух или более недель работы колонк и измерением КЗ. Полупериод определяется по крутизне линии, определяемой методом наименьших квадратов, на графике д КЗ относительно времени. При этом методе, предполагаетс что скорость распада энзима первого порядка. Начальные объемы слоя/ч при 5 кетозы, BVH определалась по пересечению линии наименьших квадратов. Зффективность определялась с помощью уравнения; Зфф. .МЕИГ/фут. Результаты этих непрерывных пере работок с использованием различных препаратов иммобилизованного энзима глюкозоизомеразы представлены в табгиЮ. Приведенные в табл, 10 данные по- казывают, что стабилизированный концентрат энзима молет быть эффективно С9рбирован на многих водонерастворимых носителях и может использоваться для непрерывной переработки глюкозы в кукурузную патоку с высоким содержанием фруктозы. Наилучшим использованием энзима было сорбирование стабилизированного концентрата энзима на носителе из регулируемой пористой окиси алюминия. Высокая степень использования энзима является результатом высокой эффективности и длительного полупериода. , Носители из основного карбоната магния и синтетической анионорбмен- ной смолы, Амберлит IRA-90, в сочетании со стабилизированным концентратом энзима также дали хорошие результаты при экспериментах по непрерывной переработке. Описанная выше процедура в отношении носителя из регулируемой пористой окиси алюминия была повторена с использованием стабилизированного концентрата энзима по примеру 3. В табл.11 приводятся данные по влиянию энзимной нагрузки на непрерывную переработку (носитель из регулируемой простой окиси алюминия содержал 97-98 2-2,i MgO с площадью поверхности 780 ). Стабилизированный концентрат энзима эффективно сорбируется на носителе из регулируемой пористой окиси алюминия для обеспечения биокатализатора, который может быть использован для непрерывной переработки глюкозы в кукурузные патоки с высоким содержанием фруктозы. Высокие связующие эффективности и длительные полупериоды делают этот катализатор пригодным для использования в промышленном масштабе. Т а б л и ц а 1

1, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ГЛОКОЗОИЗОМЕРАЗЫ, предусматривающий обработку биомассы продуцента лизоцимом, отделение бесклеточного экстракта и выделение из него .фермента осаждением, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, а также повышения активности и стабильности преп%рата, в качестве продуцента используют Streptofflyces о1Ivochromogenes АТСС ff 21713, АТСС Jf 21715, биомассу продуцента предварительно обрабатывают водным раствором 2-пропанола при концентрации последнего в смеси 1-43 мас., лизоцим используют в количестве 6,8 ед/мг сухого веса клеток , а осаждение фермента осуществляют сульфатом (нагния, взятым в количестве 0,02-0,3 Н на общий объем смеси. 2. Способ по П.1, о т л и ч а ющ и И ся тем, что концентрацию 2-пропанола на всех стадиях процесса поддерживают постоянной и равной мас..

кукурузной патоки

33 Сульфат магния 7Н/О Пеноудалитель, НОДАС 200 (ПолипропиленгликольЖидкость для замочки 2-я стадия кукурузы, Код Е801 (И Литровый лабораторный ферменIS ДЕ. Твердые вецест татор кукурузной патоки

Сульфат магния

Пеноудалитель, НОДАС

200 (Полипропиленгликол)

Жидкость для замочки кукурузы. Код Е801 поКрахмал, Код 3005 Сульфат магния 7Hjl)

Пеноудалитель, НОДАС ,

200 Полипропиленгликоль) - (51 мл) - Жидкость для замочки кукурузы, Код JEBOI ый

Декстроза, Код 2001 Сульфат магния 7НjO

Пеноудалитель, НОДАС 200(Полипропиленгликоль).

3

(

Продолжение табл. 1

0,05С,5 г)

-(1.3 мл) (З кг)lO галлонов

0.05(75.7$г) ,(108,86 кг).0(60.33 кг)(1,«97 кг)г.

-(1л) 0.05 (0,7г) (0,07 мг) ,6 (271 г) 9л 2,0 (180 г)

35

Пеноудалитель, HOflAC 200 (Полипропиленгликоль)

Бикарбонат натрия Добавляется 180,00 галлонов

Непрерывное осаждение

««

Ислольауют фильтруоций материал Дайкэлайт- 200 «« Испольаувт материал Дайкелайт Спидфпоу.

36

lOZiOIi Продолжение табл. 2

20,82-22,71 л

Табли-ча 3 до стерилизации для доведения рН до 5,8-6,0. Конечный объем (68137, п). Рабочая температура .

Э7

Конечный вес извлеченного стабилизированного концентрата энзима ,м, сухое вещество

Вся ферментационная разводка

Клеточная паста Сырой лизат

58

102tOt

. .Таблица f

2li6 9 12939

1270,7 X 10

1240,0 X 10 1178,9 X 10

39

Стабилизированный концент287,58 рат энзима

Представляет величины, полученные по разнкце или оценочные.

Величина дается на сухое вещество. Общая активность осветленного лизата определялась оценкой веса осветленного лизата и измерением изомеразной активности в нем. Очевидно, что действительный общий вес выше, чем оценочная величина, так как количество извлеченного стабилизированного концентрата энзима было больше, чем определенное для осветленного лизата.

Это первоначальная величина анализа начале этого исследования на стабильность но не первоначальная величина анализа на основе последующих приготовлений Энзима, р чем укаэ.ывалось в предыдущих примерах.

0

, Продолжение табл. 5

1165 -892,8 X 10

Таблица 6

Величина рН в этих испытаниях относительно HMSkafl, что можно отнести за счет низкой изомеразной активности. Однако недостаточно низкая, чтобы отнести ее за счет почти полной потери изомеразной активности во всплывающем слое при 2 0-граммовом уровне сульфата магния. Полагается, что увеличение температуры до 35-40 С после второго добавления лизоцима было

в значительной части причиной дезактивации энзимной активности в этом эксперименте. Соли магния MgSdv Удельная ак тивность Mgei,j . ) Удельная ак тивность Одновалентные катионныё сили

%

Удельная активность

Таблица 7

Таблица 8

16

2,6 8,4 100 95 15,8 13,6 11,0 103103105 15,6 16,4 16,9

(

Соответствующие молярные концентрации суть 0,01; 0,025; 0, 0,08 и О,И.Jj, Ni

Протеин при удельной активности, определенной по светоиспусканию

при 280/260 нм и указанной в МЕИГ/мг протеина

kk

Продолжение табл. 8

Таблица 9

««s

Пористая окись алюминия с регулируемым

Пористую окись алюминия помещают в колонку 3,0x18 см с рубашкой, заполненной сначала 3 мм стеклянных шариков, нак| |вают сеткой с мелкими отверстиями, частично заполняют 0,1 М раствором ацетата магния, добавляют 55,6 г носителя, после чего колонку подвергают обратной промывке б7 М ацетата магния для флюидизации слоя. Сетку с мелкими отверстиями помещают на носителе и покрывают сверху стеклянными шариками. Затем в колонку подают (ОЬОО-(6000 МЕИГ стабилизированного концентрата энзима и колонку промывают раствором ацетата магния.

1021(0 и

Продолжение табл. 9 N нормальная растворимая изомераза глюкозы Буферный раствор, содержащий 0,05 М (рН 7t7) М Mc S04H4.0 и 0,0001 И Со/Сf«. bHjiO. 7) буфер из фосфата калия, Таблица 10

Таблица П